周佳偉 喬木 吳俊靜 王孝忠 劉貴生 梅書棋 彭先文

摘要：母豬的繁殖性狀是豬重要經(jīng)濟(jì)性狀之一，但由于其遺傳力低，導(dǎo)致母豬繁殖性狀常規(guī)選擇進(jìn)展緩慢。通過SANGER測(cè)序的方法檢測(cè)DKK2基因內(nèi)SNP位點(diǎn)，并與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明，在DKK2基因第二內(nèi)含子存在一個(gè)新SNP位點(diǎn)，根據(jù)SNP命名方法將其命名為8：g.114967878A>G.且該SNP位點(diǎn)與產(chǎn)活仔數(shù)性狀顯著相關(guān)。豬DKK2基因的新SNP位點(diǎn)8：g.114967878A>G對(duì)豬的產(chǎn)活仔數(shù)性狀存在潛在的調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞：豬;DKK2;SNP;產(chǎn)仔數(shù)

中圖分類號(hào)：S828;Q343.1+5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114[ 2020） 20-0138-03

DOl：10.1408 8/j .cnki.issn0439-8114.2020.20.031

母豬生產(chǎn)力直接影響豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益，產(chǎn)仔數(shù)性狀是衡量母豬生產(chǎn)力的一個(gè)主要指標(biāo)。然而總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)的遺傳力只有0.09，屬于低遺傳力性狀[1]，導(dǎo)致母豬繁殖性狀常規(guī)選擇進(jìn)展緩慢。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，常規(guī)育種與標(biāo)記輔助選擇（MAS）相結(jié)合的方法有效地加快了豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的選擇進(jìn)展。通過候選基因法和基因組掃描的方法篩選出多個(gè)與產(chǎn)仔數(shù)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，如雌激素受體（Estrogen receptor，ESR）、卵泡刺激素p亞基（Follicle stimulating hormone p subunit， FSH[3）和視黃醇結(jié)合蛋白4（ Retinol binding protein 4，RBP4）基因等[2-4]，但仍然有很多與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)有待挖掘。

DKK（Dickkopf）蛋白家族是WNT信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子，主要成員有DKK1、DKK2、DKK3和DKK4。DKK2和DKK4蛋白可結(jié)合LRP5/6，抑制WNT信號(hào)[5]。研究發(fā)現(xiàn)DKK2在上皮性卵巢癌細(xì)胞中顯著下調(diào)，且在上皮性卵巢癌細(xì)胞中DKK2具有更高甲基化水平，超表達(dá)DKK2顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移[6]。DKK2在出生后2ld內(nèi)的小鼠卵巢中表達(dá)，但在完全生長(zhǎng)卵母細(xì)胞、排出卵母細(xì)胞以及發(fā)育早期胚胎中不表達(dá)，說明了DKK2是由顆粒細(xì)胞合成，且在卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞對(duì)話中起著重要作用[7]。

研究表明，利用Affyetrix公司豬基因組芯片檢測(cè)大白豬和二花臉豬排卵前卵泡中差異表達(dá)的基因[8]，發(fā)現(xiàn)DKK2基因呈現(xiàn)差異表達(dá)，通過性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)DKK2基因啟動(dòng)子區(qū)的c.-1130 T>C與中國(guó)瘦肉豬新品系產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān);通過雙熒光、EM-SA、ChIP驗(yàn)證DKK2 c.-1130 T>C位點(diǎn)影響C/EBP[3與DKK2啟動(dòng)子的結(jié)合能力，位點(diǎn)為T時(shí)，DKK2基因啟動(dòng)子活性極顯著增強(qiáng)，抑制WNT通路基因表達(dá)[9]。本研究以DKK2基因?yàn)檠芯繉?duì)象，探究DKK2基因內(nèi)與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNP位點(diǎn)，為母豬產(chǎn)仔數(shù)的遺傳改良提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

采集湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所和湖北天之力優(yōu)質(zhì)豬育種有限公司聯(lián)合培育的黑豬新品系417頭母豬的耳組織樣品，且所有個(gè)體均記錄了總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)。使用標(biāo)準(zhǔn)苯酚氯仿萃取法提取基因組DNA，保存于-20℃。

1.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)豬DKK2基因的基因組序列（GenBank：NC_010450.4）設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1。50 μLPCR反應(yīng)體系為：100 ng模板DNA、lOxBuffer（含Mg2+）5 μL、上下游引物各0.5 μmol/L、2.5 μmol/LdNTPs、1 UTaq DNA聚合酶，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min;94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用生工生物工程（上海）股份有限公司的Gel Extraction Kit試劑盒進(jìn)行純化;將回收后的PCR產(chǎn)物交由北京奧科鼎盛生物科技有限公司i井行SANGER測(cè)序。

1.3 群體關(guān)聯(lián)分析

采用SAS 9.1軟件中一般線性模型將417頭黑豬新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位點(diǎn)的基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。同時(shí)采用REC程序計(jì)算基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)，并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，所采用模型為Yij=+ Gi+Fj+ei，其中，Yij為性狀表型值，μ為平均值，G為基因型效應(yīng)（包括基因加性效應(yīng)和顯性效應(yīng);加性效應(yīng)用1、0和一1分別代表AA、AC和CC基因型，顯性效應(yīng)用1、一1和1分別代表AA、AG和CC基因型）;Fj為豬場(chǎng)綜合效應(yīng);eij為殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DKK2基因8：g.114967878A>G位點(diǎn)在黑豬新品系中的等位基因頻率

通過SANCER測(cè)序檢測(cè)417頭黑豬新品系DNA樣品中DKK2基因的SNP位點(diǎn)，在DKK2基因第二內(nèi)含子區(qū)域發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的A>C突變的SNP位點(diǎn)（圖1），將其命名為8：g.114967878A>G，并計(jì)算該位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率。結(jié)果（表2）表明，在黑豬新品系中DKK2基因8：g.114967878A>C位點(diǎn)表現(xiàn)為AA、AG或GG 3種基因型，A等位基因頻率為0.9，是優(yōu)勢(shì)等位基因，通過卡方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)8：g.114967878A>G位點(diǎn)在黑豬新品系中均符合哈代溫伯格平衡（P>0.05）。2.2 DKK2基因8：g.114967878A>G位點(diǎn)與產(chǎn)仔數(shù)性狀的關(guān)聯(lián)分析

417頭黑豬新品系DKK2基因8：g.114967878A>C位點(diǎn)的基因型與產(chǎn)仔數(shù)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果（表3）表明，黑豬新品系中8：g.114967878A>C位點(diǎn)的GG基因型的產(chǎn)活仔數(shù)顯著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且顯性效應(yīng)達(dá)到顯著水平（P<0.05），但該SNP位點(diǎn)在黑豬新品系中與總產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)性不顯著。

3 討論

母豬生產(chǎn)力直接影響豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)效益，產(chǎn)仔數(shù)性狀是衡量母豬生產(chǎn)力的一個(gè)主要指標(biāo)。豬DKK2基因是通過基因芯片及EST策略鑒定的新基因，且在大白豬和二花臉豬排卵前卵泡中差異表達(dá)[8]。豬DKK2基因定位在8號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端SSC8： 123，274， 617-123， 279， 223（ Ensembl Sscrofa10.2）.通過pig QTL database查詢，在DKK2基因附近（SSC8的107.5 cM）存在排卵數(shù)性狀的QTL，加性效應(yīng)為3.07[10，11]。因此，DKK2可能為該排卵率QTL的位置候選基因。性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)DKK2基因啟動(dòng)子區(qū)的c.-1130 T>C與中國(guó)瘦肉豬新品系產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān);且該SNP位點(diǎn)通過影響DKK2基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控卵泡發(fā)育。

本研究通過SANCER測(cè)序方法鑒定出DKK2基因第二內(nèi)含子內(nèi)的一個(gè)新SNP位點(diǎn)，并將其與產(chǎn)仔數(shù)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該SNP位點(diǎn)的CC基因型的產(chǎn)活仔數(shù)顯著少于AA基因型和AG基因型（P<0.05），且顯性效應(yīng)達(dá)到顯著水平（P<0.05），為母豬產(chǎn)仔數(shù)性狀的遺傳改良提供了新靶點(diǎn)。

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作者簡(jiǎn)介：周佳偉（1989-），男，江西瑞昌人，助理研究員，博士，主要從事豬遺傳育種研究，（電話）18674037082（電子信箱）422374839@qq.com;

通信作者，彭先文（1974-），男，研究員，主要從事豬遺傳育種研究，（電子信箱）pXWPal@163.com。