柏 瑪，胡明軍，楊遠瀟，趙文仕，江明鋒

（1.云南香格里拉市畜牧獸醫(yī)局飼料草山站，云南香格里拉 674499；2.西南民族大學青藏高原研究院，四川成都 610041；3.西南民族大學生命科學與技術學院，四川成都 610041）

低氧適應性是指機體在低氧環(huán)境、高原低氧以及疾病導致機體氧獲得和運送出現(xiàn)障礙時，為維持基本生命活動所建立的一套保護性機制。機體對低氧的適應除器官功能的變化外，還可能通過調整低氧誘導因子和細胞代謝來完成[1]。調控低氧信號傳導的主要轉錄因子是低氧誘導因子-1（Hypoxia-inducible Factors-1，HIF-1），該因子先由Semenza 等[2]于1992 年在缺氧誘導的細胞核抽提物中發(fā)現(xiàn)。HIF-1 是一個小轉錄因子家族，高度保守，主要介導細胞在低氧環(huán)境下的應答，可以促進血管分化，對胚胎和腫瘤中血管的形成十分重要[2]。HIF-1 轉錄因子主要有HIF-1α、HIF-1β、HIF-2α、HIF-2β、HIF-3α、HIF-3β共6 個成員。其中，HIF-1α和HIF-3α被認為與低氧誘導反應直接相關。在氧氣含量正常的組織中HIF-1α的表達水平較低，但在組織缺氧時，HIF-1α表達水平顯著上調且其表達水平受其富含GC 序列元件的啟動子調控[3]；HIF1AN 是HIF-1α的抑制蛋白，可降低HIF-1α的表達水平。HIF-3α也被認為與低氧適應反應有關，是低氧誘導基因表達的負抑制因子[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1 起著核信號的作用[5]，共有100多種低氧相關基因受到HIF-1 的調節(jié)。如促紅細胞生成素（Erythropoietin，EPO）作為HIF-1的一個下游基因，其表達受到HIF-1 的調控。在缺氧缺血的體外模型中，EPO 以劑量依賴的方式抑制HIF-1基因的表達[6]。缺氧作為一種普遍刺激，影響著許多生理過程，如許多生活在海平面上的人患有慢性間歇性缺氧（IH），這是一種由睡眠呼吸暫停導致的心血管和呼吸系統(tǒng)疾病。研究表明，DNA 甲基化改變是由慢性IH 引起的病理變化，并可能影響缺氧誘導因子信號[7]。Dewi 等[8]研究還發(fā)現(xiàn)，在正常（非低氧）情況下，EPO啟動子增強子區(qū)的甲基化降低了EPO基因的轉錄活性。Xiong[9]等研究表明，牦牛心、肝、脾、腎和肺等組織中的HIF-1α和HIF-2α基因表達量均顯著高于普通牛，牦牛這些組織中HIF-1α和HIF-2α基因增強子區(qū)的甲基化水平顯著低于普通牛。青藏高原是天然的低氧環(huán)境，世居的哺乳動物經過長期的進化形成特有的耐低氧機制[10]。但導致這一系列現(xiàn)象的分子機制仍不清楚，需要進行深入研究。本項目研究了牦牛心、肝、肺、腦、肌肉等組織中EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN4 個基因啟動子區(qū)域的甲基化程度對其表達的影響，旨在進一步探明牦牛低氧適應的分子機制。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 在四川省紅原縣龍日種畜場采集3 頭健康成年公牦牛的心、肺、腦、肝臟和肌肉組織，迅速放入液氮中保存。

1.2 牦牛不同組織總DNA 的提取 采用AxyPrep 基因組DNA 小量試劑盒（AXYGEN，Union city，USA），按說明書步驟提取牦牛各組織樣品總DNA，用紫外分光光度計進行定量。

1.3 亞硫酸鹽測序 采用甲基化試劑盒EZ DNA Methyl ation-KitTM（ZYMO RESEARCH，Los Angeles，USA）對DNA 進行處理，詳細步驟參見試劑盒說明書，處理后的DNA 于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因啟動子克隆 根據(jù)普通牛EPO基因（NM_173909）、HIF-1α基因（NM_174339）、HIF-3α基因（NM_001105342）以及HIF-1AN基因（NM_001083443）的啟動子序列設計擴增相應基因啟動子的引物（表1）。以亞硫酸鹽修飾后的DNA 為模板進行擴增，25 μL PCR 體系：模板2 μL（80 ng）、10×buffer 2.5 μL、EX-Taq（TaKaRa）0.2 μL（1 U），上下游引物各1 μL（10 pmol/L）。擴增條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30 s、退火30 s、72℃延伸2 min 進行35 個循環(huán)后72℃繼續(xù)延伸7 min、4℃保存。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收相應目的DNA 片段。

1.5 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因啟動子甲基化分析 利用www.urogene.org/methprimer 網(wǎng)站在線生物信息學軟件分析克隆的4 個基因的啟動子序列，對其核心啟動子序列及位置進行分析。用不同組織提取的基因組DNA 作模板進行PCR 擴增，PCR 產物用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測?；厥障鄳康腄NA片段，并連接到PMD19-T 載體上。挑取重組子測序，然后進行序列分析，檢測各個核心啟動子區(qū)段的甲基化數(shù)目。

1.6 總RNA 的提取與cDNA 合成 將采集的牦牛心、肺、腦、肝臟和肌肉組織各0.6 g 放入預先用液氮冷卻的研缽內，研磨成粉，然后加入Trizol Reagent（Invitrogen，Cakifornia,USA）提取總RNA。采用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser DRR047A（TaKaRa，中國大連）試劑盒進行反轉錄反應，以Oligo dT 為引物合成第一鏈cDNA，反轉錄反應程序為37℃ 15 min，85℃5 s，然后4℃保存，得到的cDNA 作為qPCR 實驗的模板，置于-80℃冰箱備用。

1.7 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因的組織表達研究 根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫中普通牛EPO、HIF-1α、HIF-3α、HIF-1AN、β-actin、GAPDH基因序列（登錄號見1.4）設計qRT-PCR 引物用于相應基因的組織表達研究（表2）。用BIO-RAD CFX96 熒光定量PCR 儀篩選出RT-qPCR 的最適溫度后，以牦牛的心臟、肝臟、肺、腦、肌肉組織cDNA 為模板，采用10 μL反應體系：SsoFastTM EvaGreen?Supermix 5 μL、上下游引物各0.5 μL（10 pmol/L）、cDNA 1 μL（0.5 μg）、ddH2O 3 μL 進行qRT-qPCR，每個樣本均設置3 個重復，檢測各基因的表達量。反應程序：95℃ 10 min、95℃15 s、最適溫度1 min，40 個循環(huán)；95℃ 15 s、65℃ 5 s。以β-actin 基因和GAPDH基因作為內參基因，取平均值，用2-△△Ct法計算各基因表達量。

1.6 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 軟件進行分析。不同組織間mRNA 相對表達量差異采用方差分析進行檢驗，甲基化率差異采用χ2檢驗。

2 結果與分析

2.1 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN4 個基因啟動子克隆 圖1 及測序結果表明，EPO基因啟動子長870 bp，HIF-3α基因啟動子長1 067 bp，HIF-1α基因啟動子長1 067 bp，HIF-1AN基因啟動子長1 669 bp。EPO、HIF-1α、HIF-3α及HIF-1AN核心啟動子序列分析結果顯示，EPO基因啟動子中含有1 個核心區(qū)段，HIF-1α、HIF-3α、HIF-1AN基因啟動子各含有2 個核心啟動子區(qū)段。

表1 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因啟動子克隆引物

表2 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因qRT-PCR 引物

圖1 牦牛低氧適應相關基因啟動子PCR 產物瓊脂凝膠電泳圖

2.2 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因核心啟動子甲基化檢測 牦牛EPO基因核心啟動子序列全長127 bp，包含8 個CpG 島，在腦組織中的甲基化水平顯著高于心臟和肌肉組織（圖2）。由表3 可知，EPO基因在心臟、肌肉和腦組織中，CpG 島發(fā)生甲基化的位點分別有4、10 個和18 個，EPO基因在牦牛心、肌肉、腦的甲基化率分別為8.3%、20.8%、45.0%，牦牛腦中的甲基化率顯著高于心臟和肌肉組織。

牦牛HIF-1α基因核心啟動子有2 段序列，長度分別為221 bp 和117 bp，包含24 個CpG 島。HIF-1α基因在肝、心臟和肌肉組織中甲基化的CpG 島數(shù)目為：3個、12 個和17 個（表3）。HIF-1α基因的核心啟動子在肝臟、心臟和肌肉的甲基化率分別為2.5%、8.5%、12.1%，且在牦牛肌肉中的甲基化率極顯著高于心臟和肝臟。

圖2 EPO 基因核心啟動子在組織中的甲基化位點圖

牦牛HIF-3α基因核心啟動子有2 段序列，長度分別為252 bp 和163 bp，包含22 個CpG 島。HIF-3α基因在心臟、腦和肝組織中甲基化的CpG 島數(shù)目為：6 個、10 個和14 個（表3），其核心啟動子在心臟、腦和肝臟中的甲基化率分別為5.5%、9.1%、12.7%，且在牦牛肝臟中的甲基化率極顯著高于心臟和腦。

牦牛HIF-1AN基因核心啟動子有2 段序列，長度分別為271 bp 和167 bp，包含20 個CpG 島。HIF-1AN基因在心臟、腦和肺組織中甲基化的CpG 島數(shù)目為：21、68 個和87 個（表3）。HIF-1AN基因的核心啟動子在心、腦和肺中的甲基化率分別為22.8%、69.4%、87.0%，并且在牦牛肺中的甲基化率極顯著高于心臟和腦。

2.3 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因的組織差異表達分析 由圖3 可知，EPO基因的表達水平除在肺和肌肉之間差異不顯著外，在其余組織間差異極顯著；牦牛HIF-1α基因在肝組織和腦組織間差異顯著，其余組織間差異極顯著；HIF-3α基因在肺和肌肉組織間差異顯著，其余組織間差異極顯著；HIF-1AN基因在肝臟和肌肉組織差異不顯著，肝臟和肌肉組織與腦組織間差異顯著，其余組織間差異極顯著。

表3 牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因核心啟動子的甲基化率分析

圖3 EPO、HIF-1α、HIF-3α 和HIF-1AN 基因在牦牛不同組織的表達量

3 討 論

對低海拔地區(qū)的動物而言，長期暴露在較嚴重的缺氧環(huán)境中對機體是有害的。高原世居動物則不受低氧環(huán)境的損害，表明高原世居動物已經完全適應高原低氧的生態(tài)環(huán)境。本研究發(fā)現(xiàn)，EPO基因在牦牛心臟的表達量最高，其次是肺、肌肉和肝臟，在腦組織中表達量最低。缺氧是EPO基因轉錄水平增加的主要原因。對EPO基因的表達和調控起最主要作用的是[A/G]CGTG 序列，其編碼基因vegf和EPO啟動子區(qū)域已被證實均含有低氧效應原件（HRE），表明EPO基因是受HIF-1 調控的靶基因[10-11]；HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因在牦牛不同組織表達差異顯著。在缺氧環(huán)境中，HIF-1α亞基的降解途徑被抑制，大量的HIF-1α蛋白積累并結合HIF-1β形成具有活性的HIF-1 因子。目前，已經發(fā)現(xiàn)3種HIF-α/β亞基的類型。HIF-1α/β被認為是介導缺氧誘導因子表達的主要調控因子。HIF-1 廣泛存在于大多數(shù)組織中，而HIF-2 主要在高度血管化的器官和組織中表達[12]。Naik 等[13]研究發(fā)現(xiàn)HIF-1AN作為HIF-1α抑制因子，能夠抑制HIF-1α基因的轉錄活性，同時形成體外小管和遷移細胞。Li 等[14]在人的Ⅱ型肺細胞研究過程中發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與HIF-3α基因在表達模式和應答方式上具有一致性，這說明二者在功能上可能起著互補的作用，共同確保細胞在低氧的環(huán)境中正常運轉。

造成這3 個基因在不同組織表達出現(xiàn)差異的原因可能是相關基因啟動子區(qū)域甲基化程度不一。由于啟動子區(qū)域的高度甲基化，使它們在有些組織中沉默。本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α和HIF-1AN基因在不同組織間的表達量存在差異。HIF-1能夠誘導靶基因在紅細胞和組織中表達，同時抑制如EPO等有關基因的表達。EPO作為HIF-1的靶基因，當?shù)脱鯐rHIF-1α表達水平增加，HIF-1α從胞漿移入胞核，與胞核內HIF-1β結合產生HIF-1，并與靶基因HRE 中HIF-1 結合點結合，促進EPO轉錄，引起一系列細胞對缺氧的反應[15]。長時間處于低氧環(huán)境下，上調HIF-1 活性可以使細胞在低氧狀況下的生存能力提高，并生成大量組織血管[16]。組織中氧供給和利用在達到平衡之前，HIF-1基因的mRNA一直被表達，直到新的平衡建立。在新平衡建立后，若給予更進一步的低氧刺激，HIF-1基因的mRNA 水平又明顯增加[17]，這說明HIF-1基因的mRNA 與缺氧程度存在明顯的依存關系。

為了研究牦牛組織中EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因差異表達的遺傳學機制，本文擴增了牦牛4 個基因啟動子區(qū)序列并進行了甲基化檢測，結果發(fā)現(xiàn)EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN等低氧相關基因的啟動子區(qū)域在不同組織中的甲基化率存在顯著差異。牦牛HIF-1AN基因啟動子區(qū)域的甲基化率顯著高于其他3 個基因。結合4 個基因在相關組織的表達量來看，表達量高的組織如心臟，甲基化率低。與此相反，表達量低的組織相關基因啟動子區(qū)域的甲基化率高，這說明基因啟動子甲基化影響轉錄因子與啟動子區(qū)域結合，進而抑制其表達。本實驗還發(fā)現(xiàn)HIF-1AN基因在組織中的表達顯著高于其他3 個基因，進一步說明甲基化可能是導致牦牛組織中低氧適應相關基因表達下調的機制之一。這與Xiong 等[9]和Reik[18]發(fā)現(xiàn)的基因甲基化水平與表達量的關系一致。在人類癌癥中，腫瘤與正常的細胞相比，甲基化水平發(fā)生很大的變化，在腫瘤的發(fā)生過程中基因組DNA 呈現(xiàn)整體低甲基化和局部高甲基化特點[19]。這可能是HIF-1甲基化導致原癌基因的過度表達和正?；虺聊a生的后果。隨著缺氧組織適應性研究的進展，低氧核心調節(jié)因子HIF-1所誘導的一系列低氧反應效應基因及其有關甲基化的研究，將為缺氧組織的適應性及人類疾病帶來福音。

4 結 論

本研究首次發(fā)現(xiàn)牦牛EPO、HIF-1α、HIF-3α和HIF-1AN基因在心、肝、肺、腦、肌肉等5 個組織的表達量與其啟動子的甲基化率存在負相關，基因表達量受甲基化水平的影響，本研究結論為牦牛低氧適應領域的研究奠定了基礎。