王露露，岳英哲，孔曉穎，張 建 ，張曉英，李 洋，孔 波，路沖沖，李 洋，丁新華

(1.山東農(nóng)業(yè)大學植物保護學院，泰安 271018 ；2. 山東蓬勃生物科技有限公司，泰安 271018)

植物病蟲害的化學防治是我國糧食產(chǎn)量和品質(zhì)的保障，但是化學農(nóng)藥的過度使用給環(huán)境和人類健康造成嚴重損害。2015年農(nóng)業(yè)部提出化肥農(nóng)藥零增長計劃，因此開發(fā)生物農(nóng)藥是解決農(nóng)藥污染問題，實現(xiàn)農(nóng)藥減量的有效手段之一。植物免疫誘抗劑作為新型生物農(nóng)藥，并不能直接對病原菌進行強烈的毒殺，而是以植物為目標，通過調(diào)節(jié)植物本身的免疫、代謝系統(tǒng)來增強植物對病原菌的抗性，提高植物抗逆性，促進植物生長。植物免疫誘抗劑作為植物保護的新實踐，因具有對人畜毒性低，環(huán)境相容性高，作用譜廣，病原菌不會產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點而獲得關(guān)注，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中應用越來越廣泛。

1 植物免疫誘抗劑的定義及發(fā)展歷程

植物免疫誘抗劑即植物疫苗，主要通過增強植物生理功能，增加植物對致病因子的抵抗力，從而提高植物的誘導抗性[1]。它能夠激發(fā)植物體內(nèi)多條代謝路徑，加強新陳代謝，促進植物的生長發(fā)育，達到增產(chǎn)抗病的效果。植物免疫誘抗劑也稱為植物生物刺激素，歐盟管理法規(guī)對植物生物刺激素的定義為：一種刺激植物營養(yǎng)過程的產(chǎn)品，其目的是改善植物的一個或多個特性如營養(yǎng)素利用效率、對非生物脅迫的耐受性、土壤和根際中作物質(zhì)量特性或限制營養(yǎng)素的有效性[2]。

1933年蘇聯(lián)Filatov教授首次討論“生物刺激”理論，植物在外界不利但不致命的條件下，會經(jīng)過生化重組形成非特異性的生物刺激物，激發(fā)生物體反應，抵抗病原菌的入侵，增強植物免疫力[3-5]。Herve為生物刺激素提供了第一個真正的概念性產(chǎn)生方法，指出生物刺激素的開發(fā)應該建立在化學合成、生物化學和生物技術(shù)的系統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上，能夠在低劑量下發(fā)揮作用，并且對生態(tài)友好[6]。1992年，美國學者從淀粉歐文氏菌中分離出一種引起植物防御反應的蛋白質(zhì)激發(fā)子，該激發(fā)子被命名為Harpin，能誘導煙草等植物產(chǎn)生過敏反應[7]。Zhang和Schmidt在1999年強調(diào)了對生物刺激素進行全面和實證分析的必要性，特別強調(diào)生物刺激作用是通過激素效應，其次是通過抗氧化劑對非生物脅迫的保護。它的作用主要表現(xiàn)在提高光合作用效率，減少病原菌的強度及傳播，并提高作物產(chǎn)量[8]。Basak開創(chuàng)了對生物刺激素的系統(tǒng)討論，為現(xiàn)代生物刺激素科學的形成創(chuàng)造了概念前提[9]；Du Jardin首次對植物生物刺激素科學進行了深入的分析，強調(diào)了生物刺激素在生理生化功能、作用方式和來源上的系統(tǒng)化和分類。該分析和分類對歐盟后續(xù)立法和法規(guī)的發(fā)展產(chǎn)生了重要影響[10]。2012年11月在斯特拉斯堡召開的第一屆世界生物刺激素農(nóng)業(yè)大會被視為接受生物刺激素進入學術(shù)界的一個里程碑。2014年美國科學家指出生物控制微生物和植物生長促進微生物可以促進植物生長發(fā)育以及誘導植物系統(tǒng)獲得抗性，提高植物對生物和非生物脅迫的耐受性[11]。植物在抵抗病原菌時會產(chǎn)生一系列信號物質(zhì)如水楊酸、乙烯、茉莉酸和脫落酸等進行信號傳導，誘導植物抗病相關(guān)基因表達，這些信號物質(zhì)也可以作為植物免疫誘抗劑的原材料[12]。

2 植物免疫系統(tǒng)

植物免疫誘抗劑作用于植物本身，通過預先激活植物自身免疫系統(tǒng)來抵御病原菌的入侵，從而達到促進植物抗病的目的。植物在生長過程中不斷地受到病原菌的侵染，為了抵抗病原菌侵入，植物有兩種信號防御機制，包括病原相關(guān)分子觸發(fā)免疫(PAMP-triggered immunity, PTI)以及效應分子觸發(fā)免疫(Effector-triggered immunity, ETI)。植物免疫的第一類受體——模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)定位于細胞膜上，其胞外結(jié)構(gòu)域可以特異性識別病原相關(guān)分子模式，再通過跨膜結(jié)構(gòu)域激活胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域，進而激活免疫反應[13-14]，如植物FLS2對細菌鞭毛蛋白flg22的識別、EFR對細菌延伸因子Tu的識別等[15-16]。PTI主要在病原菌侵染初期起作用，具有非寄主抗性，可以通過鈣離子內(nèi)流、胼胝質(zhì)沉積、活性氧爆發(fā)、氣孔關(guān)閉，產(chǎn)生一氧化氮及水楊酸、茉莉酸等多種植物激素來抵抗病原菌[17]。面對植物的抗御策略，病原菌進而分泌效應因子(Effector)抑制植物 PTI。為與病原菌抗衡，植物進化出防御效應因子的第二類免疫受體NLR (Nucleotide-binding leucine-rich repeat)即 ETI。相較于PTI，ETI激活的下游免疫反應強度更大，時間更長，并且一般會伴隨著程序性細胞死亡，導致過敏反應[18]。病原菌會繼續(xù)通過效應因子的變異來入侵植物，二者在斗爭中共同進化[19]。

3 植物免疫誘抗劑的種類

能夠激活植物產(chǎn)生免疫反應的物質(zhì)稱為激發(fā)子，主要包括蛋白類、寡糖類、脂類、小分子代謝物類、水楊酸及其類似物等類型[20]。蛋白質(zhì)激發(fā)子是目前已鑒定種類最多的激發(fā)子類型，已鑒定出壞死及乙烯誘導相關(guān)蛋白(Nep1-like protein)、過敏反應誘導蛋白(Hrip)、纖維素酶(Cellulase)等幾十種免疫激活蛋白[21-23]，這為后續(xù)植物免疫誘抗劑的研究積累了重要的蛋白資源。BcGs1是來源于灰霉病病菌(Botrytis Cinerea)的一種細胞壁降解酶，它可以觸發(fā)植物的免疫反應，抵抗病原菌侵襲植物。研究表明，BcGs1通過活性氧代謝和苯丙烷代謝誘導番茄的防御反應，可以引起活性氧爆發(fā)，提高苯丙胺酸解氨酶和過氧化物酶活性，促進木質(zhì)素積累，提高番茄對灰霉病的抗性[24]。XEG1是從大豆疫霉中發(fā)現(xiàn)的GH12家族糖基水解酶，可以誘導植物產(chǎn)生免疫反應，如活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)沉積、抗病相關(guān)基因的高表達以及過敏性壞死反應。植物細胞膜上的共受體蛋白BAK1可以識別XEG1，并與其他受體蛋白互作誘導植物免疫。進一步研究發(fā)現(xiàn)XEG1的特異性受體 RXEG1，二者結(jié)合激活免疫通路[25]。XEG1是植物、疫霉菌、真菌、細菌中廣泛存在的植物免疫激發(fā)子[26]。寡糖類激發(fā)子在自然界中含量豐富，主要通過誘導植物的系統(tǒng)抗病性來增強植物抵抗病原菌的能力。海帶多糖是從褐藻海帶中提取的β-1,3-葡聚糖，是植物防御反應的激發(fā)子，主要通過鈣離子內(nèi)流、活性氧爆發(fā)、抗病相關(guān)基因表達、絲裂原活化蛋白激酶的激活、幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性的增加、植物防御素的產(chǎn)生等免疫反應抑制葡萄灰霉病病菌侵染葡萄[27]。海藻糖是一種非還原性雙糖，廣泛存在于包括真菌在內(nèi)的多種生物中。在噴灑海藻糖溶液后，小麥被白粉病侵染程度降低。研究表明，海藻糖不僅可以抑制分生孢子萌發(fā)和附著體分化，還可以提高苯丙氨酸解氨酶和過氧化物酶的活性[28]。幾丁質(zhì)是一種N-乙酰葡糖通過β連接聚合而成的多糖，主要存在于真菌的細胞壁上[29-30]。幾丁質(zhì)可以與擬南芥和水稻激酶活性共受體 CERK1結(jié)合，引起植物免疫反應。CERK1參與細菌肽聚糖和脂多糖引發(fā)的免疫信號轉(zhuǎn)導、真菌β-1,3-葡聚糖引發(fā)的免疫信號轉(zhuǎn)導和短鏈幾丁質(zhì)寡糖引發(fā)的共生信號轉(zhuǎn)導、細胞死亡以及植物耐鹽等生理活動[31]。脂多糖是脂類激發(fā)子的一種，由革蘭氏陰性菌產(chǎn)生，通過微生物相關(guān)分子模式的感知觸發(fā)植物的先天免疫。從擬南芥中鑒定到脂多糖的受體蛋白為凝集素-S-結(jié)構(gòu)域-類受體激酶LORE，LORE在煙草瞬時表達后賦予煙草對脂多糖的敏感性，這在脂多糖傳感中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，并表明了在作物物種中進行工程抗病的可能性[32]。水楊酸(Salicylic acid, SA)調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的多個方面，并激活植物對生物和非生物脅迫的防御，是植物對多種病原菌產(chǎn)生抗性所必須的一種關(guān)鍵物質(zhì)。1979年SA與植物免疫的關(guān)系被首次提出，乙酰水楊酸能使感病煙草對煙草花葉病毒產(chǎn)生抗性[33]。SA可以被兩種不同的受體——NPR1和NPR3/NPR4感知，SA結(jié)合刺激NPR1的轉(zhuǎn)錄激活活性，抑制NPR3/NPR4的轉(zhuǎn)錄抑制活性，誘導產(chǎn)生防御相關(guān)基因[34]。SA處理還可以誘導一些感受器NLRs和大多數(shù)已知的NLR信號轉(zhuǎn)導元件的表達，增強PRR和NLR介導的免疫反應[35]。SA在植物抗病方面具有良好效果，外源施用 SA可提高甜瓜中總酚、類黃酮、木質(zhì)素含量以及增強抗病相關(guān)酶活性，延遲甜瓜發(fā)病時間，降低發(fā)病率[36]。水楊酸還可誘導黃瓜對白粉病的抗性[37]。此外，SA可以提高植物抗逆性，SA處理鹽脅迫下辣椒幼苗可提高其葉綠素含量，使其恢復正常生長[38]。SA對寒冷脅迫下的小麥、番茄也有一定的緩解和恢復作用[39-40]。

4 植物免疫誘抗劑及其制劑產(chǎn)品在農(nóng)業(yè)中的應用

傳統(tǒng)的殺菌劑、化肥主要以病原菌及特定的營養(yǎng)需求為靶點，對農(nóng)作物進行病害防治和產(chǎn)量提高，而忽略了植物本身對生物和非生物脅迫的抵抗能力。當前，植物免疫誘抗劑主要以外源生物或分子激活植物體內(nèi)的免疫系統(tǒng)，提高植物抗病力，此外還激發(fā)植物代謝系統(tǒng)，促進植物根莖葉的生長及葉綠素的合成，提高作物產(chǎn)量，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有良好的應用效果。目前植物免疫誘抗劑主要有植物免疫蛋白、寡糖、水楊酸及其類似物、次生代謝物等類型。

植物免疫蛋白是一種新型生物農(nóng)藥，在抗病、增產(chǎn)、抗凍、提高品質(zhì)等方面具有良好效果，通過信號傳導系統(tǒng)誘導植物抗病相關(guān)基因的表達，進而促進防御物質(zhì)的產(chǎn)生，提高植物免疫力，減輕病害的發(fā)生。邱德文團隊從極細鏈格孢菌中分離純化得到高活性蛋白并加入氨基寡糖素制成世界上首個植物免疫蛋白生物農(nóng)藥 6%寡糖·鏈蛋白質(zhì)可濕性粉劑(阿泰靈)[41-42]。阿泰靈能夠促進植物根系生長，增強植物免疫，達到防治病害的效果。研究表明，阿泰靈能使小麥、水稻等糧食作物、茶葉、大姜等經(jīng)濟作物以及番茄等蔬菜增產(chǎn) 5%～10%[43]，并且對番茄黃化曲葉病毒病、煙草花葉病毒病、水稻紋枯病等具有明顯的防治效果[44-46]。植物免疫增產(chǎn)蛋白對生姜、芝麻、蓮藕、水稻等作物具有增產(chǎn)提質(zhì)的效

果[47-50]。

美國生物公司的新型生物農(nóng)藥 Messenger是含Hapin蛋白的可濕性顆粒劑。Harpins是革蘭氏陰性菌在病原菌-植物相互作用過程中 III型分泌系統(tǒng)分泌的蛋白質(zhì)，可以作為激發(fā)子，刺激多種非寄主植物的防御和植物生長[51]。Harpin處理的植株具有更高的抗性、品質(zhì)和產(chǎn)量，因此Harpin蛋白可能具有許多潛在的農(nóng)業(yè)應用價值。從木薯枯萎病菌中鑒定出一個新的 Harpin-HpaXpm，可有效地誘導非寄主植物的過敏性反應、防御反應和促進生長[52]。Harpin蛋白 Hpa1能夠顯著誘導防御相關(guān)酶活性并增強抗病相關(guān)基因表達，增加過氧化氫、胼胝質(zhì)等抗病相關(guān)物質(zhì)含量，對煙草花葉病毒有很好的防御效果[53]。

氨基寡糖素也稱為農(nóng)業(yè)專用殼寡糖，是植物識別病原真菌入侵的非特異性信號，對許多植物顯示出強烈的免疫誘導活性，可以激發(fā)植物的基因表達，產(chǎn)生抗病的甲殼素酶、殼聚糖酶、植保素和免疫蛋白，這些物質(zhì)能抑制病菌生長和殺滅病菌，達到抗病目的[54]。中國農(nóng)藥信息網(wǎng)公開數(shù)據(jù)顯示，截至2020年9月我國登記氨基糖糖素農(nóng)藥產(chǎn)品76個，水劑為氨基寡糖素的主要劑型。氨基寡糖素應用前景廣闊，對促進農(nóng)作物增產(chǎn)抗病，推進我國農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。不同濃度的殼寡糖基聚合物可作為保鮮劑，對成熟度80%的紫花芒進行果面噴施后，發(fā)現(xiàn)1%～2%的殼寡糖基聚合物水溶液對芒果具有很好的保鮮效果，且芒果的可溶性固形物、維生素 C、可滴定酸含量等指標和好果率、失重率均明顯優(yōu)于對照[55]。受凍的黃瓜經(jīng)殼寡糖處理后，其長勢明顯好于對照，處理過的植株果實采收期可比對照提前3～5 d，產(chǎn)量也明顯高于對照[56]。葉片噴施殼寡糖對茶樹有較好抗病增產(chǎn)效應[57]，同時發(fā)現(xiàn)殼寡糖在葉片培養(yǎng)基中可起到激素的作用，對培養(yǎng)基及外植體起到了防污抗病的保護作用[58]。

褐藻寡糖(Alginate-derived Oligosaccharide, AOS)是由褐藻膠降解而來，可作為植物激發(fā)子，促進植物生長，增加產(chǎn)量，提高品質(zhì)，增強植物抗逆性和抗病性。研究表明，適當濃度的AOS可以增加黃瓜幼苗的株高、莖粗和鮮重以及光合能力，促進植株生長。此外，AOS還可促進黃瓜體內(nèi)抗氧化酶活性，消除過多的活性氧，增強植物抗逆能力[59]。在干旱脅迫下，AOS對黃瓜的促生和抗逆效果更明顯，主要是 AOS通過刺激脫落酸的合成提高了黃瓜的抗旱性[60]。AOS可以通過誘導次生代謝和調(diào)節(jié)防御相關(guān)酶的活性提高草莓對白粉病菌的抵抗力[61]。此外，褐藻寡糖在食品開發(fā)、藥物研制、疾病預防等方面也具有良好的研究進展。

康而健是從抗病植物中提取的富含水楊酸及其衍生物的綜合性免疫誘抗劑，可以激發(fā)植物抗體，對細菌性、真菌性及病毒性病害均具有免疫作用，可以預防植物病害的發(fā)生，減輕病害造成的損失。此外，康而健內(nèi)吸性強，可直接進入植物細胞內(nèi)，快速穩(wěn)定地激發(fā)植物產(chǎn)生抗體，誘導植物產(chǎn)生抗性反應，提高對病原菌的抗侵染能力[62]。對離體葡萄葉片噴施康而健1 000倍溶液，能夠延緩并減輕葡萄葉片霜霉病的發(fā)生，抑制病斑擴散。在葡萄開花前噴施康而健，對葡萄灰霉病、霜霉病、白粉病等均有較好的預防效果，且葡萄葉片厚綠，落果減少。此外，在辣椒疫病發(fā)病前噴施康而健700倍溶液，10 d后，與對照組相比，處理后的辣椒疫病發(fā)病率減少近50%，康而健有效地降低了辣椒疫病的發(fā)生程度。瑞士先正達公司的植物免疫誘抗劑 Actigard是以苯丙噻二唑(2,1,3-benzothiadiazole, BTH)為活性成分，BTH是水楊酸結(jié)構(gòu)類似物，對植物有良好的誘導免疫活性，對細菌、真菌和病毒性病害具有很好的防治效果。BTH可誘導辣椒對白粉病產(chǎn)生抗性，BTH處理辣椒后會使辣椒葉片中過氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙酸解氨酶活性明顯增加，并抑制白粉病病菌菌絲生長[63]。

智能聰(ZNC)是野生沙棘內(nèi)生真菌的提取物，該內(nèi)生真菌被鑒定為宛氏擬青霉(Paecilomyces Variotii)菌株SJ1。其具有促進植物生長，提高作物產(chǎn)量和抗逆性的作用，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛應用。ZNC作為一種激發(fā)子，可以通過促進氮磷吸收和轉(zhuǎn)運以及生長素的合成等促進植物生長，同時，通過活性氧爆發(fā)、胼胝質(zhì)沉積、抗病相關(guān)基因上調(diào)、激活SA生物合成及信號通路等途徑提高植物防御病原菌的能力[64]。此外，ZNC對植物病毒有一定的預防和治療作用，主要通過PAL基因的表達誘導水楊酸的生物合成，促進 RNA沉默來抵抗病毒侵染[65]。ZNC可以通過提高植物體內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶和苯丙氨酸解氨酶活性，降低Na+/K+和丙二醛含量，提高植物對非生物脅迫(抗鹽、抗低溫)的抗性[66-67]。ZNC可作為一種痕量營養(yǎng)增效物質(zhì)用于控釋尿素，可提高氮肥利用率15%～20%，提高水稻產(chǎn)量10%[68]；與常規(guī)磷酸二銨復配后可有效促進玉米根系生長，增強根系活力，根表面積增加80%，土壤有效磷含量提高45%，提高玉米產(chǎn)量[69]。對不同作物施用 ZNC后發(fā)現(xiàn)，ZNC具有促進種子萌發(fā)、根系發(fā)育、生殖發(fā)育以及抗病抗逆的能力，對小麥、馬鈴薯、葡萄、黃瓜、茄子、煙草等多種作物均有顯著效果[70]。ZNC作用快速，在接觸植物2 h內(nèi)就能激發(fā)植物體內(nèi)抗性基因上調(diào)表達，在田間使用5 d左右就有較明顯的田間表現(xiàn)；具有超高活性，在1 ng/mL(十億分之一)時即具有顯著功效，并且在低濃度表現(xiàn)促生及抗逆效果，在高濃度抗病能力增強，其活性為腐植酸鈉的30 000倍，海藻酸的300 000倍[71]，因此ZNC具有極高的科研價值及田間應用推廣價值。

5 展 望

在傳統(tǒng)認知中，植物在遭遇病蟲害攻擊時一定要使用化學農(nóng)藥進行直接防治，這樣雖快速有效，但長期使用，不僅會使病蟲害產(chǎn)生抗性，而且對生態(tài)環(huán)境造成嚴重影響。與傳統(tǒng)化學農(nóng)藥相比，植物免疫誘抗劑存在許多優(yōu)點，如對環(huán)境友好，對人畜毒性較低，不會導致病原菌產(chǎn)生抗藥性，使用濃度低，作用范圍廣等。植物免疫誘抗劑以預防為主、治療為輔，通過提高植物抗病性，減輕病害發(fā)生，符合綠色、高效、低污染的農(nóng)藥行業(yè)發(fā)展方向。

植物免疫誘抗劑的使用貫徹了國家綠色發(fā)展新理念，符合農(nóng)業(yè)部提出的農(nóng)藥、化肥“雙減行動”的政策，有利于實現(xiàn)“美麗中國”的宏偉目標。隨著人們對綠色環(huán)保問題的日益重視，相信在全社會的共同努力下，植物免疫誘抗劑作為新型生物農(nóng)藥會在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，為低碳環(huán)保型社會貢獻堅實力量。