任紅艷，王紫君，舒 暢，華再東，畢延震

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064）

肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）是肌細(xì)胞分泌的蛋白激素，對成肌細(xì)胞的生長和發(fā)育起負(fù)調(diào)控作用［1］。在自然界中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有雙肌型性狀的動物，其肌肉量明顯多于正常動物，分析發(fā)現(xiàn)其MSTN基因自然變異失活了［2］。Lee等［3］通過敲除MSTN，成功獲得了具有雙肌型的小鼠，進(jìn)一步說明了該基因與動物的肌肉量有關(guān)。另外，還有研究表明胰島素樣生長因子2（Insulin-like growth factor-2，IGF2）第三內(nèi)含子（intron3）的G3072A位點(diǎn)的單堿基突變（G→A）同樣導(dǎo)致了瘦肉率的提升［4］。自然突變的動物經(jīng)過選育后形成了新的品種，其肉質(zhì)柔軟、蛋白質(zhì)含量較高，很受消費(fèi)者青睞，但自然突變所需時間很長。隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)可以利用該技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)基因編輯，大大縮短了選育時間，且安全性有一定保障。

1 基因編輯技術(shù)概述

隨著近些年第一代基因編輯技術(shù)鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）和第二代基因編輯技術(shù)轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶（Transcription activatorlike effector nucleases，TALEN）的發(fā)展及應(yīng)用，第三代基因編輯技術(shù)規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9）應(yīng) 運(yùn) 而生，并因其操作簡單，DNA雙鏈斷裂（Double-strand break，DSB）效率較高而得到了飛速發(fā)展［5，6］。CRISPR/Cas9只需要Cas9蛋白和向?qū)NA（guide RNA，gRNA）即可按照自己的意愿完成定點(diǎn)DSB，并通過細(xì)胞自身的非同源末端連接（Nonhomologous end joining，NHEJ）［7］通路發(fā)生Indel，從而產(chǎn)生移碼突變完成基因敲除，或通過同源重組（Homologous recombination，HR）［8］通路與同源臂供體（donor）完成定點(diǎn)基因敲入。通過以上技術(shù)可完成相關(guān)基因的失活，從而較快地得到MSTN基因編輯動物。但CRISPR/Cas9可能會脫靶從而引入潛在不需要的DSB，導(dǎo)致生物安全性問題，隨著技術(shù)的發(fā)展，后面又出現(xiàn)了更加安全的不發(fā)生DSB的堿基編輯技術(shù)（Base editing）和全新的精準(zhǔn)基因編輯（Prime editing）等方法。

2 基因編輯在提高豬瘦肉率中的應(yīng)用

中國是世界上養(yǎng)豬最多和豬肉食用量最大的國家，每年卻要大量進(jìn)口外國種公豬或其精子，主要是因?yàn)橹袊i普遍具有飼料報酬低、貯脂力強(qiáng)、瘦肉率低等許多缺點(diǎn)，現(xiàn)代人們喜食瘦肉，中國不得不大量進(jìn)口瘦肉率較高的外國豬以滿足人們越來越高的需求。因此亟需培育高瘦肉率的本土豬，但常規(guī)選育通常費(fèi)時費(fèi)力，隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，這一高速便捷的分子育種方式得以應(yīng)用。

MSTN基因包括3個外顯子和2個內(nèi)含子（NCBI），第三外顯子最終決定了起作用的肌肉抑制素成熟肽，故一般破壞第三外顯子以失活MSTN。IGF2基因包括9個外顯子和8個內(nèi)含子（NCBI），研究表明是第三內(nèi)含子的單堿基突變導(dǎo)致瘦肉率提高。本文對通過CRISPR/Cas9、Base editing和Prime editing等方法敲除MSTN基因和突變IGF2基因以得到高瘦肉率豬進(jìn)行綜述。

2.1 CRISPR/Cas9的應(yīng)用

2012年人類就開始研究CRISPR/Cas9［9］，由于人類已經(jīng)弄清楚提高瘦肉率與MSTN基因失活密切相關(guān)，所以便開始利用此技術(shù)開展MSTN敲除的研究，以期獲得高瘦肉率豬，但該技術(shù)對于IGF2的單堿基突變則無能為力。獲得基因敲除動物一般有以下途徑：通過顯微注射gRNA和Cas9 mRNA到受精卵中獲得基因編輯動物（通常用于小型動物），或通過先制備基因敲除細(xì)胞再進(jìn)行體細(xì)胞克隆得到基因編輯動物（通常用于大型動物）。運(yùn)用CRISPR/Cas9使MSTN失活主要有以下3種方法：①單gRNA產(chǎn)生單DSB法利用Indel發(fā)生移碼突變使其失活；②雙gRNA產(chǎn)生雙DSB法利用較大片段的丟失使其失活；③通過基因敲入熒光報告系統(tǒng)輔助篩選陽性細(xì)胞和Cre/LoxP重組系統(tǒng)刪除熒光標(biāo)記殘留34bp序列達(dá)到翻譯錯誤使其失活等。

2015年，湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所運(yùn)用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過單gRNA法獲得了MSTN基因敲除細(xì)胞系，并通過體細(xì)胞克隆得到了中國首例超級瘦肉豬——中超916新品系［10］。2017年，該所又利用CRISPR/Cas9基因敲入和Cre/LoxP技術(shù)連用獲得了豬肌肉生長抑制素雙等位基因敲除細(xì)胞系［11］。2019年，該所利用雙gRNA法且無選擇標(biāo)記法獲得了MSTN雙等位基因純合子敲除細(xì)胞系，并得到了克隆豬。

通過以上方法，雖可以較為快速地獲得MSTN敲除動物，但由于產(chǎn)生了DSB，存在潛在的脫靶等生物安全性問題，需要進(jìn)一步尋找更加安全的技術(shù)。

2.2 Base editing的應(yīng)用

由于常規(guī)CRISPR/Cas9有產(chǎn)生DSB的不利性，不產(chǎn)生DSB的基因編輯改進(jìn)型——堿基編輯應(yīng)運(yùn)而生［12］。堿基編輯分為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）。最新的CBE4和ABE4編輯器基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，通過在nCas9上連接上胞嘧啶和腺嘌呤脫氨酶形成融合蛋白，即可完成C-T（G-A）或A-G（T-C）的堿基替換，從而實(shí)現(xiàn)單堿基編輯。相較于常規(guī)CRISPR/Cas9基因編輯，該堿基編輯不會發(fā)生DSB，所以理論上不會出現(xiàn)潛在的DNA脫靶而產(chǎn)生永久的DNA編輯，提高了生物安全性。

許多人類疾病都與堿基突變有關(guān)，所以該方法對于基因疾病的治療有巨大的發(fā)展?jié)摿?。同時，此方法正好可以與IGF2的單堿基突變相結(jié)合，以獲得IGF2-G3072A位點(diǎn)的單堿基編輯細(xì)胞系，從而獲得具有高生物安全性的高瘦肉率基因編輯豬。除此之外，還可以利用單堿基編輯在MSTN基因上引入提前終止密碼子以達(dá)到基因敲除的效果。

然而，2019年中國科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所楊輝團(tuán)隊在Science發(fā)表的GOTI技術(shù)發(fā)現(xiàn)單堿基編輯存在大量不可預(yù)測的脫靶［13］，隨后該團(tuán)隊通過定點(diǎn)突變來優(yōu)化編輯工具，獲得了高編輯效率且低脫靶性的新型堿基編輯工具，從而可以獲得更具生物安全性的基因編輯豬。

2.3 Prime editing的應(yīng)用

單堿基編輯由于沒有DSB，降低了DNA脫靶，但其只能實(shí)現(xiàn)單個堿基的固定替換，具有一定的局限性。2019年Anzalone等［14］發(fā)明了全新的精準(zhǔn)基因編輯工具PE（Prime Editors），最新的PE3/PE3b編輯器基于CRISPR/Cas系統(tǒng)，通過在Cas9/nCas9上連接上逆轉(zhuǎn)錄酶形成融合蛋白，即可完成堿基變換/堿基插入與刪除，是一種比較全面的編輯工具。該編輯不需要DNA模板就可以實(shí)現(xiàn)12種單堿基的自由變換，而且還能實(shí)現(xiàn)最多44 bp的插入和80 bp的刪除。相較于傳統(tǒng)的CRISPR/Cas9，同樣沒有引入DSB而具有較高生物安全性，與堿基編輯相比其可以進(jìn)行單堿基的自由變換，同時還可以進(jìn)行定點(diǎn)刪除和插入，應(yīng)用十分廣泛，在基因編輯領(lǐng)域帶來了重大變革。與基因編輯豬相結(jié)合，可以利用該系統(tǒng)對豬MSTN進(jìn)行堿基的刪除或插入從而引起移碼突變導(dǎo)致其失活，或通過堿基變換引入提前終止密碼子導(dǎo)致其失活；另外，還可以運(yùn)用該系統(tǒng)對IGF2-G3072A位點(diǎn)進(jìn)行堿基變換，從而得到單堿基編輯細(xì)胞系。該系統(tǒng)還可以用于與影響豬瘦肉率的相關(guān)基因的研究，最終獲得高瘦肉率且高生物安全性的基因編輯豬。除此之外，該系統(tǒng)在人類基因疾病的治療上也具有廣泛的前景。但該系統(tǒng)以逆轉(zhuǎn)錄酶為主要原件，在細(xì)胞內(nèi)過量表達(dá)，其生物安全性仍然是一個需要考慮的問題。

3 展望

隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展，出現(xiàn)了越來越多簡單易操作、運(yùn)用廣泛且安全的新型編輯技術(shù)，可以快速獲得單堿基編輯、基因敲除或敲入的細(xì)胞系，并通過體細(xì)胞克隆等技術(shù)獲得基因編輯動物。運(yùn)用以上技術(shù)達(dá)到分子育種的目的，以快速獲得具有優(yōu)良性狀的動物。在獲得高瘦肉率的優(yōu)良性狀豬上，基因編輯在其中扮演著十分重要的角色，相信隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展與完善，可以為人類生活做出更大的貢獻(xiàn)。