金丹丹　房巖　費(fèi)瑞　郝鳳桐　馬金理　楊文卓

摘 要：白英含有多種化學(xué)成分，具有潛在的藥用價(jià)值和開發(fā)前景，但抗炎機(jī)制的研究并不完整。本實(shí)驗(yàn)以小鼠RAW264.7細(xì)胞為材料，研究白英甾體化合物的抗炎作用機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)：白英甾體化合物能明顯抑制產(chǎn)生炎癥的小鼠RAW264.7細(xì)胞的TNF-α的炎癥因子的表達(dá)，提高炎癥細(xì)胞的線粒體膜電位，白英甾體化合物可能是通過保護(hù)線粒體來實(shí)現(xiàn)其抗炎作用。

關(guān)鍵詞：白英甾體化合物;TNF-α;線粒體膜電位;抗炎

中圖分類號(hào)：S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.19754/j.nyyjs.20201130001

炎癥是機(jī)體自發(fā)產(chǎn)生的一種正常反應(yīng)，但如果反應(yīng)過度，又會(huì)給機(jī)體帶來損傷。如何有效控制炎癥的過度損傷，減輕炎癥對(duì)身體帶來的危害，是如今所要研究的重要課題，對(duì)人類健康具有重要意義[1]。白英，又叫鬼目草、葫蘆草等，是茄科茄屬植物，屬多年生蔓性草本植物，分布十分廣泛[2]。白英有很大的藥用價(jià)值，其全草以及根部都可供藥用。目前臨床上對(duì)于白英的應(yīng)用越來越多，在消腫解毒、抗腫瘤等方面尤為顯著。近年來，各研究學(xué)者開始對(duì)白英的抗炎作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)白英具有較好抗炎效果。研究表明，白英主要通過其各種化學(xué)成分發(fā)揮作用[3]。TNF-α是非常重要的一種炎癥因子，能夠反映細(xì)胞的炎癥水平，抑制TNF-α的表達(dá)，可以達(dá)到抗炎的目的。線粒體是真核生物非常重要的細(xì)胞器，在機(jī)體中發(fā)揮重要的作用，當(dāng)機(jī)體產(chǎn)生炎癥時(shí)，線粒體會(huì)發(fā)生很明顯的變化，包括上調(diào)ROS水平、降低線粒體膜電位等，可以通過這些指標(biāo)來觀察線粒體的情況，因此，研究白英甾體化合物的抗炎作用與對(duì)線粒體的關(guān)系具有重要意義。

1 材料

1.1 儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱;超凈工作臺(tái);酶標(biāo)儀;倒置顯微鏡;電子天平;低速離心機(jī);熒光顯微鏡等。

1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基;胎牛血清;PBS;雙抗;CCK-8試劑;TNF-α的ELISA檢測試劑盒;線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）。

1.3 藥品與細(xì)胞

白英甾體化合物干粉由吉林省中醫(yī)中藥研究院饋贈(zèng)，利用PBS使其溶解，實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞為小鼠RAW264.7細(xì)胞購自中國細(xì)胞庫，對(duì)照組為地塞米松。

2 方法

2.1 藥品配制及細(xì)胞培養(yǎng)

取白英甾體化合物的干粉，用PBS將其溶解，然后過濾并進(jìn)行高壓滅菌。小鼠RAW264.7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加入胎牛血清和雙抗（青霉素、鏈霉素），在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期可供實(shí)驗(yàn)使用。

2.2 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞活力的影響

取培養(yǎng)的小鼠RAW264.7細(xì)胞，加入培養(yǎng)基并輕輕吹打，使細(xì)胞懸浮到液體中，加入到96孔板中，使每孔體積200μL，細(xì)胞密度為1×104mL/個(gè)，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁生長，然后把孔內(nèi)液體吸出，加入含有不同濃度的白英甾體化合物的DMEM培養(yǎng)基，并加入LPS，分為5組：空白組，白英甾體化合物高、中、低劑量組（白英甾體化合物的濃度分別為40μg·mL-1、20μg·mL-1、5μg·mL-1），地塞米松陽性對(duì)照組[4]。

2.3 CCK-8法測定細(xì)胞活力

上述5組作用24h后，每孔加入10μLCCK-8，靜置30min，把酶標(biāo)儀的波長調(diào)至450nm，測定上述各孔吸收的OD值。

2.4 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

細(xì)胞培養(yǎng)同上所述，分組情況同上，按照TNF-α的ELISA檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，測量小鼠RAW264.7的炎癥因子的表達(dá)情況。

2.5 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

在上述培養(yǎng)的細(xì)胞中，加入脂多糖，按照分組濃度，加入白英甾體化合物，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，每組取1×105個(gè)細(xì)胞，重懸于0.5mL細(xì)胞培養(yǎng)液中，按照線粒體膜電位檢測試劑盒的說明書進(jìn)行操作，以測定線粒體膜電位的變化情況[5]。

2.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

使用Graphpad Prism 5.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞活力的影響

結(jié)果顯示，與空白組相比較，白英甾體化合物的高中低劑量組和陽性對(duì)照組細(xì)胞活性明顯偏低，白英甾體化合物的高中低劑量組又高于地塞米松組，但各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。說明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，不同濃度的甾體化合物和地塞米松不影響小鼠RAW264.7細(xì)胞活性，對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞沒有毒性作用，與林世和等研究結(jié)果一致[6]。

3.2 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS顯著提升了小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，模型構(gòu)建成功。與LPS組比較，40μg·mL-1和20μg·mL-1的甾體化合物與地塞米松能夠抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α的表達(dá)，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明白英甾體化合物具有較好的抗炎作用。5μg·mL-1的甾體化合物則沒有顯示出抑制小鼠RAW264.7細(xì)胞TNF-α的表達(dá)的作用，對(duì)比LPS組，其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明白英甾體化合物濃度較低時(shí)，其作用效果不明顯，與劉淑華等研究結(jié)果一致[4]。

3.3 白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞線粒體膜電位的影響

通過JC-1法測定線粒體膜電位，用紅、綠2種顏色的熒光分別表示線粒體膜電位的高、低。結(jié)果顯示，空白組呈現(xiàn)紅色熒光，LPS組為綠色熒光，說明在LPS的刺激下，細(xì)胞產(chǎn)生炎癥;當(dāng)加入白英甾體化合物后，線粒體膜電位有所提高，并且以劑量依賴性的方式增強(qiáng)線粒體膜電位，說明炎癥反應(yīng)得到抑制。

4 討論

試驗(yàn)以小鼠RAW264.7細(xì)胞為試驗(yàn)材料，通過LPS刺激誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，以研究白英甾體化合物的抗炎作用與功效[7]。試驗(yàn)首先研究了白英甾體化合物對(duì)小鼠RAW264.7細(xì)胞的毒性作用，結(jié)果顯示，白英甾體化合物和地塞米松對(duì)細(xì)胞活性有影響，使細(xì)胞活力OD值下降，但各組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明白英甾體化合物對(duì)細(xì)胞沒有毒性作用。TNF-α是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要指標(biāo)，通過ELISA檢測了各組TNF-α的表達(dá)水平，LPS刺激細(xì)胞產(chǎn)生炎癥，TNF-α的表達(dá)較高，但在白英甾體化合物作用的情況下，中、高濃度明顯抑制了TNF-α的表達(dá)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，低濃度則沒有出現(xiàn)抑制作用，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明低濃度的白英甾體化合物抗炎作用不明顯。為了明確白英甾體化合物的抗炎機(jī)制，通過JC-1法測量了線粒體膜電位，空白組呈紅色熒光，線粒體膜電位較高，LPS刺激后，呈現(xiàn)綠色熒光，膜電位下降，白英甾體化合物作用后，紅色熒光比例提高，說明白英明顯提高了線粒體膜電位。由此得出結(jié)論，白英甾體化合物能明顯抑制產(chǎn)生炎癥的小鼠RAW264.7細(xì)胞的TNF-α的炎癥因子的表達(dá)水平，提高炎癥細(xì)胞的線粒體膜電位，白英甾體化合物可能是通過保護(hù)線粒體來實(shí)現(xiàn)其抗炎作用[8]。

參考文獻(xiàn)

[1]蔡艷春，黃倩，危曉莉，等.紅景天苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞和Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞共培養(yǎng)炎性介質(zhì)分泌的影響[J].生理學(xué)報(bào)，2019，71（04）：575-580.

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[7]張麗嬌，高立宏，費(fèi)瑞.銀杏葉多糖對(duì)炎癥小鼠TNF-α表達(dá)的影響[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（16）：172-173.

[8]劉芬，曾振國，李勇，等.體DNA誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2014，54（01）：1-3.

（責(zé)任編輯 李媛媛）

收稿日期：2020-10-23

基金項(xiàng)目：吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目“吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目白英的抗炎活性成分及以TLR4為靶點(diǎn)的相關(guān)機(jī)制研究”（項(xiàng)目編號(hào)：20180101112JC）;國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：50875108）

作者簡介：金丹丹（1995-），女，碩士在讀。研究方向：功能生物學(xué);費(fèi)瑞（1964-），男，博士，教授。研究方向：生物活性物質(zhì)活性;郝鳳桐（1997-），男，碩士在讀。研究方向：生物學(xué);馬金理（1997-），男，本科在讀;楊文卓（1999-），男，本科在讀;通訊作者房巖（1965-），女，博士，教授。研究方向：動(dòng)物學(xué)和工程仿生學(xué)。