肖紅梅，梁加越，馮 娟，胡小玉，樊曉娟，王笑冰

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

microRNA 是真核生物中存在的短序列非編碼RNA家族[1]，其許多家族成員是調(diào)控絨山羊絨毛生長的WNT、TGF-β、FGF 等分子信號(hào)通路中的重要因子[2-3]。它們通過5'端的6～8 個(gè)種子序列堿基與其靶向基因3'-UTR 堿基結(jié)合成互補(bǔ)序列，引起靶向mRNA 降解或抑制翻譯調(diào)節(jié)基因表達(dá)[4]，從而調(diào)控絨山羊毛囊發(fā)育及絨毛生長[5-8]。Hu 等[9]、張桂山等[10]研究表明，miR-1298 的作用是通過靶向抑制Cx43基因表達(dá)，調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞功能。miR-1298-5p 為miR-1298 的一個(gè)亞型，是應(yīng)用高通量測(cè)序獲得的絨毛生長周期中差異的miRNA，其在不同品種羊毛囊發(fā)育中與TGF-βR1基因存在潛在的靶向關(guān)系[11]，但有關(guān)miR-1298-5p 的作用研究較少。TGF-β是轉(zhuǎn)化生長因子超家族[12-14]，TGF-βR1是TGF-β的一個(gè)重要跨膜受體糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為53 000 u，在成熟皮膚毛囊中表達(dá)，并且在毛發(fā)發(fā)育周期和部位具有表達(dá)的特異性[15]，主要作用是參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[16-17]。當(dāng)細(xì)胞外的信號(hào)分子與跨膜蛋白TGF-βR2結(jié)合后，TGF-βR1磷酸化形成四聚體，將信號(hào)傳至細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞生理性活動(dòng)，調(diào)控動(dòng)物毛發(fā)的生長[18]。目前，TGF-βR1基因?qū)q山羊絨毛生長的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過qPCR 方法對(duì)miRNA-1298-5p 和TGF-βR1基因在內(nèi)蒙古絨山羊絨毛不同生長時(shí)期的表達(dá)規(guī)律進(jìn)行研究并探討二者對(duì)絨毛生長的作用，為在選育過程中改善絨毛品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 選取內(nèi)蒙古伊克昭盟絨山羊場(chǎng)放牧條件下體重相同的1.5 歲阿爾巴斯白絨山羊3 只，在絨毛生長的休止期（2 月）、生長初期（4 月）、生長旺盛期（8 月）和退行期（12 月）采集軀干部體側(cè)中線距肩胛骨10～15 cm 處約3 cm 直徑的皮膚，經(jīng)PBS 液快速?zèng)_洗后保存于液氮罐中用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 試劑 TRIZOL、氯仿、異丙醇、無水乙醇、RNasefree 純水、DEPC、6×DNA Loading Buffer、Gold View核酸染色劑、Agarose、50×TAE、DNA Marker、Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（反轉(zhuǎn)錄試劑盒）、FastSuper Eva Green qPCR 均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 儀器 迷你水平電泳槽（北京白晶生物技術(shù)有限公司）、羅氏LC96 定量PCR 儀（北京科譽(yù)興業(yè)科技發(fā)展有限公司）、冷凍高速離心機(jī)（Thermo Fisher）、ELITE 電泳儀、ND2000 紫外分光光度計(jì)（Gene Company Limited 基因有限公司）、微型離心機(jī)（SCILOGEX）、PCR 儀（Wealtec Corp）。

1.4 方法

1.4.1 引物設(shè)計(jì) 選取S-18S為內(nèi)參基因，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中miR-1298-5p、TGF-βR1的mRNA 序列，利用Primer 5 設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物序列，引物由愛博生物股份有限公司合成（表1）。

表1 引物序列

1.4.2 RNA 提取及cDNA 合成 將不同時(shí)期的阿爾巴斯白絨山羊絨毛生長的皮膚樣本用液氮研磨后，使用試劑盒提取各月份總RNA，后用DL2000 紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠檢測(cè)其純度和濃度。對(duì)檢測(cè)后的RNA 在20 μL 體系（包括：5×Reation Buffer 4 μL、RNA 5 μL、RibolockRnase Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTP Mix 2 μL、RevertAid M-MulV RT 1 μL、Nuclease-Free Water 7 μL；反應(yīng)程序：42℃ 60 min，70℃ 5 min）的PCR 儀上合成cDNA，并于-80℃保存。

1.4.3 qRT-PCR 檢測(cè) 利用SYBR Green 技術(shù)進(jìn)行qRTPCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系：2×Fast Super EvaGreen Master Mix 10 μL、上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL、cDNA模板2 μL、ddH2O 6.4 μL；反應(yīng)程序：95℃ 2 min，1 循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45 循環(huán)。每個(gè)樣本均重復(fù)3 次，內(nèi)參基因選擇S-18S基因。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 用△△Ct 法對(duì)miRNA-1298-5p 及其靶基因TGF-βR1進(jìn)行相對(duì)定量并運(yùn)用SPSS 20.0 軟件對(duì)阿爾巴斯白絨山羊皮膚各月份的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 RNA 提取 經(jīng)紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，提取的阿爾巴斯白絨山羊絨毛不同生長時(shí)期的皮膚RNA 質(zhì)量較好，28 S 條帶亮度較18 S 條帶亮度亮（圖1），A260/A280在1.8～2.0（表2），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 阿爾巴斯白絨山羊絨毛不同生長期皮膚RNA 電泳檢測(cè)

表2 阿爾巴斯白絨山羊絨毛不同生長期皮膚RNA 吸光值

2.2 miRNA-1298-5p 的相對(duì)表達(dá)量 以內(nèi)參基因S-18S為對(duì)照，利用qPCR 對(duì)miRNA-1298-5p 在阿爾巴斯白絨山羊絨毛生長的各個(gè)月份的皮膚表達(dá)進(jìn)行擴(kuò)增，得到了較好的熔解曲線（圖2），熔解曲線圖顯示擴(kuò)增產(chǎn)物單一。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)用△△Ct 法通過統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行相對(duì)定量（圖3）。相對(duì)定量結(jié)果表明，miR-1298-5p 在內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊絨毛不同發(fā)育時(shí)期皮膚中的表達(dá)不同，其中退行期（12 月）相對(duì)表達(dá)量最高，為休止期（2 月）的1.31 倍；生長初期（4 月）和生長旺盛期（8 月）相對(duì)表達(dá)量較少，分別為休止期的0.240 倍和0.507 倍；各月份間相對(duì)表達(dá)量存在極顯著差異。

2.3TGF-βR1基因的相對(duì)表達(dá)量TGF-βR1基因在阿爾巴斯白絨山羊絨毛不同發(fā)育時(shí)期的皮膚表達(dá)qRTPCR 擴(kuò)增結(jié)果顯示（圖4），擴(kuò)增效果較好、產(chǎn)物單一。對(duì)擴(kuò)增結(jié)果應(yīng)用△△Ct 法通過統(tǒng)計(jì)分析表明（圖5），TGF-βR1基因在阿爾巴斯白絨山羊皮膚絨毛不同發(fā)育時(shí)期的mRNA 除了2 月與4 月表達(dá)量無顯著差異外，其他月份間表達(dá)量存在極顯著差異。其中8 月表達(dá)量最高（生長旺盛期）,為休止期的2.639 倍；12 月（退行期）表達(dá)量最低，為休止期的0.493 倍。推測(cè)TGF-βR1基因在絨毛生長過程中起重要作用。

圖2 miR-1298-5p 和S-18S 基因在阿爾巴斯白絨山羊絨毛生長不同時(shí)期皮膚qPCR 熔解曲線

圖3 miR-1298-5p 在阿爾巴斯白絨山羊絨毛生長不同時(shí)期皮膚相對(duì)表達(dá)量

3 討 論

3.1 miRNA-1298-5p 表達(dá)研究 miRNA 是新近發(fā)現(xiàn)的在絨山羊毛囊發(fā)育及絨毛生長過程中起重要調(diào)控作用的一類小分子，如Liu 等[5]采用高通量技術(shù)鑒定出絨山羊毛囊保守miRNA 為316 個(gè)、新miRNA 22 個(gè)；Yuan 等[19]鑒定出保守miRNA 為399 個(gè)，在毛囊發(fā)育3 個(gè)不同時(shí)期共表達(dá)的為36 個(gè)，在3 個(gè)不同時(shí)期特異性表達(dá)的為3個(gè)。曲海娥[20]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-125b 通過負(fù)調(diào)控靶基因FGFR2和MXD4來調(diào)控絨山羊皮膚毛囊發(fā)育。鑒于miRNA 的作用，本研究結(jié)果顯示，miRNA-1298-5p 在絨毛生長的退行期表達(dá)最高，在生長期表達(dá)最低；表達(dá)量與絨毛生長趨勢(shì)相反，即表達(dá)量由退行期經(jīng)過休止期向生長期逐漸降低；而在生長期中，絨毛生長初期（4 月）miRNA-1298-5p 的表達(dá)量顯著低于生長旺盛期（8 月）。原因在于生長初期是絨毛生長下一輪周期的開始，舊的毛囊逐漸消亡和脫落，新生的毛囊數(shù)量較少，調(diào)節(jié)絨毛生長的各因子在皮膚中的相對(duì)表達(dá)量較少；隨著時(shí)間的推移，到生長旺盛期，毛囊發(fā)育活躍，新生毛囊數(shù)量增多，調(diào)節(jié)絨毛生長的各因子相對(duì)表達(dá)量增大并高于生長初期。綜觀miRNA-1298-5p 在絨毛生長4 個(gè)時(shí)期皮膚相對(duì)表達(dá)量的變化，推測(cè)miRNA-1298-5p 是絨毛生長的重要影響因子，可能抑制絨毛的生長發(fā)育，但這一作用需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖4 TGF-βR1 基因和S-18S 基因在阿爾巴斯白絨山羊皮膚絨毛生長不同時(shí)期qPCR 熔解曲線

圖5 TGF-βR1 基因在阿爾巴斯白絨山羊絨毛生長不同時(shí)期皮膚相對(duì)表達(dá)量

3.2TGF-βR1基因表達(dá)研究TGF-β是具調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種功能的因子，其所在的TGF-β信號(hào)通路參與絨山羊毛囊的發(fā)育，成為近年來研究的熱點(diǎn)。TGF-β有3 種受體，即TGF-βR1、TGF-βR2和TGF-βR3[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-βR1基因在內(nèi)蒙古阿爾巴斯白絨山羊絨毛生長的旺盛期毛囊發(fā)育活躍，TGF-βR1基因表達(dá)量高；退行期由于外界環(huán)境氣候逐漸變冷，毛囊發(fā)育及絨毛生長趨于減慢甚至停滯，TGF-βR1基因表達(dá)量降低；休止期雖然舊的毛發(fā)脫落，部分毛囊萎縮，但新的毛囊正在孕育，TGF-βR1基因表達(dá)量相比退行期要高，推測(cè)TGF-βR1基因促進(jìn)毛囊的發(fā)育。Foitzik 等[22]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，敲除TGF-βR1基因的小鼠毛囊由生長期向退行期轉(zhuǎn)變緩慢，當(dāng)注射TGF-βR1基因時(shí)，毛囊的退行期提前，說明TGF-βR1基因在小鼠毛囊由生長期向退行期轉(zhuǎn)變過程的重要作用。TGFβR1在內(nèi)蒙古絨山羊絨毛生長周期中是否具有同樣作用有待進(jìn)一步研究。

3.3 miRNA-1298-5p 與TGF-βR1基因的關(guān)系 絨毛的產(chǎn)量與質(zhì)量是絨山羊重要的經(jīng)濟(jì)性狀，由于受到毛囊發(fā)育過程中不同分子的調(diào)控，基因表達(dá)在絨毛生長不同時(shí)期存在很大的差異[23]。其中，miRNA 通過與靶向基因3'端非編碼區(qū)序列的特異性互補(bǔ)結(jié)合而調(diào)控靶基因表達(dá)。張桂山等[11]對(duì)遼寧絨山羊和細(xì)毛羊不同時(shí)期的毛囊組織中miR-1298-5p 和TGF-βR1基因關(guān)系進(jìn)行研究，通過軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-1298-5p 種子序列中有7 個(gè)堿基與TGF-βR1基因3' 端序列堿基互補(bǔ)，表明二者具有靶向關(guān)系，TGF-βR1基因可能是miR-1298-5p 的靶基因。本研究通過qRT-PCR 檢測(cè)miR-1298-5p 和TGF-βR1基因在內(nèi)蒙古絨山羊絨毛生長周期皮膚中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)量呈相反趨勢(shì)，推測(cè)miRNA-1298-5p 可能通過負(fù)向調(diào)控TGF-βR1基因調(diào)控內(nèi)蒙古絨山羊絨毛的生長發(fā)育。以上結(jié)果表明，雖然不同品種羊的毛囊形態(tài)和發(fā)育時(shí)期不同，但分子調(diào)控機(jī)制相似。

4 結(jié) 論

miR-1298-5p 及其靶基因TGF-βR1均在內(nèi)蒙古絨山羊絨毛不同發(fā)育時(shí)期皮膚呈差異性表達(dá)，且miR-1298-5p 可能通過負(fù)調(diào)控TGF-βR1基因在不同發(fā)育時(shí)期的皮膚表達(dá)對(duì)絨山羊絨毛生長起調(diào)節(jié)作用，促進(jìn)絨毛的周期生長。