李 娜 ，肖英平，呂文濤，朱江群，盧立志，夏文銳，楊 華*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江杭州 311300；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310021；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州 310021；4.杭州余杭區(qū)余杭街道農(nóng)業(yè)公共服務(wù)中心，浙江杭州 311100；5.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，浙江杭州 310021）

在生產(chǎn)實(shí)踐中，高密度飼養(yǎng)會(huì)對(duì)家禽的生產(chǎn)性能、肉品質(zhì)以及氧化應(yīng)激產(chǎn)生影響。研究證明高密度養(yǎng)殖會(huì)降低家禽生產(chǎn)性能、降低運(yùn)動(dòng)能力以及增加氧化應(yīng)激等[1-2]。但目前關(guān)于高密度養(yǎng)殖對(duì)畜禽腸道菌群的研究較少，腸道微生物組成與動(dòng)物的能量代謝和健康高度相關(guān)[3]。畜禽腸道被認(rèn)為是機(jī)體最大的“器官”，也是機(jī)體不可或缺的“代謝器官”和“免疫器官”，在阻止病原菌在機(jī)體定植、維持機(jī)體健康、為宿主提供營(yíng)養(yǎng)和能量以及疾病控制等方面發(fā)揮著重要作用，包括消化吸收、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)、抗病性能等[4-7]。

鴨子作為一種重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其獨(dú)特的風(fēng)味受廣大消費(fèi)者歡迎，鴨肉的需求量也逐年上升。肉鴨養(yǎng)殖由放養(yǎng)、大群飼養(yǎng)發(fā)展到籠養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)集約化養(yǎng)殖，從經(jīng)濟(jì)利益的角度來(lái)講，籠養(yǎng)提高了養(yǎng)殖空間的利用效率，從而減少飼養(yǎng)成本,但養(yǎng)殖密度不斷加大的同時(shí)也會(huì)引起肉鴨應(yīng)激。高密度養(yǎng)殖會(huì)下調(diào)北京鴨過(guò)氧化氫酶和鈣調(diào)素等抗氧化蛋白的表達(dá)，同時(shí)與氧化反應(yīng)相關(guān)的蛋白金屬硫蛋白和DDRGK1 表達(dá)增強(qiáng)[8]。研究高密度養(yǎng)殖對(duì)鴨子生長(zhǎng)性能和腸道健康的影響，對(duì)降低生產(chǎn)成本、保證禽肉產(chǎn)品質(zhì)量安全和提高養(yǎng)殖效益有著重要意義，但目前關(guān)于養(yǎng)殖密度對(duì)肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)影響的報(bào)道較少。本研究利用高通量測(cè)序分析高低飼養(yǎng)密度下番鴨的盲腸菌群結(jié)構(gòu)，探討?zhàn)B殖密度對(duì)腸道菌群的影響，為肉鴨的集約化養(yǎng)殖提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選用28 日齡、體重（1.25±0.13）kg 的番鴨40 只，隨機(jī)分為對(duì)照組和高密度養(yǎng)殖組。參照Wu 等[8]和Liu 等[9]的方法設(shè)計(jì)養(yǎng)殖密度，試驗(yàn)用飼養(yǎng)籠的長(zhǎng)×寬×高為0.52 m×0.62 m×0.52 m，對(duì)照組2 只/籠，10個(gè)重復(fù)，高密度組4 只/籠，5 個(gè)重復(fù)。

1.2 飼養(yǎng)管理 將番鴨飼養(yǎng)在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房?jī)?nèi)。提前1 周對(duì)動(dòng)物房及其他飼養(yǎng)設(shè)備進(jìn)行消毒。采用籠養(yǎng)方式，自由采食番鴨商品料（表1）和飲水。整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物房溫度及光照由空調(diào)和照明燈控制，室內(nèi)溫度控制在20～22℃，濕度控制在60%左右。

表1 商品料日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.3 樣品采集 飼養(yǎng)14 d 后，每組隨機(jī)抽取8 只番鴨，測(cè)定體重后屠宰，解剖后分離胸肌及腿肌、肝臟、腹部脂肪稱(chēng)重，并迅速分離腸道，取盲腸內(nèi)容物立即冷凍至液氮，隨后轉(zhuǎn)移到 -80℃冰箱保存。

1.4 屠宰性能及肉品質(zhì)測(cè)定 試驗(yàn)期結(jié)束后進(jìn)行屠宰，記錄宰前活體重，分離胸肌、腿肌、肝臟及腹部脂肪稱(chēng)取重量，參照農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《家禽生產(chǎn)性能名稱(chēng)術(shù)語(yǔ)和度量統(tǒng)計(jì)方法》（NY/T 823-2004）進(jìn)行屠宰性能測(cè)定，計(jì)算公式：

胸肌率=胸肌重/全凈膛重×100%

腿肌率=腿肌重/全凈膛重×100%

肝臟比率=肝臟重/活體重×100%

腹脂率=腹脂重/（全凈膛重+腹脂重）×100%

采用胴體pH 直測(cè)儀（德國(guó) Matth?us）測(cè)定胸肌pH。并立即剝離左半側(cè)胸肌肉樣，用SP 64 分光測(cè)色儀（美國(guó) Xrite）測(cè)量肉色紅度（a*）、黃度（b*）及亮度（L*）。胸肌失水率采用壓力法測(cè)定，取2 塊厚約 1 cm 的肉塊，將肉塊放置于2 層紗布之間，上下各墊18 層濾紙與一塊塑料板，隨后放置在壓縮儀平臺(tái)上，加壓35 kg 并保持5 min，記錄壓前和壓后重。失水率計(jì)算公式：

失水率=（肉樣壓前重-肉樣壓后重）/ 肉樣壓前重×100%

1.5 DNA 提取與16S rDNA 高通量測(cè)序分析 用QIAamp DNA Stool Mini Kit（QIAGEN，CA）試劑盒抽提番鴨盲腸內(nèi)容物總基因組DNA，使用Thermo Qubit 進(jìn)行總DNA 質(zhì)檢；使用引物Forward primer（5'→3'）：CTAC GGGNGGCWGCAG （F）和Reverse primer（5'→3'）：GACTACHVGGGTWTCTAAT（R）對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3～V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。利用Fragment Analyzer 進(jìn)行PCR產(chǎn)物文庫(kù)質(zhì)檢，以確保擴(kuò)增的準(zhǔn)確性和高效性。使用Illumina MiSeq PE300 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序?；?7%的16S rDNA 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行 OUT 聚類(lèi)分析、α多樣性分析、β多樣性分析、菌群差異分析等。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19 軟件進(jìn)行單因子方差分析，采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)進(jìn)行差異性顯著分析，以P＜0.05表示差異顯著、P＜0.01 表示差異極顯著。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果

2.1 不同密度飼養(yǎng)對(duì)番鴨屠宰性能的影響 由表2 可以看出，與對(duì)照組相比，高密度組的體重、全凈膛重、胸肌重、腿肌重、肝重分別降低了22.61%、22.62%、40.24%、24.45% 和26.25%（P＜0.05），腹脂重降低43.81%（P＜0.01），說(shuō)明高密度飼養(yǎng)對(duì)番鴨的生長(zhǎng)和屠宰性能有顯著影響。

2.2 不同密度飼養(yǎng)對(duì)番鴨肉品質(zhì)的影響 如表3 所見(jiàn)，高密度組的pH、失水率、肉色中的L*值和a*值與對(duì)照組均差異不顯著，而b*值顯著增加。

2.3 盲腸微生物物種豐度及多樣性 每組8 個(gè)樣本用于高通量測(cè)序，采用抽平原則，每個(gè)樣本隨機(jī)抽取38 076條序列。根據(jù)2 組每個(gè)樣品的操作分類(lèi)單元（Operational Taxonomic Units，OTU）在每個(gè)樣品中的豐度，計(jì)算出2 組共有和特有的OTU。如圖1 所示，2 組共有OTU 數(shù)目為466，對(duì)照組特有的OTU 數(shù)目為12，高密度組特有OTU 數(shù)目為22。如表4 所示，2 組盲腸菌群的覆蓋指數(shù)均大于0.99，測(cè)序結(jié)果基本覆蓋微生物群落的多樣性；其中2 組群落豐富度指數(shù)和 Chao1、物種多樣性指數(shù)Shannon、PD_whole_tree 指數(shù)無(wú)顯著性差異，而高密度組Simpson 指數(shù)極顯著降低。說(shuō)明高密度飼養(yǎng)對(duì)番鴨盲腸微生物多樣性產(chǎn)生一定影響。

表2 兩種飼養(yǎng)密度對(duì)番鴨屠宰性能的影響

表3 兩種飼養(yǎng)密度對(duì)番鴨肉品質(zhì)的影響

圖1 OTU Venn 圖分析

2.4 番鴨盲腸菌群結(jié)構(gòu)分析 2 組樣品在門(mén)和屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)如圖2-A 所示，厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，這3 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在2 組間存在顯著差異（表5），與對(duì)照組相比，高密度組厚壁菌門(mén)菌門(mén)豐度顯著增加、擬桿菌門(mén)豐度極顯著降低、變形菌門(mén)豐度顯著增加。

為了更清晰地反映2 組番鴨盲腸微生物區(qū)系的變化，從屬水平分析可知，其中擬桿菌屬（Bactericides）、別樣桿菌屬（Alistipes）、糞棲桿菌屬（Faecalibacterium）和丁酸菌屬（Butyricicoccus）為優(yōu)勢(shì)菌屬（圖2-B）。選取相對(duì)豐度均大于0.5%的菌屬進(jìn)行顯著性差異分析表明（表6），與對(duì)照組相比，高密度組擬桿菌屬、丁酸菌屬和毛螺菌屬豐度分別降低了53.56%、67.39%、183.33%（P＜0.05），別樣桿菌屬和罕見(jiàn)小球菌屬豐度分別降低了39.24%和73.91%（P＜0.01），糞棲桿菌屬豐度增加了48.25%（P＜0.05），Parabacteroides 豐度增加了155.88%（P＜0.01）。

表4 2 種飼養(yǎng)密度對(duì)番鴨盲腸菌群豐富度及多樣性的影響

表5 2 種飼養(yǎng)密度對(duì)番鴨菌群結(jié)構(gòu)的影響（門(mén)水平）

表6 2 種飼養(yǎng)密度對(duì)番鴨盲腸菌群結(jié)構(gòu)的影響（屬水平）

2.5 番鴨盲腸菌群結(jié)構(gòu)聚類(lèi)分析 根據(jù)樣品中物種注釋信息及豐度，從物種和樣品2 個(gè)層面進(jìn)行物種豐度聚類(lèi)。非加權(quán)配對(duì)平均法對(duì)各組樣品的層次聚類(lèi)分析表明（圖3-A），對(duì)照組聚成1 樹(shù)狀，高密度組聚成1 樹(shù)狀，2組表現(xiàn)出了不同的聚類(lèi)趨勢(shì)。分支越短，表明2 個(gè)樣本的物種組成越相似，樣本越接近。在主坐標(biāo)分析（PCoA）圖上（圖3-B）可以看出，2 組盲腸菌群結(jié)構(gòu)也表現(xiàn)出明顯分離，菌群結(jié)構(gòu)組成差異較大，說(shuō)明高密度飼養(yǎng)對(duì)盲腸菌群結(jié)構(gòu)的組成造成了顯著影響。

圖2 番鴨盲腸微生物在門(mén)（A）和屬（B）水平上物種豐度分析

圖3 番鴨盲腸微生物聚類(lèi)分析與主坐標(biāo)分析圖

3 討 論

已有研究表明，高密度飼養(yǎng)嚴(yán)重影響畜禽生產(chǎn)性能和機(jī)體健康[1,10]，與本研究結(jié)果一致。高密度養(yǎng)殖限制了畜禽活動(dòng)空間、增加了畜禽氧化應(yīng)激等問(wèn)題，影響畜禽機(jī)體健康。本試驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，高密度組番鴨的體重、胸肌重、腿肌重、肝重顯著降低，腹脂重極顯著降低。番鴨生長(zhǎng)到一定日齡后其腸道菌群也趨于穩(wěn)定。2 組番鴨腸道菌群豐富度無(wú)顯著差異，而高密度組Simpson 指數(shù)極顯著降低，說(shuō)明高密度組與對(duì)照組相比其腸道菌群多樣性較低，這也預(yù)示著高密度養(yǎng)殖會(huì)降低腸道菌群多樣性。

越來(lái)越多的研究表明，腸道菌群平衡在維持機(jī)體代謝和生理功能發(fā)揮著重要作用，并且在機(jī)體疾病的發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[11-12]。本研究中，在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和變形菌門(mén)為番鴨盲腸菌群的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，與前人研究結(jié)果一致[13-14]。厚壁菌門(mén)為動(dòng)物腸道內(nèi)的正常菌群，但是當(dāng)機(jī)體免疫功能紊亂或產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時(shí)，厚壁菌門(mén)的豐度在疾病機(jī)體腸道中顯著升高[15]。高密度組厚壁菌門(mén)豐度較對(duì)照組顯著增加。同時(shí)厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比值增高，提示腸道菌群失衡，并且厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)比率不平衡在很大程度上與能量代謝有關(guān)[8,16-17]。另外Shin 提出變形菌門(mén)豐度顯著增加可作為菌群失衡及潛在疾病風(fēng)險(xiǎn)的判斷依據(jù)[18]。

本研究中，高密度組的擬桿菌屬、丁酸菌屬和毛螺菌屬豐度顯著降低，別樣桿菌屬和罕見(jiàn)小球菌屬豐度極顯著降低。丁酸菌屬和毛螺菌屬的豐度與短鏈脂肪酸的產(chǎn)量呈正相關(guān)，短鏈脂肪酸濃度升高使腸道pH 下降，從而抑制腸道有害菌的定植，有益于腸道健康，進(jìn)而改善肌體健康[19]。丁酸菌減少與炎癥基因表達(dá)增加有關(guān)[20-21]。Lloyd-Price 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，罕見(jiàn)小球菌屬豐度在炎癥性腸病患者腸道內(nèi)顯著減少，且該菌屬通常被認(rèn)為是有益丁酸鹽的生產(chǎn)者。Parabacteroides 被證明是與肥胖有關(guān)的重要菌屬，能夠顯著降低高脂飲食小鼠的體重，在抑制肥胖方面起重要作用[23]。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，高密度飼養(yǎng)應(yīng)激會(huì)對(duì)番鴨的腸道菌群產(chǎn)生顯著性影響，顯著降低盲腸中丁酸梭菌和毛螺菌屬等有益菌群的豐度，同時(shí)也顯著降低了番鴨屠宰性能。