陳章言，王 潔，黃欣愛，張 偉*

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300；2.江蘇姜曲海種豬場，江蘇泰州 225300）

沉默信息調(diào)節(jié)因子（Silence Information Regulator，Sirtuin）是一類高度保守的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD+）依賴的去乙酰化酶，在動物進化過程中其高度保守，自細菌到人類的生物機體內(nèi)均存在其同源體。Sirtuins家族共包含7 個成員（SIRT1～SIRT7），它們具有不同的亞細胞定位和功能[1-2]。SIRT3 主要定位于生物細胞線粒體中，通過與2 個關(guān)鍵的去乙?；孜铩€粒體超氧化物歧化酶（SOD2）和異檸檬酸脫氫酶2（IDH2）結(jié)合從而使相關(guān)的蛋白質(zhì)脫乙?；?，以增加活性氧自由基（ROS）清除酶活性，抑制ROS 蓄積，調(diào)節(jié)ATP 生成速率，穩(wěn)定線粒體功能[3-4]，進而參與調(diào)控動物機體的三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)以及脂肪酸β-氧化等代謝活動過程，因此SIRT3在動物機體的能量代謝和氧化應(yīng)激過程中具有重要的作用[5-6]。然而，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT3基因序列存在多態(tài)性，這種多態(tài)性與人（Homo saplens）的衰老和壽命的調(diào)控以及代謝綜合癥緊密關(guān)聯(lián)[7-9]。而針對家畜生產(chǎn)性能，有研究表明秦川牛（Bos taurus）SIRT3基因多態(tài)性與背膘厚、眼肌面積和肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)[10]；在大圍子豬SIRT3基因的第5 外顯子上存在一處A/G 突變位點，形成AA、AG 和GG 3 種基因型，AA 基因型的24 h 滴水損失、失水率和肌內(nèi)脂肪含量與AG、GG 基因型相比差異顯著，而湘村黑豬僅有肌肉色值中的亮度值在AG 和GG 基因型之間存在顯著性差異[11]。截至目前，有關(guān)豬組織臟器中SIRT3基因表達、分布定位的研究較少。本研究以蘇姜豬（Sus scrofa）為研究對象，檢測SIRT3基因的多態(tài)性與屠宰性狀和肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，并對野生型（CC）公母蘇姜豬組織中SIRT3基因表達分布進行分析，以期為蘇姜豬屠宰和肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記輔助選育提供依據(jù)，為豐富豬的SIRT3基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設(shè)計 實驗用蘇姜豬均來自江蘇姜曲海種豬場。采集60 頭成年蘇姜豬的耳組織樣，-80℃保存，用于DNA 提取及SIRT3基因多態(tài)性檢測。

根據(jù)SIRT3基因多態(tài)性檢測結(jié)果，隨機選取日齡相同（205 日齡）、健康無病的CC 型和CT 型成年蘇姜公豬（去勢）各3 頭，進行屠宰，測定屠宰性狀（眼肌面積、屠宰率、背膘厚、前區(qū)瘦肉率、中區(qū)瘦肉率、后區(qū)瘦肉率）及肉品質(zhì)指標(biāo)（pH、剪切力、系水力）；采集野生型即純合型（CC）成年蘇姜公豬（去勢）和母豬各3 頭的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸、腹脂、背最長肌、腿肌、卵巢（母豬）、輸卵管（母豬）、子宮角（母豬）14 個組織樣，每個組織3 個重復(fù)，分裝在1.5 mL Eppendorf 管中，貯存于液氮中，用于實時熒光定量檢測；同時，再采集所有上述14 個臟器組織樣置于10%中性福爾馬林溶液中固定，用于免疫組織化學(xué)檢測。

1.2SIRT3基因多態(tài)性檢測 根據(jù)NCBI 中SIRT3基因序列信息（NC_010444.4:c55074-38465），使用Primer3在線軟件和Oligo 6.31 設(shè)計引物（表1）。將蘇姜豬耳組織樣送上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司進行SIRT3基因多重PCR 高通量測序。

一輪PCR 擴增總體系為10 μL：ddH2O 3.1 μL、10×Buffer 1 μL、Prime（r50 nmol/L）2 μL、dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL、酶（5 U/μL）0.1 μL、Sample 2 μL、Mg2+（100 mM）1 μL。PCR 程序為：95℃15 min；94℃30 s，60℃10 min，72℃30 s，4 個循環(huán)；94℃30 s，60℃ 1 min，72℃30 s，20 個循環(huán)。二輪PCR 擴增總體系為21 μL：ddH2O 3.5 μL、10×Buffer 2 μL、Barcode（2 μmol/L）3.6 μL、dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL、酶（5U/μL）0.1 μL、Sample 10 μL、Mg2+（100 mmol/L）1 μL。PCR 程序為：95℃ 15 min；94℃ 30 s，60℃ 4 min，72℃ 30 s，5 個循環(huán)；94℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃ 30 s，10 個循環(huán)。

表1 SIRT3 基因多態(tài)性檢測引物序列及擴增區(qū)域

1.3 實時熒光定量PCR 根據(jù)GenBank 中豬SIRT3（登錄號：NM_001110057.1）基因序列和β-actin（登錄號：KU672525.1）作為內(nèi)參基因，采用Primer Premier 6.0和Beacon designer 7.8 軟件設(shè)計實時熒光定量PCR 引物（表2），由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)說明書，使用TRIzol（TaKaRa）提取所有受試豬各組織樣品中的總RNA。取1 000 ng 總RNA，以20 μL 反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄成cDNA。實時熒光定量PCR 反應(yīng)體系20 μL：Power SYBR?Green Master Mix 10.0 μL、Forward Primer（10 μmol/L） 0.5μL、Reverse Primer （10 μmol/L）0.5 μL、cDNA 1.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；40個循環(huán)（95℃ 15 s，63℃ 25 s），每個樣品重復(fù)3 次。利用2-ΔΔCT法計算各基因的相對表達量。

表2 實時熒光定量PCR 檢測用引物序列及擴增產(chǎn)物長度

1.4 免疫組織化學(xué)染色 將組織樣固定于10%中性福爾馬林溶液，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋，5 μm 厚切片。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化處理后，用Tris-EDTA（pH=9）抗原修復(fù)，微波加熱10 min，自然冷卻至室溫后，TBS 洗滌3 次，用3% H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶之后以5% BSA 于37℃封閉30 min，棄掉封閉液，使用SIRT3 抗體（CST，1:250）作為一抗4℃孵育過夜。使用HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（南京生興生物技術(shù)有限公司，sn134，1:100）作為二抗識別特異性一抗，DAB 顯色液顯色，之后，以蘇木精復(fù)染細胞核后，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

1.5 統(tǒng)計分析 各組織中SIRT3mRNA 相對表達量以β-actin作為內(nèi)參基因，矯正不可控制因素，歸一化起始組織量，并定義心臟組織中的表達水平為1，以對SIRT3mRNA 在不同組織中的表達水平進行相對定量。所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準差表示，使用SPSS 19.0 軟件的單因素方差分析（ANOVA）、獨立樣本t檢驗和χ2檢驗進行差異顯著性和群體遺傳平衡性分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 蘇姜豬SIRT3基因多態(tài)性及群體遺傳分析

2.1.1 蘇姜豬SIRT3基因多態(tài)性檢測 通過對60 頭蘇姜豬耳組織樣進行SIRT3基因重測序檢測，分別在外顯子1 區(qū)的314 位點（T →A）和內(nèi)含子6 區(qū)的14 589位點（C →T）存在堿基突變（圖1）。將外顯子1 處的突變位點與GenBank 中豬XM_005652976.3 序列比對，結(jié)果顯示這一堿基位點位于5’非翻譯區(qū)（5’UTR）。

圖1 蘇姜豬SIRT3 基因堿基突變位點

2.1.2 蘇姜豬SIRT3基因多態(tài)性群體遺傳分析 由表3 可以看出，在所檢測的60 頭蘇姜豬群體中，SIRT3基因314 位點僅檢測出1 頭蘇姜豬為雜合型TA，其他蘇姜豬均為純合型TT；14 589 位點檢測到純合型CC（48 頭）和雜合型CT（12 頭）個體。2 個多態(tài)位點的He 均較低，PIC 值均小于0.25，為低度多態(tài)，表明該群體遺傳變異不高。經(jīng)χ2檢驗，這2 個堿基突變位點在所選擇的蘇姜豬群體中均處于哈迪-溫伯格遺傳平衡（P＞0.05）。

表3 蘇姜豬群體中SIRT3 基因多態(tài)分布

2.2 蘇姜豬SIRT3多態(tài)性與屠宰性能及肉品質(zhì)間相關(guān)性分析 因SIRT3基因314 位點僅檢測出1 頭蘇姜豬為雜合型TA，故本研究未進行該位點不同基因型與屠宰性能和肉品質(zhì)間相關(guān)性分析，只進行SIRT3基因14 589 位點純合型CC（48 頭）和雜合型CT（12 頭）蘇姜豬屠宰性能和肉品質(zhì)間相關(guān)分析。

由表4 可以看出，6 項屠宰指標(biāo)在純合型（CC）和雜合型（CT）蘇姜豬公豬間差異均不顯著，表明2種基因型蘇姜豬的產(chǎn)肉性能無明顯差別；在肉品質(zhì)指標(biāo)中，純合型（CC）蘇姜豬肉的剪切力顯著高于雜合型（CT），表明雜合型蘇姜豬豬肉嫩于純合型，然而系水力和pH 則在不同基因型蘇姜豬肉間差異不顯著。

表4 蘇姜豬SIRT3 基因14 589 位點不同基因型屠宰性狀和肉品質(zhì)指標(biāo)

2.3 蘇姜豬組織中SIRT3mRNA 表達量分析 因CC型和CT 型蘇姜豬在產(chǎn)肉性能方面無顯著差別，因此不進行這2 種基因型蘇姜豬組織中SIRT3mRNA 表達量檢測分析，只進行野生型（CC）公母蘇姜豬組織中SIRT3mRNA 表達量差異檢測分析。由圖2 可知，在公豬的11 個組織和母豬的14 個組織中均存在SIRT3mRNA 表達。經(jīng)統(tǒng)計分析，SIRT3mRNA 在公豬的胃組織中表達量相對最高，顯著高于心臟、肝臟、大腸、背最長肌、腿肌組織；母豬則肝臟組織中的表達量相對最高，顯著高于除心臟、大腸、背最長肌、胃組織外的其他組織。其中，公母豬的脾臟組織中SIRT3mRNA表達量均相對最低。除肝臟和脾臟組織外，公豬各組織中SIRT3mRNA 相對表達量均較高于母豬，其中，公豬的腎臟和胃組織中表達量顯著高于母豬。

圖2 蘇姜豬不同組織臟器中SIRT3 mRNA 相對表達量

2.4 SIRT3 蛋白在蘇姜豬組織中的定位分布 經(jīng)免疫組織化學(xué)檢測，在蘇姜豬各臟器組織中均檢測到SIRT3免疫陽性顆粒。由圖3 可知，SIRT3 免疫陽性顆粒主要分布于各組織細胞的細胞質(zhì)中。在肌肉組織（心肌、腿肌和背最長?。┑募〖毎?、肝臟的肝細胞、腎臟的近曲小管和遠曲小管細胞、肺臟組織的肺泡細胞以及細支氣管粘膜層細胞中有較豐富的SIRT3 免疫陽性顆粒分布；脾臟組織中SIRT3 免疫陽性顆粒分布較少，僅在紅髓細胞中有分布；在消化系統(tǒng)的胃、小腸和大腸組織中，SIRT3 免疫陽性顆粒主要分布于黏膜層上皮細胞及固有層腺細胞中；在母豬生殖系統(tǒng)中，SIRT3 免疫陽性顆粒主要分布于卵巢卵泡的顆粒細胞和卵母細胞，輸卵管和子宮組織的粘膜層上皮細胞中。

圖3 蘇姜豬組織中SIRT3 免疫陽性顆粒分布

3 討 論

SIRT3 為NAD+依賴的去乙?；?，通過使蛋白質(zhì)被乙?；揎梾⑴c機體的三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)、脂肪酸β-氧化等代謝過程，在動物機體物質(zhì)代謝和能量代謝中具有重要的作用。有研究報道表明，SIRT3基因存在堿基突變，這種突變會影響秦川牛和湘村黑豬的產(chǎn)肉性能[10-11]。本研究在蘇姜豬SIRT3基因的外顯子1 和內(nèi)含子6 區(qū)分別檢測到T →A 和C →T 的堿基突變，而與大圍子豬和湘村黑豬的研究結(jié)果[11]不同，未在第5 外顯子區(qū)檢測到堿基突變。本研究結(jié)果顯示，僅純合型（CC）蘇姜豬肉的剪切力顯著高于雜合型（CT），其他屠宰指標(biāo)及肉品質(zhì)指標(biāo)均無顯著差異，表明雜合型（CT）蘇姜豬的肉質(zhì)嫩于純合型（CC），可作為后續(xù)蘇姜豬肉質(zhì)進一步選育提高的候選基因。

SIRT3在豬組織中的表達具有廣譜性，如通城豬、湘村黑豬和大圍子豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉等組織中均檢測到SIRT3mRNA 的表達[11-12]。本研究在蘇姜豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃、大腸、小腸、腹脂、背最長肌、腿肌、卵巢、輸卵管、子宮等14 個組織中均檢測到SIRT3mRNA 的表達，其中，在胃、心臟、腿肌、背最長肌和肝臟組織中的表達量相對較豐富，脾臟組織中SIRT3mRNA 的表達量相對最低，這與相關(guān)報道中提出的在動物代謝旺盛的組織如肌肉、肝臟、心臟中有較高的表達結(jié)果相同[5-6]。對比公母蘇姜豬各組織中SIRT3mRNA 表達量差異，結(jié)果顯示除蘇姜母豬的肝臟和脾臟組織中SIRT3mRNA表達量稍高于公豬外，其他組織中的表達量均相對低于公豬，特別是在母豬胃和腎臟組織中的表達量顯著低于公豬，表明SIRT3mRNA 在動物機體組織中的表達量與性別有關(guān)。

SIRT3 蛋白主要定位于動物機體組織細胞質(zhì)的線粒體中，其表達對于ATP 的生成具有重要作用[4,11]。如在肝臟組織中，SIRT3 參與動物尿素循環(huán)和脂肪酸的合成與分解等代謝活動，通過去乙?；鰪娤匏倜窴88 活性，進一步增強尿素循環(huán)，而在能量限制或饑餓時，SIRT3可以在線粒體中直接脫掉OTC 上的乙?；险{(diào)其活性，增加尿素生成[13]。特異性敲除肝臟SIRT3基因的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)脂肪酸氧化中間產(chǎn)物和甘油三酯顯著升高，LCAD（Long-chain acy1 CoA dehydrogenase） 第42 號賴氨酸呈現(xiàn)高度乙?；?，酶活性顯著降低，最終導(dǎo)致ATP 水平下降，進一步促進肝臟中脂肪沉積，使肝細胞的死亡速度加快[14]。而肌肉組織中缺失SIRT3的小鼠則表現(xiàn)出耗氧量減少，并出現(xiàn)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致胰島素信號受損，心臟、腎臟和肝臟中的ATP 水平下降幅度超過50%[15]。本研究通過免疫組織化學(xué)方法在蘇姜豬14 個臟器組織的細胞中均檢測到SIRT3 免疫陽性顆粒，特別是在SIRT3mRNA 表達量相對較豐富的心臟、胃、肌肉、肝臟和腎臟組織細胞質(zhì)中有豐富的SIRT3 免疫陽性顆粒。這些組織中ATP 水平較高，SIRT3 可通過調(diào)節(jié)代謝酶來決定ATP 的生成速率[5-6,11]。在蘇姜豬腎臟組織中，SIRT3 蛋白主要分布于需要較多能量進行吸收和分泌功能的近曲小管和遠曲小管細胞中，而在具有血液過濾器作用的腎小球中免疫陽性顆粒較少。動物消化器官的消化腺細胞從其周圍的血液中攝取原料，合成分泌物后貯存或在受到適宜刺激時排出分泌物，這一分泌過程為主動活動過程，整個分泌過程需要消耗能量，這些能量主要來自腺細胞內(nèi)的ATP。本研究在蘇姜豬消化系統(tǒng)的胃、小腸和大腸組織的腺細胞中均檢測到豐富的SIRT3 免疫陽性顆粒，表明SIRT3與細胞的分泌功能有關(guān)。在蘇姜豬母豬生殖系統(tǒng)組織中，SIRT3 免疫陽性顆粒主要分布于卵巢的卵泡顆粒細胞、卵母細胞和生殖道的輸卵管、子宮組織的粘膜層上皮細胞中，這表明SIRT3參與卵子的成熟過程，且與生殖道黏膜層細胞的分泌活動有關(guān)聯(lián)。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，蘇姜豬SIRT3基因在外顯子1 區(qū)和內(nèi)含子6 區(qū)分別存在1 處堿基突變，其中內(nèi)含子6 區(qū)的堿基突變顯著影響蘇姜豬豬肉的剪切力，表明SIRT3基因為進一步提高蘇姜豬肉品質(zhì)的候選基因。SIRT3mRNA 在蘇姜豬脾臟組織中的表達量相對最低，在檢測的器官組織中，除肝臟和脾臟外公豬的表達量相對高于母豬；SIRT3 免疫陽性顆粒主要分布于蘇姜豬的肝臟細胞、肌肉細胞和黏膜層細胞，在母豬卵巢顆粒細胞和卵母細胞中也有豐富表達，表明SIRT3主要參與動物機體細胞的物質(zhì)、能量代謝以及卵子的成熟過程。