陳璐瑤，吳鈞堅，龔琳，趙靖悅，陳由強，何文錦

（1.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院海洋生物醫(yī)藥與制品產(chǎn)業(yè)化開發(fā)技術(shù)公共服務(wù)平臺，福建 福州 350117； 2.福建師范大學(xué)南方海洋研究院福建省微藻種質(zhì)改良工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350117）

機體組織是由許多功能和形態(tài)不同的細胞構(gòu)成，其中形態(tài)功能相同的細胞相互粘附在一起，并且這些細胞各自又與周圍的其他細胞或其他組分相互粘附，但這些細胞或組織都有各自的特異性。即細胞之間存在異質(zhì)性，即使表型相同，細胞的遺傳信息也可能具有顯著差異[1]。不論植物、動物，它們都有著復(fù)雜的組織結(jié)構(gòu)，以前，分子水平的研究只能通過解剖鏡或其他手段分離出植物或動物的某個組織，但不能精確到某類細胞。為了分析研究不同組織和細胞間的異質(zhì)性，就需要將不同類型的細胞分離出來，然而，由于常規(guī)分離單個細胞或單個細胞群難度大，而且在這個過程中容易被污染，所以一直無法成功分離。

隨著技術(shù)的進步，出現(xiàn)了三種分離目標(biāo)單一細胞類型的方法，即：體外細胞系培養(yǎng)、免疫磁珠分選和顯微切割[2,3]，相對于其他兩種方法，顯微切割技術(shù)（LCM）可以更深入地了解基因表達情況，因此更被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)水平上的研究。LCM的出現(xiàn)很快解決了細胞異質(zhì)性的問題，它可以在顯微鏡下直接確定并且分離出目標(biāo)細胞。目前，顯微切割技術(shù)在單一性以及準(zhǔn)確性、保護其他分子等方面已經(jīng)有了很大的改善，因此，該技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域單細胞捕獲以及下游研究中是一個不可或缺的手段。憑借強大的技術(shù)和適當(dāng)?shù)膽?yīng)用，該技術(shù)從自然組織棲息地中生長的細胞提供了前所未有的細胞生物學(xué)見解。

本文就LCM的發(fā)展歷程以及在生物學(xué)方面的應(yīng)用進行了綜述，并且對現(xiàn)存的問題以及發(fā)展進行討論。

1 激光捕獲顯微切割技術(shù)

激光捕獲顯微切割（Laser capture microdissection，LCM） ，是利用顯微鏡直接從冰凍或石蠟包埋切片中確定、分離獲取目標(biāo)細胞的技術(shù)[4]。激光顯微切割整體系統(tǒng)除了常見的LCM外，還有激光顯微切割及壓力彈射（LMPC）。兩者結(jié)合成功解決了細胞之間存在差異的問題，因其具有迅速、準(zhǔn)確、簡易、特異性強等優(yōu)點，逐漸成為生物學(xué)領(lǐng)域中分子水平上研究的一個關(guān)鍵工具。

LCM基本原理是通過低能紅外激光脈沖激活熱塑膜——乙烯乙酸乙烯酯膜（ethylene vinylacetate，EVA），利用顯微鏡直視，然后有選擇地將目標(biāo)細胞粘到該膜上[5]。

2 發(fā)展歷程

顯微切割的發(fā)展經(jīng)歷手工顯微切割、機械輔助顯微切割、液壓控制顯微切割和激光捕獲顯微切割4個階段[5]。LCM是目前最常用的自動化程度最高的新興設(shè)備，它可以精確分離出目標(biāo)樣品，然后對其進行更深入的研究。

早期，人們采用手工顯微切割，該方法不僅耗時，而且操作復(fù)雜，更重要的是在此過程中造成樣品污染[6]。初期的LCM，它是利用發(fā)射出來的激光直接將非目標(biāo)細胞或細胞群灼燒，留下所需的組織，但該技術(shù)仍然不夠成熟，比如無法確定所需細胞是否純凈，獲得的目標(biāo)細胞可能混入其他的組織。1996年，美國國立衛(wèi)生院（National Institute of Health，NIH）國家腫瘤研究所的Michael等開發(fā)出激光捕獲顯微切割技術(shù)[7]。之后，美國Arcturus Engineering公司研制出LCM系統(tǒng)，并進行商品化的銷售[8]。應(yīng)用該技術(shù)可以解決之前細胞不純凈的問題，通過顯微鏡直接快速準(zhǔn)確地獲取單一的目標(biāo)細胞群或細胞。近年來，LCM快速發(fā)展，以其迅速、準(zhǔn)確、自動化、靈活性等優(yōu)點廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域，尤其是需要研究的細胞很難從樣本細胞中單一純凈地分離時，或細胞分布不均勻呈現(xiàn)散狀時，顯微切割技術(shù)顯得尤為重要[9]。

3 激光顯微捕獲切割技術(shù)的應(yīng)用

3.1 在腫瘤方面的應(yīng)用

LCM與之前的顯微切割技術(shù)相比較，已經(jīng)有了突破性進展，是目前最廣泛的分離純化組織和細胞的新興技術(shù)。最初LCM的出現(xiàn)解決了細胞異質(zhì)性的問題，是生物科學(xué)領(lǐng)域分子水平等方面的一大里程碑。目前LCM已廣泛應(yīng)用于腫瘤方面的研究，與測序技術(shù)、PCR技術(shù)、cDNA微陣列技術(shù)、基因表達系列分析（SAGE）生物標(biāo)記、定量蛋白質(zhì)組等技術(shù)相結(jié)合，現(xiàn)已應(yīng)用于肺癌、乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、淋巴瘤、卵巢癌等的研究[11]?？蒲腥藛T可以借用LCM精確分離捕獲單細胞的優(yōu)勢對病況的分子譜進行分析，然后進一步的探究特定細胞群的遺傳學(xué)、解剖學(xué)特征以及相應(yīng)的功能。利用LCM我們可以整理正常細胞群、癌前細胞群和惡性細胞群之間的遺傳、表觀遺傳學(xué)和基因表達差異，將腫瘤易感基因篩選出來，然后對腫瘤的發(fā)生以及發(fā)展進行分析，最后揭示它的發(fā)病機制、發(fā)展進程等，它對特定細胞群的選擇性有望大大改善許多人類疾病的診斷和管理[10,11]。

3.1.1 LCM結(jié)合腫瘤的基因組學(xué)分析

20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的LCM技術(shù)能夠快速精確地從復(fù)雜組織中分離出單細胞或細胞群，利用這些優(yōu)點可以捕獲腫瘤細胞，它不會改變組織的特性，獲得單一的腫瘤細胞基因組進行突變檢測，基本消除了其他組分對癌細胞基因組的污染，排除了因選用樣品引起的誤差[12]。

楊祎[13]等利用激光顯微切割技術(shù)分離了一些胃癌細胞，結(jié)合全基因組放大技術(shù)將其基因組放大，然后進行與胃癌有關(guān)的前列腺干細胞抗原基因（PSCA）rs2976392與rs2294008位點的單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析。研究結(jié)果表明，全基因組放大技術(shù)保真性較高，分離出來的癌細胞中SNP的靈敏度和準(zhǔn)確性大大的提高。

在2010年，Navin等通過他們稱為 SPP（Sector-Ploidy-Profiling）的方法[14]，進行乳腺癌腫瘤細胞起源的研究。首先利用顯微切割獲取少量乳腺癌組織，再通過流式分選（Ploidy），進而通過比較基因組雜交技術(shù)（comparative genomic hybridization，CGH）分析基因組染色體擴增/缺失。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有些是單克隆起源，而有些是多克隆起源的[15]。

俞莎莎[16]等通過全外顯子測序來對某一肺癌患者的腫瘤和相應(yīng)癌旁組織測序，然后利用COSMIC腫瘤數(shù)據(jù)庫比較分析，找出可能的致病基因，并通過LCM提取5個不同部位的腫瘤細胞，初步探索其起源和演化，再利用巢式PCR擴增技術(shù)以及一代測序來驗證基因分型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這例肺癌患者的7個高頻突變基因分別是LPHN2、TP53、MYH2、TGM2、C10orf137、MS4A3 和 EP300，這些基因它們的基因分型不同。

3.1.2 LCM結(jié)合腫瘤的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

RNA為基因表達產(chǎn)物，RNA水平的分析包括RT-PCR、cDNA微陣列等其他技術(shù)，這些分析過程需要較完整的RNA作為實驗材料，利用LCM獲取單一細胞，RNA分析能夠更準(zhǔn)確地了解基因表達情況。

從復(fù)雜的生物組織（如大腦）獲得高質(zhì)量的RNA是建立高保真細胞類型特異性轉(zhuǎn)錄組所必需的。通常，將基因標(biāo)記技術(shù)與LCM結(jié)合起來就足夠了，但對RNA降解和產(chǎn)量有限的擔(dān)憂使許多測序研究產(chǎn)生了疑問。Farris Shannon[17]描述了從新鮮冷凍組織激光捕獲高質(zhì)量的RNA，然后為其確定合適的RNA-Seq文庫生成方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)消化時間和溫度最小化時，可以從薄層組織的激光捕獲材料中分離出足夠濃度的高質(zhì)量RNA（RNA完整性指數(shù)，RIN＞9）。而且發(fā)現(xiàn)通過cDNA文庫生成保留核糖體RNA的文庫生成方法所需的PCR周期更少，從而最大程度地減少了所得文庫中的偏倚。最后測序前rRNA的終末消耗會增加靶RNA的含量，從而增加讀取深度和基因檢測水平，同時降低測序成本。

吳瑩[18]等利用LCM分離出61例不同個體結(jié)腸組織中的上皮細胞（24例正常組織，13例腺瘤，24例癌組織），與microRNA芯片技術(shù)相互結(jié)合檢測在腫瘤細胞中特異表達的microRNA，分析相同組織microRNA 表達情況的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明了LCM與Agilent microRNA 芯片技術(shù)相結(jié)合的實驗穩(wěn)定性。最后，采用定量RT-PCR、LCM、Agilent microRNA芯片技術(shù)結(jié)合驗證了LCM+Agilent microRNA 芯片實驗的靈敏性以及穩(wěn)定性，在科研、臨床診斷方面將有很大的應(yīng)用價值。

Xue Ruidong[19]對133種合并的肝細胞和肝內(nèi)膽管癌（cHCC-ICC）病例進行了基因組和轉(zhuǎn)錄組測序，包括單獨、合并和混合的亞型，結(jié)合LCM、癌細胞分?jǐn)?shù)分析和單核測序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)cHCC-ICCs有大量的Nestin表達，這說明Nestin可以作為診斷肝內(nèi)膽管癌的生物標(biāo)記，也為肝內(nèi)膽管癌提供了重要的診斷意見。

3.1.3 LCM結(jié)合腫瘤的蛋白質(zhì)組學(xué)分析

隨著人類基因組計劃的實施和快速發(fā)展，生物學(xué)研究已經(jīng)進入后基因組的水平，即蛋白質(zhì)組學(xué)（Proteomics），它已經(jīng)成為研究的核心內(nèi)容之一。對臨床病例研究，找到標(biāo)志物是蛋白質(zhì)組學(xué)分析的一個重要方向。

徐學(xué)清[20]等利用LCM和質(zhì)譜方法聯(lián)合研究乳腺癌上皮細胞和間質(zhì)間蛋白表達的差異，結(jié)果共檢測到431種蛋白，這些差異表達蛋白可以是疾病的篩選、診斷和預(yù)后判斷的蛋白標(biāo)志。李國慶[21]等采用LCM和同位素標(biāo)記聯(lián)合的方法捕獲結(jié)腸組織（正常的和患有結(jié)腸癌的），對蛋白進行相對和絕對定量（iTRAQ），接著利用強陽離子柱分離和反相液質(zhì)聯(lián)用（2D-LC-MS/MS）對差異表達的蛋白進行鑒定，最后采用Western blotting及免疫組織化學(xué)技術(shù)（IHC）證實定量蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的可靠性。研究表明，蛋白質(zhì)的差異表達與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)系，而且有可能會作為是否發(fā)生結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物，為結(jié)腸癌的診斷提供新線索。

3.2 在其他疾病診斷方面的應(yīng)用

LCM成功解決了細胞之間異質(zhì)性問題，除了被廣泛應(yīng)用于多種腫瘤病理學(xué)研究外，在其他疾病的病理診斷中發(fā)揮著很大作用，并表現(xiàn)出良好的應(yīng)用價值。

3.2.1 LCM應(yīng)用于阿爾茨海默病的診斷

阿爾茨海默?。ˋD）是一種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，通常該病多發(fā)于70歲以上的人群并有年輕化發(fā)展的趨勢。隨著科技的發(fā)展，LCM技術(shù)逐漸在該疾病的診斷方面發(fā)揮著重要的作用。

Drummond Eleanor[22]等使用局部蛋白質(zhì)組學(xué)分析快速進展性阿爾茨海默氏病（rpAD）和典型的散發(fā)性阿爾茨海默?。╯AD）中淀粉樣蛋白斑塊中的蛋白質(zhì)差異，對從rpAD和sAD患者顯微切割的淀粉樣蛋白斑進行了無標(biāo)記的定量LC-MS/MS并定量了蛋白質(zhì)表達差異，發(fā)現(xiàn)快速進展性阿爾茨海默氏病斑塊中蛋白質(zhì)的累積差異，表明它可能是阿爾茨海默氏病的一種新型亞型。

3.2.2 LCM應(yīng)用于感染性疾病的診斷

Zhou Ya Bin[23]等首次應(yīng)用LCM和PCR相結(jié)合來確認(rèn)長支原體感染。由LCM獲得的細胞DNA的測序結(jié)果表明與PCR測序結(jié)果相同。盡管存在潛在的弊端，需要收集大量單一細胞耗時久，可能會影響后續(xù)實驗，但基于分子生物學(xué)技術(shù)的LCM技術(shù)還是一種用于判斷“真菌污染物”感染的很有前途的診斷工具。

3.2.3 LCM應(yīng)用于缺血性中風(fēng)疾病的診斷

García-Berrocoso Teresa[24]等獲得了缺血性中風(fēng)患者的死后腦切片，通過激光顯微切割分離梗塞（IC）和對側(cè)（CL）區(qū)域的神經(jīng)元和血腦屏障結(jié)構(gòu)（BBB）作為對照研究，并使用無標(biāo)記定量分析。結(jié)果表明對人腦缺血后神經(jīng)元和BBB的定量蛋白質(zhì)組的分析有助于增加對缺血性中風(fēng)病理學(xué)分子機制的了解，并突出顯示可能代表腦缺血或治療靶點生物標(biāo)志物的新蛋白質(zhì)。

3.3 在植物學(xué)方面的應(yīng)用

1992年，激光顯微切割技術(shù)開始用于植物樣品的制備[25]，近年來，利用該技術(shù)在相關(guān)植物的基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的分析發(fā)展較迅速[26-28]。然而，植物細胞與哺乳動物細胞的質(zhì)地相反，大多數(shù)植物組織的細胞組織具有堅硬的含纖維素的細胞壁，較大的液泡和空隙，因此使組織的制備和大分子（例如DNA）的提取變得復(fù)雜。

3.3.1 LCM結(jié)合植物基因組學(xué)的分析

植物的生長和發(fā)育是由胚細胞不斷進行特異分化，形成不同的組織和器官，若要對某一特別的細胞類群進行基因組學(xué)分析是比較困難的。如今可以利用LCM技術(shù)獲取某一特定的細胞類群，然后進行相關(guān)的分析，同時也成功的解決了分離異質(zhì)細胞的問題。

Rossi Marika[29]等應(yīng)用LCM技術(shù)分析擬南芥特定組織中的細胞支原體基因表達譜。他們的研究表明LCM與擬南芥的結(jié)合使用為探索植物的生物學(xué)、分子和生物信息學(xué)以及闡明這些重要植物病原體感染機制的關(guān)鍵途徑開辟了道路。

3.3.2 關(guān)于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)的分析

目前轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)都在植物各方面研究中大量應(yīng)用。通常轉(zhuǎn)錄組水平的分析有RTPCR、cDNA微陣列等技術(shù)，該研究過程可利用LCM技術(shù)獲取單一且較完整的細胞，這有助于準(zhǔn)確地了解基因表達情況，然后在進行后基因組水平的研究。 Canas Rafael A[30]等從1個月大的海岸松（Pinus pinaster）幼苗中分離了14種不同的組織，并分析了它們的轉(zhuǎn)錄組獲得的不同海岸松組織中基因表達的分布情況，明確了組織基因表達與功能之間的關(guān)系。該轉(zhuǎn)錄組圖譜是針葉樹功能基因組學(xué)研究的寶貴資源。

Yingxin Zhong[31]等對開花后19天的小麥用激光顯微切割將糊粉、外胚乳、中胚乳、內(nèi)胚乳和轉(zhuǎn)移細胞從中分離出來，然后用qRT-PCR和LC-MS分別測定不同組織基因表達和蛋白質(zhì)的氨基酸水平。他們的實驗結(jié)果為深入了解胚乳中的蛋白質(zhì)合成和氨基酸轉(zhuǎn)運途徑提供了科學(xué)依據(jù)，并提出了提高優(yōu)質(zhì)珍珠白小麥品質(zhì)的可行性途徑的建議。

研究富含多酚或多糖的樹木的miRNA或基因的表達通常具有挑戰(zhàn)性。對此，Swati, Verma[32]等利用激光捕獲顯微切割的方法，對木本蘋果芽分生組織進行有效分離，并獲得miRNA和基因的表達分析數(shù)據(jù)。他們實驗證實，從LCM分離的蘋果芽分生組織中的RNA含有miRNA，并且其數(shù)量和質(zhì)量均良好，足以用于下游表達分析。

Sui Xiaolei[33]等利用顯微鏡，熒光染料遷移分析，顯微計算機斷層掃描，激光捕獲顯微切割和RNA測序（RNA-Seq）等技術(shù)相組合來研究內(nèi)部韌皮部（IP）和外部韌皮部（EP）在黃瓜果實維管束（VB）中的功能。RNA-Seq數(shù)據(jù)表明，與分化/發(fā)育、激素轉(zhuǎn)運、RNA或蛋白質(zhì)修飾/加工/運輸以及氮化合物代謝和運輸有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄優(yōu)先。這些發(fā)現(xiàn)為黃瓜果實維管組織中特定細胞轉(zhuǎn)錄組的分析提供了科學(xué)依據(jù)。

4 展望

LCM是近來快速發(fā)展起來的一個新興技術(shù)，其最大的優(yōu)點在于快速、準(zhǔn)確，它也成功地解決了分離異質(zhì)性細胞的問題。與其他研究技術(shù)聯(lián)合，推進了特異性細胞基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組等相關(guān)的研究，并顯示出了良好的應(yīng)用前景。如今，LCM技術(shù)被廣泛應(yīng)用與各個領(lǐng)域，但對于常規(guī)染色的組織切片，由于很難分辨組織結(jié)構(gòu)，尤其對于一些組織結(jié)構(gòu)較復(fù)雜的樣本想要準(zhǔn)確分離出目標(biāo)細胞也比較困難。隨著科技的發(fā)展，研究人員通過免疫組化方法，成功的解決了目標(biāo)細胞難以分離出來的問題。 就目前LCM技術(shù)的應(yīng)用來看，隨著對實驗精細度不斷提高，也要求LCM技術(shù)能更進一步完善，例如切割微小組織時樣品需求量大，需要大量的時間去捕獲，以致影響下游實驗研究，比如樣品RNA提取的質(zhì)量。

此外，對于激光顯微切割技術(shù)與彈射（PALM）技術(shù)結(jié)合而言，操作過程中目標(biāo)細胞捕獲相對困難，出現(xiàn)彈射方向偏移等問題，無法準(zhǔn)確地將目標(biāo)細胞彈射到收集蓋中，因此后續(xù)可以開發(fā)相應(yīng)的智能操作系統(tǒng)，根據(jù)目標(biāo)細胞的參數(shù)直接快速切割，準(zhǔn)確捕獲。還有在激光切割過程中由于切片厚度太厚，導(dǎo)致目標(biāo)細胞無法切割分離出來，建議可以開發(fā)設(shè)計更大的能量范圍，供給研究人員進行選擇，快速捕獲加快實驗進程，而不只是僅僅局限于低能切割。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，技術(shù)體系逐漸完善以及更多高效試劑盒的研發(fā)，LCM技術(shù)勢被應(yīng)用于更多的生物醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。