楊帥 吳曉淋 劉暢 王曉雄 王巖 郭柱 張國(guó)慶 相宏飛 陳伯華

椎間盤(pán)位于相鄰椎體之間，由外周的纖維環(huán) ( annulus fibrosus，AF )、中央膠凍樣髓核 ( nucleus pulposus，NP ) 組織以及上下兩端薄層透明的軟骨終板 ( cartilage endplate，CE ) 組成。外周纖維環(huán)主要由類(lèi)似成纖維細(xì)胞的纖維環(huán)細(xì)胞組成、髓核組織的主要細(xì)胞類(lèi)型為星狀軟骨樣細(xì)胞、軟骨終板則是一層與關(guān)節(jié)軟骨組織相似的薄層軟骨[1]。椎間盤(pán)退變 ( intervertebral disc degeneration，IDD ) 是指由細(xì)胞介導(dǎo)的進(jìn)行性結(jié)構(gòu)衰竭的異常反應(yīng)[2]。退變的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的失衡，組織的水合作用喪失、炎癥發(fā)生以及細(xì)胞外基質(zhì)的丟失，進(jìn)而導(dǎo)致椎間盤(pán)高度降低、纖維環(huán)結(jié)構(gòu)破壞，逐步喪失正常的生理結(jié)構(gòu)和功能[3]。由于椎間盤(pán)是人體內(nèi)最大的無(wú)血管結(jié)構(gòu)，內(nèi)部細(xì)胞的物質(zhì)交換僅依靠于軟骨終板上微孔結(jié)構(gòu)的彌散作用進(jìn)行[4]，因此 IDD 很難通過(guò)其自身修復(fù)，具有不可逆性。鑒于此特點(diǎn)，越來(lái)越多的團(tuán)隊(duì)開(kāi)始使用干細(xì)胞對(duì) IDD 過(guò)程進(jìn)行干預(yù)，以達(dá)到減緩 IDD 進(jìn)程或修復(fù)退變椎間盤(pán)的目的，包括間充質(zhì)干細(xì)胞 ( mesenchymal stem cells，MSC )、椎間盤(pán)源性干細(xì)胞 ( intervertebral disc-derived stem cell，IVDSC )、多能干細(xì)胞 ( pluripotent stem cells，PSC ) 等在內(nèi)的一系列方法為退變性椎間盤(pán)疾病 ( degeneration disc disease，DDD ) 的治療及相關(guān)研究帶來(lái)了新思路、新策略，被認(rèn)為具有良好的應(yīng)用前景。現(xiàn)筆者就當(dāng)前科研與臨床治療中干細(xì)胞及相關(guān)技術(shù)的新研究、新進(jìn)展進(jìn)行歸納總結(jié)，作如下綜述。

一、退變性椎間盤(pán)疾病

由 IDD 引起的 DDD 是包括盤(pán)源性腰痛、腰椎間盤(pán)突出癥等在內(nèi)的一系列疼痛性脊柱疾病[5]。大部分患者的臨床癥狀可以通過(guò)休息或保守治療得到緩解[6]。此外，可進(jìn)行皮質(zhì)類(lèi)固醇、局部麻醉藥物和其它多種藥物的封閉治療，但尚未有明確的治療效果[7]。當(dāng)上述治療手段無(wú)效時(shí)，人們通常選擇外科手術(shù)的方法對(duì)這類(lèi)疾病進(jìn)行干預(yù)治療，以此來(lái)減輕臨床癥狀、提高生活質(zhì)量。但上述治療手段均無(wú)法逆轉(zhuǎn)退變椎間盤(pán)的病理狀態(tài)，且術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率較高[8]，甚至可以加速鄰近節(jié)段 IDD。并且，外科手術(shù)的干預(yù)改變了椎間盤(pán)或脊柱的正常生物學(xué)特性，使其喪失了部分或全部的自身修復(fù)的機(jī)會(huì)。隨著對(duì) IDD、DDD 相關(guān)機(jī)制的逐步了解以及干細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，使用干細(xì)胞移植等組織工程方法來(lái)修復(fù)退變椎間盤(pán)、恢復(fù)椎間盤(pán)或脊柱的正常生理結(jié)構(gòu)和功能越來(lái)越為人們所重視。

二、間充質(zhì)干細(xì)胞

MSC 是一種具有多向分化能力的 PSC，其來(lái)源廣泛、易于獲取。MSC 最常見(jiàn)的來(lái)源是骨髓和脂肪組織。

1. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 ( bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSC )：BMSC 是骨髓內(nèi)的非造血干細(xì)胞，其來(lái)源廣泛，相對(duì)較易獲取，是當(dāng)前研究最多的 MSC 種類(lèi)之一。既往研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白 7 ( bone morphogenetic protein 7，BMP-7 )[9]、骨形態(tài)發(fā)生蛋白 3 ( bone morphogenetic protein 3，BMP-3 )[10]與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1 ( transforming growth factor beta 1，TGF-β1 )[11]等生物因子可以誘導(dǎo) BMSC 增殖分化為髓核細(xì)胞表型，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，且 BNP-3 與 TGF-β1 之間具有協(xié)同作用，從而能夠進(jìn)一步加強(qiáng)了對(duì) BMSC 的分化誘導(dǎo)。這表明，合適的基因轉(zhuǎn)染能夠促進(jìn) BMSC 的髓核樣表型，且不同的基因之間存在一定的協(xié)同作用。

Li 等[12]在體外進(jìn)行大鼠 BMSC 與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與 BMSC 的共培養(yǎng)能夠減少衰老髓核細(xì)胞中 β-半乳糖苷酶表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞增殖、降低基質(zhì)金屬蛋白酶 9 ( matrix metalloproteinase 9，MMP9 ) 的合成，同時(shí)增加 Coll-IIa 產(chǎn)量；此外，髓核細(xì)胞中鋅金屬肽酶 STE24 ( zinc metallopeptidase STE24，ZMPSTE24 ) 的表達(dá)在與 BMSC 共培養(yǎng)后得以恢復(fù)，抑制了 TGF-β / NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的促衰老作用，從而達(dá)到減緩或預(yù)防髓核細(xì)胞纖維化的目的，恢復(fù)其細(xì)胞活力。Lehmann 等[13]在進(jìn)行 BMSC 與髓核細(xì)胞直接共培養(yǎng)與間接共培養(yǎng)時(shí)，不僅發(fā)現(xiàn) BMSC 能產(chǎn)生髓核細(xì)胞表型，而且還發(fā)現(xiàn)與間接共培養(yǎng)相比，兩種細(xì)胞在進(jìn)行直接共培養(yǎng)時(shí)，在細(xì)胞膜之間形成了一種類(lèi)似隧穿納米管 ( tunnelling nanotubes，TnT ) 的結(jié)構(gòu)，說(shuō)明這種類(lèi) TnT 樣結(jié)構(gòu)能夠促進(jìn) BMSC 的表型變化，進(jìn)一步揭示了兩種細(xì)胞之間通訊的分子機(jī)制，為后續(xù)研究打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。Lu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞通訊機(jī)制之一的外泌體 ( exsome ) 在干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化中起到了重要作用；該研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞來(lái)源的外泌體能成功將 BMSC 誘導(dǎo)分化為髓核細(xì)胞表型，且 BMSC 來(lái)源的外泌體能夠促進(jìn)退變髓核細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)、增加細(xì)胞外基質(zhì)的含量，從而促進(jìn)退變椎間盤(pán)的自我修復(fù)。類(lèi) TnT 樣結(jié)構(gòu)和外泌體的發(fā)現(xiàn)為 BMSC 的誘導(dǎo)分化提供了新途徑，對(duì)其通訊機(jī)制的進(jìn)一步研究能夠?yàn)?BMSC 的生物學(xué)治療方法提供新的突破點(diǎn)。

在動(dòng)物模型水平的研究中，研究者進(jìn)行了一系列的 BMSC 移植實(shí)驗(yàn)，證明了 BMSC 修復(fù)退變椎間盤(pán)的有效性。其中，Hussain 等[15]使用載有 BMSC 的脫細(xì)胞高密度膠原蛋白 ( high density collagen，HDC ) 凝膠接種到纖維環(huán)受損的綿羊椎間盤(pán)內(nèi)，接種后 6 周進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理，接種載有 BMSC 的凝膠的實(shí)驗(yàn)組在椎間盤(pán)高度指數(shù) ( disc hight index，DHI )、Pfirrmann 等級(jí)，髓核面積以及 T2松弛時(shí)間 ( T2-RT ) 方面的數(shù)據(jù)明顯優(yōu)于其它實(shí)驗(yàn)組；組織學(xué)結(jié)果表明，受損纖維環(huán)和髓核的組織重建和修復(fù)得到明顯改善。此外，Lykov 等[16]使用過(guò)氧化氫誘導(dǎo)氧化應(yīng)激條件，模擬退變椎間盤(pán)的微環(huán)境，然后將 BMSC 與促紅細(xì)胞生成素 ( erythropoietin，EPO ) 混合后注入大鼠退變椎間盤(pán)內(nèi)，MRI 和組織學(xué)結(jié)果證實(shí)了受損椎間盤(pán)的高度以及髓核細(xì)胞組成均得到明顯改善，并且在氧化應(yīng)激條件下 EPO 能夠抑制 MSC 的遷移活性，這可以促進(jìn) MSC 在注射部位的局部蓄積，進(jìn)而刺激再生。由此可知，BMSC 對(duì)退變椎間盤(pán)具有一定的修復(fù)作用，且 EPO 的使用能夠保證 BMSC 的修復(fù)作用在退變椎間盤(pán)的惡劣微環(huán)境中的穩(wěn)定發(fā)揮；同時(shí)也提醒人們其它激素是否還有類(lèi)似作用能夠保證干細(xì)胞促修復(fù)作用的穩(wěn)定進(jìn)行，為干細(xì)胞治療技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供了思路。

基于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的成功開(kāi)展，研究人員逐步將 BMSC 移植用于臨床研究。Orozco 等[17]將自體 BMSC 注入 10 例伴有腰椎 IDD 的慢性腰痛患者的退變椎間盤(pán)髓核內(nèi)，注射后 1 年的跟蹤隨訪示患者腰痛癥狀明顯減輕，MRI 表明椎間盤(pán)含水量在第 12 個(gè)月時(shí)明顯升高，但椎間盤(pán)高度無(wú)明顯改變。隨后，Centeno 等[18]將自體 BMSC 在體外培養(yǎng)后注入 33 例經(jīng) MRI 診斷為椎間盤(pán)膨出的腰背痛患者的病變椎間盤(pán)內(nèi)，然后對(duì)所有患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 6 年的跟蹤隨訪，33 例中大多數(shù)人的疼痛明顯減輕，脊柱功能較前增強(qiáng)，膨出的椎間盤(pán)尺寸減??；僅報(bào)告 3 例被主治醫(yī)師認(rèn)定為手術(shù)相關(guān)的輕微不良事件，3 例不良事件均與疼痛相關(guān)且疼痛均已緩解，另有 2 例在后期接受了手術(shù)治療。整體未發(fā)生死亡、癱瘓或神經(jīng)病變等嚴(yán)重的安全問(wèn)題及臨床并發(fā)癥。由此可見(jiàn)，自體 BMSC 治療 DDD 的有效性及安全性得到了很好驗(yàn)證，這說(shuō)明 BMSC 的臨床應(yīng)用是安全可行的。Pettine 等[19]選取了 26 例具有脊柱融合術(shù)或椎間盤(pán)置換術(shù)手術(shù)指征的病例，將自體 BMSC 注入病變椎間盤(pán)髓核內(nèi)。注入后 12 個(gè)月的 MRI 結(jié)果表明退變椎間盤(pán)得到明顯的改善；注入后 36 個(gè)月，只有 6 例進(jìn)行了手術(shù)治療，其余 20 例的 Oswestry 功能障礙指數(shù) ( oswestry disability index，ODI ) 和疼痛視覺(jué)模擬評(píng)分 ( visual analogue scale，VAS ) 同樣得以改善，所有患者沒(méi)有發(fā)生與骨髓抽吸或注射相關(guān)的不良事件，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果拓寬了自體 BMSC 治療 DDD 的臨床適應(yīng)證。Noriega 等[20]使用同種異體 BMSC 對(duì) 12 例明確為腰椎 IDD 且保守治療無(wú)效的慢性腰痛患者進(jìn)行移植治療，1 年的跟蹤隨訪表明，12 例無(wú)不良事件發(fā)生且 VAS、ODI 均有明顯改善，MRI 結(jié)果提示患者的 Pfirrmann 分期也顯著改善；這說(shuō)明異體 BMSC 同樣可以應(yīng)用于 DDD 的治療，更重要的是，與自體 BMSC 移植相比，前者具有更高的同質(zhì)性，治療成本更低，可以應(yīng)用在患有自身免疫性疾病的患者體內(nèi)；同時(shí)，該研究團(tuán)隊(duì)表明：在該研究項(xiàng)目中，同種異體 BMSC 移植的治療效果比自體 BMSC 移植稍差，這就需要納入更多的臨床樣本、比較不同的細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行更長(zhǎng)時(shí)間的跟蹤調(diào)查，從而確定兩者的治療效果。

有限的臨床研究表明 BMSC 移植能夠用于 DDD 的臨床治療，其安全性也得到了很好的驗(yàn)證；自體 BMSC 治療的臨床適應(yīng)證正逐步擴(kuò)展；同種異體 BMSC 的應(yīng)用拓寬了干細(xì)胞的來(lái)源范圍，但總的來(lái)說(shuō)，當(dāng)前的臨床試驗(yàn)納入的臨床樣本數(shù)較少，長(zhǎng)期療效還未得到驗(yàn)證，有待下一步相關(guān)試驗(yàn)的開(kāi)展。

2. 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞 ( adipose derived mesenchymal stem cell，ADMSC )：ADMSC 是在脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，其來(lái)源廣泛且易于獲得，是當(dāng)前干細(xì)胞治療 DDD 的研究熱點(diǎn)。有研究表明，與 BMSC 相比，ADMSC 的髓核細(xì)胞樣分化能力更高，因此 ADMSC 可能更適合應(yīng)用于 DDD 的治療[21]。Clarke 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，與 BMSC 相比，在 TGF-β1、GDF5 或 GDF6 的誘導(dǎo)下，ADMSC 分化為髓核細(xì)胞表型的能力更強(qiáng)，細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)硫酸糖胺聚糖、COL II 等細(xì)胞外基質(zhì)水平明顯增高。Han 等[23]進(jìn)行的 ADMSC 與退變髓核細(xì)胞的體外共培養(yǎng)不僅證明了 ADMSC 能促進(jìn)退變髓核細(xì)胞的修復(fù)，而且首次全面地鑒定了與 ADMSC 共培養(yǎng)時(shí)變退變髓核細(xì)胞能夠產(chǎn)生 lncRNA 和 mRNA 差異表達(dá)，概述了基因表達(dá)調(diào)控模式。這些研究成果進(jìn)一步提供了更有價(jià)值的信息，以便人們能夠更好地了解在干細(xì)胞療法和 IDD 治療中的生物標(biāo)志物。

在前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，各研究團(tuán)隊(duì)逐步開(kāi)始 ADMSC 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用。Hua 等[24]研究表明，Smoothened 激動(dòng)劑 ( smoothened agonist，SAG ) 能夠有效地活化音猬因子 ( sonichedgehog，Shh ) 信號(hào)通路，促進(jìn) ADSC 的髓核細(xì)胞樣分化；該研究團(tuán)隊(duì)使用 SAG 和 TGF-β3 處理后的 ADMSC 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明兩者組合能夠增加 ADMSC 的 ECM 合成、髓核細(xì)胞特異性標(biāo)志基因和蛋白產(chǎn)物的表達(dá)水平增加，與此同時(shí)，體內(nèi)椎間盤(pán)的高度、含水量、ECM 含量也獲得明顯改善。Ishiguro等[25]使用 ADMSC 成功制備了一種無(wú)支架組織工程結(jié)構(gòu) ( tissue-engineered construct，TEC )，并將其應(yīng)用在切除了全部髓核的大鼠椎間盤(pán)退變模型中，植入后 6 個(gè)月對(duì)其進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明 ADMSC-TEC 的植入不僅能維持椎間盤(pán)的高度、保留纖維環(huán)和軟骨終板的結(jié)構(gòu)，植入后第 6 周就顯現(xiàn)出與假手術(shù)組類(lèi)似的生物力學(xué)特征；更重要的是，這種由 ADMSC-TEC 再生的椎間盤(pán)與正常大鼠的椎間盤(pán)相比，不易隨年齡的增長(zhǎng)而發(fā)生退變。這為 ADMSC 的臨床應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)，且 SAG 的促分化作用的發(fā)現(xiàn)拓寬了 ADMSC 的使用方式。Kumar 等[26]在臨床治療中驗(yàn)證了 ADMSC 用于慢性盤(pán)源性下腰痛的安全性和耐受性，提示 ADMSC 可能可以用于 DDD 的臨床治療；該研究團(tuán)隊(duì)在 10 例的退變椎間盤(pán)內(nèi)植入透明質(zhì)酸與 ADMSC 混合物，之后對(duì)所有患者進(jìn)行了為期 1 年的跟蹤隨訪，6 例的 VAS 由 ( 6.50±1.27 ) 分降至 ( 2.90±1.66 ) 分、ODI 由 42.80±15.03 降至 16.80±9.77，MRI 結(jié)果表明 3 例的椎間盤(pán)含水量明顯提升，全部患者未有不良事件發(fā)生。

當(dāng)前研究表明 ADMSC 在一定條件下可以成功誘導(dǎo)分化為髓核樣細(xì)胞，從而對(duì)退變椎間盤(pán)進(jìn)行修復(fù)，且部分生物因子能夠增強(qiáng) ADMSC 的修復(fù)作用；動(dòng)物模型及臨床試驗(yàn)表明 ADMSC 可以改善退變椎間盤(pán)的生理狀態(tài)、緩解臨床癥狀；同時(shí)，ADSMC 因其來(lái)源廣泛、易于獲得等特點(diǎn)受到人們的廣泛關(guān)注，具有光明的應(yīng)用前景。但同樣的，ADMSC 的臨床試驗(yàn)的長(zhǎng)期有效性及安全性仍需進(jìn)一步接受驗(yàn)證，以便更好地開(kāi)展相關(guān)臨床應(yīng)用。

3. 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 ( umbilical cord mesenchymal stem cell，UCMSC )：UCMSC 主要存在于臍帶華通膠組織中，2003 年，K.E.Mitchell 首次在該組織中分離出 UCMSC，因此來(lái)自該處的 UCMSC 又被稱為華通膠間質(zhì)干細(xì)胞 ( Wharton's Jelly derived mesenchymal stem cell，WJMSC )。

Wang 等[27]研究表明，WJMSC 的基因表達(dá)模式與 ADMSC 相似，炎性刺激可調(diào)節(jié) WJMSC 的基因表達(dá)，在人胎兒 MSC 共培養(yǎng)體系中顯示出免疫抑制效應(yīng)。Beeravolu 等[28]研究了 WJMSC 和該細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的軟骨祖細(xì)胞 ( chondroprogenitor cells，CPC ) 在家兔 IDD 模型中的相關(guān)應(yīng)用，其結(jié)果表明移植后的干細(xì)胞在受損椎間盤(pán)內(nèi)能夠良好的存活并均勻的分散在髓核內(nèi)；同時(shí)，與 WJMSC 相比，CPC 在體外培養(yǎng)時(shí)，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、糖胺聚糖含量均有明顯改善，在接受了 CPC 移植的椎間盤(pán)內(nèi)，其髓核特異性標(biāo)記物含量也明顯升高，顯現(xiàn)出強(qiáng)大的修復(fù)能力。Pang 等[29]在 2 例患有慢性盤(pán)源性下腰痛患者的病變椎間盤(pán)內(nèi)注入 WJMSC 治療，2 年的跟蹤隨訪結(jié)果顯示，2 例 VAS、ODI 均明顯降低。

WJMSC 可以在體外誘導(dǎo)分化成為 CPC 再進(jìn)行移植，且修復(fù)效果要優(yōu)于 WJMSC 的直接應(yīng)用，一定程度上能夠避免干細(xì)胞多向分化性在移植后可能帶來(lái)的不利后果，這也為其它來(lái)源干細(xì)胞的發(fā)展應(yīng)用提供了新啟示。盡管 WJMSC 具有其它 MSC 的相同生物特性，與其它類(lèi)型的 MSC 相比并不具備明顯優(yōu)勢(shì)，因此缺乏對(duì)于 WJMSC 對(duì) DDD 的臨床治療以及基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)的研究報(bào)道，高昂的實(shí)驗(yàn)成本也成為了 UCMSC 發(fā)展的另一項(xiàng)阻礙。但相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步說(shuō)明了 WJMSC 在臨床的實(shí)際應(yīng)用中可能是可行的，為 WJMSC 的臨床應(yīng)用打下了基礎(chǔ)；目前的研究對(duì)象主要是自體 WJMSC，有待進(jìn)一步對(duì)于異體 WJMSC 移植的修復(fù)效果及生物安全性進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

三、椎間盤(pán)源性干細(xì)胞

MSC 的相關(guān)研究進(jìn)展已取得巨大成果，但是 MSC 移植療法在臨床應(yīng)用還較為有限：治療過(guò)程中需要通過(guò)有創(chuàng)操作對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行獲取和移植，有可能發(fā)生移植靶點(diǎn)的滲漏或者骨贅的形成等臨床并發(fā)癥。既往研究表明，椎間盤(pán)髓核組織、纖維環(huán)、軟骨終板中均存在有一定數(shù)量的 MSC[30]；IVDSC 不僅具有干細(xì)胞的成長(zhǎng)、分化特性，其椎間盤(pán)來(lái)源特征在退變椎間盤(pán)組織再生的修復(fù)治療策略顯現(xiàn)了巨大的潛力。

Wang 等[31]對(duì) BMSC、軟骨終板源性干細(xì)胞 ( cartilage endplate-derived stem cells，CESC )、髓核源性干細(xì)胞 ( nucleus puplposus-derived stem cells，NPSC )、纖維環(huán)源性干細(xì)胞 ( annulus fibrosus-derived stem cells，AFSC ) 的增殖能力進(jìn)行了比較，四種細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但體外細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)表明，CESC 在成軟骨及成骨能力方面要優(yōu)于其它三種細(xì)胞。He 等[32]研究表明，CESC 不僅能夠促進(jìn)軟骨終板的修復(fù)，還可通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖。髓核組織內(nèi)的干細(xì)胞還能夠沿著椎間盤(pán)內(nèi)的纖維和細(xì)胞方向進(jìn)行遷移[33]。另有研究發(fā)現(xiàn)，低氧環(huán)境能夠促進(jìn)髓核間質(zhì)干細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與 SIRT1 及 SIRT6 介導(dǎo)的 HIF-1α 信號(hào)通路有關(guān)；辛伐他汀可以通過(guò)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)來(lái)促進(jìn)髓核實(shí)質(zhì)干細(xì)胞向髓核細(xì)胞的分化，從而修復(fù)和重建退化的椎間盤(pán)[34-35]。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，Chen 等[36]在家兔 IDD 模型中比較了髓核間充質(zhì)干細(xì)胞與髓核細(xì)胞移植的治療效果，MRI 提示前者修復(fù)效果明顯優(yōu)于后者。目前為止，CESC 應(yīng)用仍面臨著巨大挑戰(zhàn)：CESC 特異性表型尚未明確，從軟骨終板中分離出 CESC 的效率較低，限制了 CESC 的應(yīng)用[29]；特異性的誘導(dǎo) CESC 分化成為透明軟骨組織而不是骨組織也存在一定難度[37]。

椎間盤(pán)的微環(huán)境的特征是低氧、高壓力、高滲、低 pH 值和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)不足[38]。Yasen 等[39]研究表明，隨著 IDD 的發(fā)生，IVDSC 也會(huì)發(fā)生老化和變性。尚未有研究清楚地表明如何避免 IVDSC 受老化、惡劣椎間盤(pán)微環(huán)境的影響，這些不利因素對(duì)植入的或內(nèi)源性干細(xì)胞的存活和功能提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，可能導(dǎo)致內(nèi)源性修復(fù)的失敗。

四、多能干細(xì)胞

包括誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 ( induced pluripotent stem cell，IPSC )、胚胎干細(xì)胞 ( embryonic stem cell，ESC ) 在內(nèi)的 PSC 在退變椎間盤(pán)的修復(fù)中也顯現(xiàn)了巨大潛力。IPSC 是體細(xì)胞通過(guò)導(dǎo)入多能遺傳基因誘導(dǎo)分化而來(lái)的一類(lèi)具有多分化潛能的干細(xì)胞。

Hu 等[40]研究了載有 GDF5 轉(zhuǎn)染人類(lèi)誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 ( GDF5-hiPSC ) 的熱敏水凝膠對(duì)大鼠 IDD 模型的影響；GDF5-hiPSC 與大鼠 NPC 在體外共培養(yǎng)后 3 種軟骨細(xì)胞標(biāo)志物 ( SOX9、COL2、蛋白聚糖 ) 的 mRNA 表達(dá)顯著增高，說(shuō)明其成功分化為軟骨細(xì)胞表型；將制備好的水凝膠植入大鼠 IDD 模型中，分別在第 1、2、3 個(gè)月進(jìn)行 X 線、MRI 以及組織學(xué)評(píng)估，其結(jié)果表明載有 GDF5-hiPSC 的熱敏凝膠能夠有效地改善 IDD。Liu 等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，髓核細(xì)胞外基質(zhì)能夠誘導(dǎo) IPSC 分化為類(lèi)髓核樣細(xì)胞，這表明髓核細(xì)胞能夠分泌一些調(diào)控因子對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，進(jìn)而修復(fù)退變椎間盤(pán)組織。這些研究為 IPSC 的臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。Sheikh 等[42]將小鼠 ESC 衍生的軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞在移植到家兔退變椎間盤(pán)內(nèi)，成功產(chǎn)生脊索細(xì)胞 ( notochordal cells，NC ) 群。而 NC 是椎間盤(pán)再生的關(guān)鍵細(xì)胞，NC 能夠產(chǎn)生蛋白聚糖促進(jìn)退變椎間盤(pán)的修復(fù)[43]。

盡管 IPSC 同樣能夠產(chǎn)生髓核細(xì)胞表型、能夠促進(jìn)退變椎間盤(pán)修復(fù)，為其臨床應(yīng)用奠定了一定的基礎(chǔ)。但是 IPSC 具有腫瘤增殖細(xì)胞分化特性，ESC 在體外的定向分化存在不穩(wěn)定性、在體內(nèi)具有致瘤性[44]以及與其相關(guān)的道德和法律問(wèn)題限制了這兩種細(xì)胞的進(jìn)一步應(yīng)用。因此需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)穩(wěn)定 PSC 的分化表達(dá)，以確保臨床應(yīng)用的有效性和安全性。

五、干細(xì)胞植入載體的發(fā)展

干細(xì)胞移植的應(yīng)用中，不僅移植細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化不良影響其治療效果，其植入部位干細(xì)胞滲漏這一問(wèn)題同樣阻礙著該方法的發(fā)展。多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)針對(duì)這一系列問(wèn)題，研究并制備了用于干細(xì)胞移植的各種生物材料。

McKee 等[45]研制了一種由丙烯酸和巰基官能化的自組裝聚乙二醇 ( polyethylene glycol，PEG ) 水凝膠支架，然后將人臍帶來(lái)源的 MSC 與家兔退變髓核細(xì)胞載入該支架內(nèi)后，分別進(jìn)行了家兔 IDD 模型的體內(nèi)、外實(shí)驗(yàn)；其結(jié)果表明該支架的應(yīng)用不僅能夠促進(jìn) MSC 產(chǎn)生髓核細(xì)胞樣表型，而且硫酸化的糖胺聚糖水平要高于未使用支架的實(shí)驗(yàn)組，更重要的是：支架的應(yīng)用能夠保證移植細(xì)胞在椎間盤(pán)內(nèi)的穩(wěn)定存在，避免發(fā)生細(xì)胞泄漏，促進(jìn)了移植干細(xì)胞的修復(fù)效果。Nair 等[46]使用殼聚糖-聚羥基丁酸酯-共-戊酸酯 [ chitosan-poly ( hydroxybutyrate-co-valerate )，CP ] 和硫酸軟骨素 ( chondroitin sulfate，CS ) 制備了一種可以附載 MSC 的水凝膠納米微粒，與常規(guī)水凝膠相比，該復(fù)合水凝膠不需要使用交聯(lián)劑，且在吸水率與生物力學(xué)方面與天然組織相似，提高了其生物相容性；與不含 CS 的水凝膠相比，該復(fù)合水凝膠與大鼠來(lái)源的 ADMSC 復(fù)合培養(yǎng)表現(xiàn)出更強(qiáng)的促分化能力，ADMSC 的細(xì)胞活力與軟骨分化能力明顯提升。Chen 等[47]在光交聯(lián)明膠-透明質(zhì)酸甲基丙烯酸酯 ( gelatin-hyaluronic acid methacrylate，GelHA ) 水凝膠上載入 ADMSC 后培養(yǎng)分化，并將復(fù)合水凝膠植入大鼠退變模型的椎間盤(pán)內(nèi)；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，光交聯(lián)的 GelHA 水凝膠能夠通過(guò)刺激活化整合素 αVβ6-TGF-β1 通路進(jìn)而促進(jìn) ADMSC 的髓核細(xì)胞樣分化、促進(jìn)退變椎間盤(pán)的自我修復(fù)。

生物復(fù)合材料一方面能夠提供適合干細(xì)胞生長(zhǎng)的三維結(jié)構(gòu)，另一方面可以與某些能夠促進(jìn)干細(xì)胞髓核樣分化和表達(dá)的生物因子或藥物巧妙地結(jié)合起來(lái)；如此一來(lái)，不僅能夠促進(jìn) MSC 的髓核細(xì)胞表型、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，加速對(duì)退變椎間盤(pán)的修復(fù)，而且在一定程度上克服 MSC 的成脂化和成骨化傾向，穩(wěn)定 MSC 的分化；同時(shí) ECM 逐步替代被吸收的水凝膠等可吸收生物材料，降低了 MSC 植入后的流失對(duì)治療效果的影響。隨著各類(lèi)實(shí)驗(yàn)研究的開(kāi)展，載體材料的生物相容性逐步提升、新的生物材料逐步出現(xiàn)，應(yīng)為干細(xì)胞療法在 DDD 的應(yīng)用中提供了更廣闊的空間。

當(dāng)前，初步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)以及臨床研究證明了干細(xì)胞治療 DDD 的光明前景。在對(duì)不同來(lái)源的干細(xì)胞進(jìn)行研究過(guò)程中，各類(lèi)具有誘導(dǎo)分化、促進(jìn)表達(dá)作用的生物因子的發(fā)現(xiàn)；干細(xì)胞與靶細(xì)胞作用機(jī)制的進(jìn)一步闡明；同種異體干細(xì)胞以及 IVDSC 的應(yīng)用；干細(xì)胞載體的發(fā)展不僅提高了干細(xì)胞對(duì)退變椎間盤(pán)的修復(fù)能力，也正逐步拓寬了干細(xì)胞治療退變性椎間盤(pán)的適應(yīng)證，同時(shí)豐富了干細(xì)胞的來(lái)源，為干細(xì)胞移植修復(fù)退變椎間盤(pán)及其臨床應(yīng)用打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。總的來(lái)說(shuō)，雖然干細(xì)胞當(dāng)前的臨床應(yīng)用中沒(méi)有出現(xiàn)嚴(yán)重的安全問(wèn)題且臨床效果明顯，但是大部分實(shí)驗(yàn)研究集中在臨床前階段，所以需要進(jìn)一步的對(duì)照研究、納入更多的臨床病例、進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的跟蹤隨訪來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證其療效與安全性。

鑒于干細(xì)胞在 DDD 的治療中展現(xiàn)的巨大潛力，結(jié)合當(dāng)前研究的實(shí)驗(yàn)成果與不足，未來(lái)需進(jìn)一步闡明干細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制及其與靶細(xì)胞之間的相互作用，以期發(fā)現(xiàn)更多促分化的“靶點(diǎn)”；研究如何改善退變椎間盤(pán)內(nèi)的惡劣微環(huán)境，以便為載入的干細(xì)胞提供良好的生長(zhǎng)空間；探索如何才能高效、穩(wěn)定地對(duì)不同來(lái)源的干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化，提高干細(xì)胞的生物安全性；繼續(xù)優(yōu)化干細(xì)胞植入載體的材料性能，增強(qiáng)干細(xì)胞的修復(fù)能力，避免植入過(guò)程的“二次傷害”，提高干細(xì)胞治療的臨床療效?？傊?，作為對(duì) DDD 一種新的治療辦法，干細(xì)胞治療及相關(guān)技術(shù)在未來(lái)前途一片光明。