楊 攀，楊詩雯，李 磊，楊效曾

（1 北京市農(nóng)林科學(xué)院北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京海淀 100097；2 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；3 福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；4 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院）

1 生菜的起源及分類

生菜起源于歐洲地中海沿岸和西亞一帶，經(jīng)野生種馴化而來。公元前2500 年，埃及人開始種植生菜并發(fā)現(xiàn)其種子能夠榨取食用油[1]。隋唐時(shí)傳入我國(guó)，近年來種植面積迅速擴(kuò)大，生菜也成為了普通百姓的家常蔬菜[2]?；谄渖飳W(xué)特征，生菜可分為6 大類：奶油生菜、結(jié)球生菜、散葉生菜、羅馬生菜、萵筍和油用生菜。前4 種主要食用葉子，所以歸為葉用生菜，萵筍主要食用其莖部，由多葉生菜經(jīng)葉子變小、莖干加粗演化而來。油用生菜主要用于榨油，中國(guó)古代著作《肘后備急方》中有所記載[3]。經(jīng)過多年的自然選擇和人工培育，如今生菜品種繁多，已成為日常生活中最重要的蔬菜之一?，F(xiàn)在我們所看到的所有生菜的品種都可歸為以上6 大類。

2 生菜的價(jià)值

生菜營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，富含蛋白質(zhì)、纖維、酚類、糖類、黃酮等多種有機(jī)物，水分含量高達(dá)90%以上。此外，富含大量維生素C 和維生素E，常食對(duì)眼睛有保健作用，對(duì)皮膚有美白的功效。同時(shí)，生菜含有少量抗氧化物，能夠分解食物中亞硝酸胺等致癌物質(zhì)而被譽(yù)為“抗癌蔬菜”[4-5]。生菜屬?zèng)鲂允卟耍o葉中含有萵苣素，有利尿解毒的功效。生菜中含有一種叫原兒茶酸的物質(zhì)在抑制胃癌和大腸癌方面效果極為顯著[4]。生菜纖維含量較高，是高血壓患者的優(yōu)選蔬菜，常食能穩(wěn)定血壓，消除脂肪，所以生菜又被稱為“減肥蔬菜”[4]。總之，生菜在食用和藥用方面均具有較高的價(jià)值。

3 生菜的生物學(xué)特性

生菜喜冷涼環(huán)境，其生長(zhǎng)受溫度影響較大，耐熱性較差，品種不同，生育期略有差異，大多為3～4 個(gè)月。種子耐低溫能力強(qiáng)，在4℃時(shí)即可發(fā)芽。發(fā)芽適溫為18℃～20℃，高于25℃，影響種皮吸水，發(fā)芽不良，溫度持續(xù)高于30℃時(shí)抑制種子萌發(fā)。植株生長(zhǎng)期間，喜冷涼氣候，15℃～20℃時(shí)，植株生長(zhǎng)迅速，為最佳生長(zhǎng)溫度，溫度高于25℃，葉質(zhì)粗老，食之略有苦味，葉片容易發(fā)生腐爛，生長(zhǎng)較差。生菜耐寒性頗強(qiáng)，0℃甚至短期的零下低溫對(duì)其生長(zhǎng)也不會(huì)造成嚴(yán)重影響[4]。

4 生菜種子萌發(fā)研究進(jìn)展

種子萌發(fā)受諸多環(huán)境因素影響，如溫度、濕度、土壤條件等。生菜種子具有良好的耐低溫能力，相反高溫嚴(yán)重影響其萌發(fā)率。為了揭示高溫抑制其萌發(fā)的分子機(jī)制，Bertier 等[6]利用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9 敲除了高溫下抑制生菜種子萌發(fā)的基因NCED4，深度測(cè)序結(jié)果顯示：敲除突變體T2代有8%的植株發(fā)生了單位點(diǎn)突變，21%的植株2 個(gè)位點(diǎn)都發(fā)生了突變，與野生型相比，在37℃處理下，NCED4 突變體種子具有較高的萌發(fā)率。除了從分子層面揭示種子萌發(fā)機(jī)制外，適當(dāng)?shù)耐庠刺幚砟軌蛱岣叻N子發(fā)芽率。近年來，科學(xué)家探究了外源激素及鹽脅迫等對(duì)生菜種子萌發(fā)的影響。徐衛(wèi)紅等[7]揭示了不同濃度Na2CO3對(duì)生菜種子萌發(fā)的影響，研究表明Na2CO3濃度高于5mmol/L 時(shí)對(duì)生菜種子萌發(fā)具有顯著的抑制作用。陳艷麗等[8]以意大利耐抽薹生菜種子為材料，探究了不同溫度和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生菜種子萌發(fā)的影響，研究表明生菜種子催芽的最適溫度為恒溫17℃，用生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑KNO3和赤霉素（GA3）浸種可以顯著提高生菜種子的萌發(fā)。賈雙雙等[9]研究了生菜種子在NaCl 脅迫下的萌發(fā)情況。在種子萌發(fā)時(shí)，通過施加梯度濃度（0、50、100、150、200、250 mmol/L）Na-Cl 溶液，研究了生菜種子萌發(fā)時(shí)受NaCl 脅迫的影響。通過測(cè)定與種子萌發(fā)有關(guān)的指標(biāo)（如種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率等），發(fā)現(xiàn)生菜種子在NaCl 濃度不高于50 mmol/L 時(shí)，發(fā)芽勢(shì)、相對(duì)萌發(fā)活力指數(shù)等各指標(biāo)與對(duì)照組差異不顯著，而葉綠素含量與根系活力卻顯著高于對(duì)照組，而后隨著NaCl 濃度的升高，其對(duì)各指標(biāo)的抑制強(qiáng)度顯著增強(qiáng)?？傊?，研究表明生菜種子可耐50mmol/L 的NaCl 脅迫。

5 生菜組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

植物組織培養(yǎng)作為植物無性快速繁殖的重要技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用。生菜花器官較小，使用常規(guī)雜交育種技術(shù)難度大，故通過組織培養(yǎng)技術(shù)能夠加速其品種改良。但生菜品種繁多，不同基因型之間其遺傳差異較大。Michelmore 等[10]于1987 年首次建立了散葉生菜的組織培養(yǎng)體系。隨后，其他幾種生菜的組培體系也被建立。那杰等[11]建立了結(jié)球生菜的組培體系，其核心是在MS 基本培養(yǎng)基中附加0.1～0.4 mg/L 的6-BA 和0.05～2.0mg/L 的IAA 作為愈傷組織誘導(dǎo)及芽分化的添加物，而最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS 培養(yǎng)基。劉思言等[12]建立了美國(guó)繡球生菜和紫葉生菜的組培體系，其方法是以MS 基本培養(yǎng)基附加0.1mg/L 的NAA 和0.5mg/L的6-BA 為愈傷誘導(dǎo)及芽分化的最佳培養(yǎng)基，1/2MS培養(yǎng)基也是最佳生根培養(yǎng)基。鄧瑩等[13]探究了意大利生菜的組織培養(yǎng)體系，研究表明，當(dāng)6-BA 濃度為0.5mg/L、NAA 濃度為0.2 mg/L 時(shí)，用7 天幼苗葉片作為外植體，愈傷組織出愈率可達(dá)100%，愈傷組織高度發(fā)生，無褐化、玻璃化現(xiàn)象的發(fā)生，是愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，最佳生根培養(yǎng)基是MS 基本培養(yǎng)基中附加0.25mg/L 6-BA 和0.2mg/L NAA?？傊?，經(jīng)過不斷的完善和優(yōu)化，到目前為止，生菜組織培養(yǎng)體系已經(jīng)相當(dāng)完善和成熟。

6 生菜基因組研究進(jìn)展

近年來，得益于高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用，許多物種已進(jìn)行了全基因組測(cè)序和組裝。利用該技術(shù)，Reyes-Chin-Wo 等[14]對(duì)生菜的基因組進(jìn)行了測(cè)序和組裝。生菜是二倍體，有2n=2x=18 條染色體，基因組大小約2.5Gb。生菜基因組采用全基因組鳥槍法和Chicago 技術(shù)以構(gòu)建大的super-scaffolds，這些super-scaffolds 通過遺傳圖譜定位到9 條假染色體上。同時(shí)確定了幾個(gè)可能有助于植物發(fā)育相關(guān)的基因組特征，包括編碼類似Cycloidea 轉(zhuǎn)錄因子的基因，激酶和參與膠乳生物合成的酶和抗病有關(guān)的蛋白。其次，在生菜中鑒定到了21 種新型microRNA，其中1 種可以作用于許多激酶轉(zhuǎn)錄物觸發(fā)phasiRNA。繼生菜基因組被測(cè)定后，Zhang 等[15]又對(duì)240 種生菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，產(chǎn)生了110 萬單核苷酸多態(tài)性（SNP），全基因組鑒定出5311 個(gè)表達(dá)數(shù)量性狀基因座（eQTL），4105 個(gè)基因，包括9 個(gè)參與調(diào)節(jié)黃酮類生物合成相關(guān)基因的e-QTL。通過全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）鑒定到6 個(gè)與葉色有關(guān)的候選基因座，這些基因座調(diào)控生菜葉片花青素的變異。以上兩大研究成果在生菜研究史上具有里程碑的意義，為日后生菜分子育種工作奠定了重要基礎(chǔ)。

7 生菜花序研究進(jìn)展

植物生長(zhǎng)包括營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)，花芽的出現(xiàn)是植物進(jìn)入生殖生長(zhǎng)的標(biāo)志，研究植物花器官結(jié)構(gòu)及其發(fā)育的分子機(jī)制具有重要意義。生菜多數(shù)是頭狀花序，在莖枝頂端排成圓錐花序，頭狀花序小，舌狀小花黃色，約15 枚[16]。開花是被子植物有性繁殖的重要環(huán)節(jié)，其受到許多基因的協(xié)同調(diào)控，是一個(gè)復(fù)雜而有序的生物學(xué)過程。生菜作為葉用蔬菜，高溫脅迫會(huì)加速其提早抽薹開花而失去食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。Chen 等[17]對(duì)生菜的花芽發(fā)育過程進(jìn)行了研究，將生菜花芽的發(fā)育分為8 個(gè)階段。第1 階段（萌發(fā)后20d）：頂端分生組織平坦，無凸起。第2 階段（萌發(fā)后28d）：頂端分生組織呈圓頂形。第3 階段（萌發(fā)后35d）：頂端分生組織呈細(xì)長(zhǎng)，標(biāo)志著從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的過渡。第4 階段（萌發(fā)后45d）：花序分生組織突出了總苞原基。第5 階段（萌發(fā)后55d）：以頭狀原基的出現(xiàn)為特征。第6 階段（萌發(fā)后75d）：產(chǎn)生越來越多的頭狀原基，并且頂部頭狀花序開始分化為小花原基。第7 階段（萌發(fā)后85d）：一排小花蕾的形成。第8 階段（萌發(fā)后95d）：位于每個(gè)小花蕾基部的胚珠開始發(fā)育，并開始產(chǎn)生種子。

8 生菜抽薹的分子機(jī)制研究進(jìn)展

生菜喜冷涼環(huán)境，高溫會(huì)導(dǎo)致其提早抽薹開花而失去營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和食用價(jià)值。近年來，由于全球變暖，生菜產(chǎn)量受到嚴(yán)重影響[17-18]，所以研究其抽薹的分子機(jī)制具有重要的應(yīng)用價(jià)值?；诖耍珻hen 等[18]對(duì)適溫和高溫下生長(zhǎng)的生菜進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，挖掘出了生菜中響應(yīng)高溫的基因LsSOC1，敲除該基因能夠明顯延緩抽薹而且對(duì)高溫不敏感。此外，其發(fā)現(xiàn)LsFT 也是與抽薹和響應(yīng)高溫有關(guān)的基因，敲除LsFT 基因后觀察到生菜抽薹推遲，并且失去對(duì)高溫的敏感性。接著，Ning等[19]以生菜不同時(shí)期的花蕾和花器官為材料做了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，挖掘出了LsMADS 是一個(gè)與開花有關(guān)的基因，過表達(dá)LsMADS 基因?qū)е律颂嵩玳_花。除了從基因組中挖掘調(diào)控開花基因外，Hao 等[20]對(duì)正常溫度（20℃）生長(zhǎng)下生菜的莖和高溫（33℃）誘導(dǎo)抽薹期間生菜的莖進(jìn)行了比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析，并且使用qRT-PCR 和蛋白質(zhì)印跡對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行了生物學(xué)驗(yàn)證。在5454 種鑒定的蛋白中，相對(duì)于對(duì)照組，619 種蛋白呈現(xiàn)出由高溫誘導(dǎo)的差異豐度，其中345 種具有增加的豐度，274 種具有減少的豐度，具有豐度水平變化的蛋白主要富集在與光合作用相關(guān)的途徑和參與生長(zhǎng)素（IAA）生物合成的色氨酸代謝途徑，而且，在具有不同豐度的蛋白中，與光合作用和色氨酸代謝相關(guān)的蛋白豐度增加。研究表明，高溫增強(qiáng)了光合作用和IAA生物合成的功能，促進(jìn)了抽薹過程，這與IAA 代謝的生理學(xué)和轉(zhuǎn)錄水平一致。其研究工作對(duì)高溫誘導(dǎo)的生菜抽薹的分子機(jī)制有了新的理解，對(duì)日后生菜分子育種工作具有潛在的重要意義。

9 轉(zhuǎn)基因生菜研究進(jìn)展

自生菜遺傳轉(zhuǎn)化體系建立以來，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法為主要途徑的生菜轉(zhuǎn)基因工作取得了眾多進(jìn)展。通過轉(zhuǎn)基因生菜生產(chǎn)疫苗和藥用蛋白是近年來的研究熱點(diǎn)，生菜因生長(zhǎng)周期短，可生食等特點(diǎn)可作為良好的植物反應(yīng)器。Ersiniapestis 是一種引起結(jié)腸和肺鼠疫的病原體，目前急需開發(fā)針對(duì)這種疾病有效且低成本的口服疫苗。為了解決這一問題，Rosalesmendoza 等[21]將來自鼠疫桿菌的免疫原性融合蛋白F1-V 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方式導(dǎo)入到生菜中，并得到了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系，實(shí)現(xiàn)了此疫苗快速而廉價(jià)的生產(chǎn)。此外，鄧小莉等[22]將蹄疫抗原決定簇融合基因HBcAg 轉(zhuǎn)入生菜，實(shí)現(xiàn)了蹄疫抗原的快速生產(chǎn)。另一方面，通過轉(zhuǎn)基因手段提高生菜中與抗逆有關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)生菜對(duì)不良環(huán)境的適應(yīng)性。研究表明過表達(dá)擬南芥ABF3 基因提高了生菜抗旱和耐低溫能力[23]。尤麗佳等[24]將擬南芥Atpsy 基因?qū)肷?，結(jié)果表明在干旱脅迫下，轉(zhuǎn)基因生菜發(fā)芽率以及光合作用速率明顯高于野生型。Darqui 等[25]將番茄Snakin-1 基因?qū)肷?，提高了生菜抗立枯絲核（Rhizoctonia solani）和菌核（Sclerotinia）的能力。Kim 等[26]在生菜中過表達(dá)擬南芥HSP17.8 基因，結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)ABA 介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑能夠提高生菜的抗鹽和耐旱能力。近年來，CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已成功應(yīng)用于許多物種，但其在生菜中報(bào)道很少，禹明森等[27]在生菜中應(yīng)用了此技術(shù)并檢測(cè)到目標(biāo)靶位點(diǎn)發(fā)生編輯，說明其在生菜中成功地建立了CRISPR/Cas9 基因編輯體系，該技術(shù)的成功應(yīng)用將為日后生菜基因功能研究及分子育種奠定了重要基礎(chǔ)。

10 問題和展望

生菜作為目前最為重要的葉用蔬菜之一，在種植過程中因在冷涼環(huán)境下生長(zhǎng)，很少或較少噴施農(nóng)藥而被視為無公害蔬菜，故需求量急劇增加。此外，生菜的藥用價(jià)值也非同尋常。如今，癌癥已成為嚴(yán)重威脅人類健康的殺手之一，抗癌物的提取和抗癌藥的研發(fā)極為迫切，而生菜中含有的原兒茶酸對(duì)癌細(xì)胞有良好的抑制作用。所以，無論是食用還是藥用，大力發(fā)展生菜產(chǎn)業(yè)均具有重要意義。然而，與發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)生菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展中還面臨著諸多不足，比如，還不能有效控制高溫環(huán)境下生菜發(fā)生的病蟲害，進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)量普遍較低。生菜作為設(shè)施園藝作物，種植主要在大棚中完成，冬季和夏季嚴(yán)重供應(yīng)不足的問題依然存在。高溫下易抽薹、葉片易腐爛、莖葉機(jī)械化程度不高、接觸時(shí)葉片易碎爛、采摘后難儲(chǔ)存等問題依然很突出，所以，以上存在的問題依然需要科研工作者們不斷的努力，從而推動(dòng)生菜產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。