王昊亮， 鄧國(guó)宏

陸軍軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院 感染病科， 感染病研究重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400038

慢性HBV感染是我國(guó)最主要的人類病毒慢性感染，波及8%左右的人口。其免疫損傷導(dǎo)致的慢性肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝癌發(fā)生率居高不下。我國(guó)慢性HBV感染面臨的根本問題在于，大部分患者因母嬰傳播于嬰幼兒時(shí)期感染，表現(xiàn)為長(zhǎng)期的免疫耐受，病毒難以清除[1]。慢性HBV感染長(zhǎng)達(dá)數(shù)十年的自然史依次出現(xiàn)免疫耐受期、免疫清除期、低復(fù)制期和HBeAg陰性肝炎活動(dòng)期四個(gè)典型階段。

免疫耐受的概念來源于機(jī)體針對(duì)自身抗原免疫應(yīng)答的研究，指機(jī)體無(wú)法對(duì)特定抗原產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答。該定義很好地描述了慢性HBV感染者早期高病毒載量、無(wú)明顯肝損傷的現(xiàn)象。弄清慢性HBV感染發(fā)生免疫耐受的機(jī)制，對(duì)于臨床上實(shí)現(xiàn)乙型肝炎功能性治愈具有重大意義。

1 慢性HBV感染針對(duì)病毒的免疫耐受源自T淋巴細(xì)胞耗竭——證據(jù)及疑惑

基于急性HBV感染者的研究發(fā)現(xiàn)，病毒清除過程與HBV特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答緊密相關(guān)[2-4]?；诩毙訦BV感染黑猩猩模型的研究[5]揭示了T淋巴細(xì)胞(特別是CD8 T淋巴細(xì)胞)在HBV清除及肝損傷中的核心作用。考慮到上述HBV急性感染中的發(fā)現(xiàn)，慢性HBV感染針對(duì)病毒的免疫耐受源自HBV特異性T淋巴細(xì)胞異常就是一個(gè)合理的推測(cè)。而HBV特異性T淋巴細(xì)胞(特別是CD8 T淋巴細(xì)胞)也是近年來慢性HBV感染研究領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)。

相對(duì)于急性HBV感染者，慢性HBV感染者HBV特異性T淋巴細(xì)胞在數(shù)量、表型及功能上都有諸多不同：首先，該類患者HBV特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量很少，一般需要HBV抗原體外刺激擴(kuò)增之后才能穩(wěn)定檢測(cè)到[6]；其次，該類患者HBV特異性T淋巴細(xì)胞高表達(dá)PD-1、CTLT-4、TIM3、Bim等免疫抑制分子，而體外阻斷這些抑制分子，能一定程度上恢復(fù)HBV特異性T淋巴細(xì)胞的功能[6-10]。

慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)感染小鼠模型是研究慢性病毒感染的經(jīng)典模型?；谠撃Ｐ偷难芯拷Y(jié)果定義了T淋巴細(xì)胞由于抗原持續(xù)刺激導(dǎo)致數(shù)量減少、功能下調(diào)的狀態(tài)——T淋巴細(xì)胞耗竭[11]。慢性HBV感染者病毒特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量、表型及功能上的特性非常契合T淋巴細(xì)胞耗竭的定義。當(dāng)前主流觀點(diǎn)也認(rèn)為慢性HBV感染對(duì)于病毒的免疫耐受來源于長(zhǎng)期HBV抗原刺激導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞耗竭。然而，T淋巴細(xì)胞耗竭的假說，無(wú)法與慢性HBV感染臨床上觀察到的一些現(xiàn)象相吻合。

首先，T淋巴細(xì)胞耗竭是由于持續(xù)性抗原刺激造成的，其程度與抗原載量呈正比[12]。據(jù)此推斷，處于免疫耐受期的患者由于極高病毒載量，其HBV特異性T淋巴細(xì)胞耗竭程度應(yīng)該最高。然而研究[13]發(fā)現(xiàn)，該類患者相對(duì)于其他期患者，其HBV特異性T淋巴細(xì)胞數(shù)量并沒有明顯降低，且功能相對(duì)更加完整。

其次，慢性LCMV感染模型揭示CD8 T淋巴細(xì)胞耗竭是一個(gè)漸進(jìn)性功能受損過程：首先受損的是介導(dǎo)溶胞的細(xì)胞毒作用，隨之是IL-2分泌能力，然后是TNFα分泌能力，最后是IFNγ分泌能力[14]。CD4 T淋巴細(xì)胞耗竭過程中細(xì)胞因子分泌受損模式與CD8 T淋巴細(xì)胞類似[15]。由此推斷，慢性HBV感染者病毒特異性CD8 T淋巴細(xì)胞如果是耗竭狀態(tài)，那么其通過細(xì)胞毒作用介導(dǎo)肝損傷的能力應(yīng)該很弱。而臨床上慢性HBV感染者一旦脫離免疫耐受期，如果不利用核苷類似物抗病毒，則非常容易發(fā)生肝損傷。如果認(rèn)可CD8 T淋巴細(xì)胞在肝損傷中的核心作用，那么上述現(xiàn)象間接提示，慢性HBV感染者中病毒特異性CD8 T淋巴細(xì)胞耗竭程度是非常有限的。

再次，對(duì)于慢性HBV感染急性發(fā)作的患者，其呈現(xiàn)為高病毒載量、急性肝損傷。筆者和其他學(xué)者[16-19]的研究都發(fā)現(xiàn)該類患者大量HBV特異性T淋巴細(xì)胞活化，部分患者隨后會(huì)發(fā)生HBeAg甚至HBsAg清除。說明這些患者盡管HBV高載量，然而其T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)肝損傷和病毒清除的功能是比較完整的?？梢杂煤慕逿淋巴細(xì)胞功能恢復(fù)來解釋慢性HBV感染急性發(fā)作過程中肝損傷及后續(xù)病毒清除，但該假設(shè)很難解釋為何T淋巴細(xì)胞功能恢復(fù)反而伴隨HBV載量短期大幅提升。

最后，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，針對(duì)HBeAg陰性、HBsAg低水平的患者，經(jīng)PD-1抗體治療后HBsAg清除率不到5%[20]。而對(duì)于該類患者，聚乙二醇長(zhǎng)效干擾素治療可使高達(dá)30%的患者實(shí)現(xiàn)HBsAg清除[21]。上述結(jié)果說明，PD-1分子上調(diào)導(dǎo)致的T淋巴細(xì)胞耗竭并不是慢性HBV感染無(wú)法清除病毒的主要原因。

2 慢性HBV感染中病毒特異性T淋巴細(xì)胞由分化早期的T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)

近年來，基于慢性LCMV感染小鼠模型發(fā)現(xiàn)了一群TCF1+CXCR5+PD-1+的CD8 T淋巴細(xì)胞，這群細(xì)胞顯示出一定的干性，能進(jìn)一步分化為耗竭的T淋巴細(xì)胞[22]。而在腫瘤患者中的研究也發(fā)現(xiàn)這群干細(xì)胞樣的CD8 T淋巴細(xì)胞，該群細(xì)胞在抗原遞呈細(xì)胞的刺激下有效進(jìn)一步分化，與患者經(jīng)PD-1抗體治療后良好預(yù)后緊密相關(guān)[23]。

如果慢性HBV感染病毒特異性T淋巴細(xì)胞不是由耗竭的T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)，那么該如何定義這群T淋巴細(xì)胞的功能狀態(tài)？筆者深入分析了慢性HBV感染靜息期、慢性HBV感染急性發(fā)作患者的HBV特異性CD4 T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)HBV特異性CD4 T淋巴細(xì)胞以TNFα+細(xì)胞為主，該群細(xì)胞在高炎癥患者中大量活化且與患者肝損傷協(xié)同變化；而TNFα+細(xì)胞向IFNγ+細(xì)胞的分化則利于患者病毒清除，該分化過程伴隨著T淋巴細(xì)胞特化轉(zhuǎn)錄因子T-bet、效應(yīng)分子IL-21的上調(diào)[19]。有研究[24]在HBV特異性CD8 T淋巴細(xì)胞中也觀察到T-bet分子下調(diào)，但將其歸因于T淋巴細(xì)胞耗竭。筆者認(rèn)為，慢性HBV感染者中占主導(dǎo)地位的TNFα+CD4 T淋巴細(xì)胞很可能是處于早期分化、具有一定干性的T淋巴細(xì)胞，理由如下：(1)該群細(xì)胞細(xì)胞因子譜是TNFα+IFNγ-，這與耗竭T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞因子譜(TNFα-IFNγ+)截然相反[25]，而慢性LCMV感染小鼠模型中具有干性的TCF1+CXCR5+PD-1+的CD8 T淋巴細(xì)胞其細(xì)胞因子譜與筆者研究發(fā)現(xiàn)的這群細(xì)胞類似，為TNFα+IFNγdim[22]；(2)筆者前期對(duì)ATAC-seq數(shù)據(jù)庫(kù)中的CD4 T淋巴細(xì)胞數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)TNFα啟動(dòng)子區(qū)存在轉(zhuǎn)錄因子TCF-1特異結(jié)合元件，而TCF-1是維持血液細(xì)胞(包括T淋巴細(xì)胞)干性的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[26-27]；(3)筆者通過對(duì)慢性HBV感染急性發(fā)作患者的多點(diǎn)跟蹤，觀察到這群細(xì)胞向IFNγ+細(xì)胞分化的現(xiàn)象，說明這群細(xì)胞具有可分化性。

綜合筆者的發(fā)現(xiàn)及其他學(xué)者在慢性LCMV感染小鼠模型及腫瘤患者中的發(fā)現(xiàn)，可得出以下判斷，慢性HBV感染者病毒特異性CD4 T淋巴細(xì)胞以TNFα+細(xì)胞為主導(dǎo)，該群細(xì)胞具有一定的干性，其向IFNγ+細(xì)胞的分化則利于患者病毒清除。而慢性HBV感染者病毒特異性CD8 T淋巴細(xì)胞是否也是類似情況？筆者認(rèn)為可能性很大，不過目前并沒有相關(guān)研究證據(jù)。

當(dāng)然，慢性HBV感染者中也有耗竭的T淋巴細(xì)胞，該群細(xì)胞細(xì)胞因子譜根據(jù)當(dāng)前對(duì)T淋巴細(xì)胞耗竭的研究來判斷應(yīng)該為TNFα-IFNγ+[14-15,25]，從筆者的研究數(shù)據(jù)來看，該群細(xì)胞在患者中并不占主導(dǎo)。前人研究把HBV特異性IFNγ+T淋巴細(xì)胞數(shù)量提升歸因于耗竭T淋巴細(xì)胞的功能修復(fù)，目前看來，這群細(xì)胞數(shù)量提升很大部分可能來自于TNFα+細(xì)胞的分化。

3 慢性HBV感染中病毒特異性T淋巴細(xì)胞未能進(jìn)一步分化的可能原因

慢性HBV感染病毒特異性分化早期的TNFα+T淋巴細(xì)胞為何沒有進(jìn)一步分化，反而處于靜息沉默狀態(tài)？筆者認(rèn)為原因可能在于天然免疫系統(tǒng)。與EB病毒、巨細(xì)胞病毒、HCV等在感染初期即出現(xiàn)病毒快速擴(kuò)增、天然免疫的迅速激活不同，HBV難以激發(fā)天然免疫模式識(shí)別受體，表現(xiàn)為天然免疫難以識(shí)別的“隱形病毒”[28-29]。而對(duì)于慢性HBV感染急性發(fā)作患者的研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)病早期，肝臟炎癥反應(yīng)以天然免疫活化為主。檢測(cè)不到HBV特異性IFNγ+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答，這說明患者天然免疫系統(tǒng)即使活化了，也主要參與介導(dǎo)肝臟炎癥損傷，很難有效激發(fā)HBV特異性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答以清除病毒[30]。體外刺激HBV特異性CD4 T淋巴細(xì)胞上OX40分子(抗原遞呈細(xì)胞上共刺激分子OX40L的配體)、同時(shí)阻斷PD-1分子，能顯著提升HBV特異性 IFNγ+及IL-21+CD4 T淋巴細(xì)胞的數(shù)量，這提示給予適當(dāng)?shù)奶烊幻庖咝盘?hào)刺激，能有效誘導(dǎo)HBV特異性CD4 T淋巴細(xì)胞的進(jìn)一步分化[31]。

4 展望

慢性HBV感染者T淋巴細(xì)胞到底是耗竭的T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)，還是處于分化早期具有一定干性的沉默T淋巴細(xì)胞主導(dǎo)？弄清這個(gè)問題非常重要，這直接關(guān)系到感染免疫研究方向及臨床治療策略的選擇。如果是前者，那么就應(yīng)該進(jìn)一步研究HBV特異性T淋巴細(xì)胞耗竭的機(jī)制，臨床免疫治療策略應(yīng)聚焦于耗竭T淋巴細(xì)胞的功能逆轉(zhuǎn)；如果是后者，那么就應(yīng)該深入研究處于分化早期的沉默T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步分化的機(jī)制，臨床免疫治療策略則應(yīng)聚焦于促進(jìn)該群T淋巴細(xì)胞進(jìn)一步向清除病毒方向分化。隨著目前研究手段的日益精進(jìn)(單細(xì)胞測(cè)序、質(zhì)譜流式等高內(nèi)涵平臺(tái)的應(yīng)用)、研究?jī)?nèi)容的日益深入，相信這個(gè)問題在不久的將來能得到更令人信服的答案。