朱會(huì)霞，孫金旭，高 越，王 茜，李雪珍

(衡水學(xué)院，河北 衡水 053000 )

酵素作為營(yíng)養(yǎng)食品目前在多個(gè)國(guó)家及地區(qū)都十分流行[1]。酵素是指以水果蔬菜、菌類、動(dòng)物、藻類等作為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵而形成的，含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[2]。常見(jiàn)的水果蔬菜、藥食同源中藥等都可以作為酵素發(fā)酵的原料[3]。水果酵素主要是水果作為原料，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間發(fā)酵后得到的可食用的發(fā)酵果汁，含豐富的肽類物質(zhì)、多糖類(小分子)、維生素類物質(zhì)、多酚類、氨基酸、有機(jī)酸、礦物質(zhì)及可溶性纖維素等生理活性成分。這些成分分一部分來(lái)自原料，另一部分來(lái)自微生物的代謝過(guò)程。

酵素的功效與作用：酵素通過(guò)合理的選取原料、合適的發(fā)酵工藝，能夠制作出多種酵素產(chǎn)品[4-5]。酵素中含有的一些物質(zhì)，如多酚類物質(zhì)、維生素A、維生素C和維生素E等，能夠清除人體代謝得到的氧自由基，具有抗氧化的功能。已經(jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)的姜黃素、異黃酮、沒(méi)食子酸、木酚素、花青素、阿魏酸、咖啡酸等成分可通過(guò)抑制致癌物活化而抑制腫瘤[6]。礦物質(zhì)進(jìn)入人體后可以保持蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞分裂及神經(jīng)傳遞的正常進(jìn)行[7]。酵素中含有人體必需的適量丁酸，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)丁酸可以修復(fù)腸黏膜，對(duì)治療腸炎有重要作用，在防治結(jié)腸直腸癌和調(diào)節(jié)基因表達(dá)等方面有十分重要的作用。果蔬酵素中的可溶性纖維素纖維膳食雖然不能被消化吸收，但有促進(jìn)腸道蠕動(dòng)等功效，對(duì)身體健康至關(guān)重要[8]。

高通量測(cè)序是由Handelsman等提出的，可以覆蓋樣品中全部微生物，真實(shí)地反應(yīng)微生物的多樣性、微生物菌落的構(gòu)成及其在生態(tài)中、代謝產(chǎn)物中所發(fā)揮的作用。即用原位裂解法或間接提取法提取出樣品的總DNA，或從某些已知DNA序列中挑選出新的基因(簇)[9]。

傳統(tǒng)培養(yǎng)基鑒定微生物是對(duì)樣品進(jìn)行富集擴(kuò)培，然后在選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)。自然界中能夠人工培養(yǎng)的微生物很少，樣品中多數(shù)微生物難以培養(yǎng)，傳統(tǒng)鑒定法培養(yǎng)不出全部微生物[10-11]，無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。高通量測(cè)序可以對(duì)數(shù)以萬(wàn)計(jì)的DNA進(jìn)行測(cè)序，對(duì)全部微生物種群進(jìn)行分析，使序列結(jié)果分析的速度與準(zhǔn)確性都大大提高[12-13]。

當(dāng)前酵素在我國(guó)的發(fā)展仍處于初步階段，人們對(duì)于酵素生產(chǎn)及工藝方面的研究很少。對(duì)于酵素的生產(chǎn)工藝等各個(gè)方面還有待更多、更深入的研究。本研究經(jīng)由水果酵素發(fā)酵液細(xì)菌總DNA測(cè)序來(lái)綜合性的判斷發(fā)酵細(xì)菌的種類，旨在經(jīng)過(guò)測(cè)序結(jié)果分析水果酵素中的細(xì)菌種類，繼而規(guī)范優(yōu)化操作過(guò)程，對(duì)水果酵素的生產(chǎn)過(guò)程采取有效的防范措施，避免其受到雜菌的污染。在水果酵素的工廠化生產(chǎn)過(guò)程中，可以有效的調(diào)整生產(chǎn)工藝防止污染雜菌，為提高水果酵素品質(zhì)提供研究思路和技術(shù)方面的支持。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

水果酵素(正常發(fā)酵和染菌發(fā)酵)：實(shí)驗(yàn)樣品源于衡水學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

細(xì)菌DNA提取試劑盒(TIANGENDP302-02)、瓊脂糖(TIANGEN RT101)、蛋白酶K(TIANGEN RT403)、溶菌酶(TIANGENRT401)、DNA Marker(TIANGEN)。

2.2 試驗(yàn)方法2.2.1 樣品鏡檢

水果酵素發(fā)酵過(guò)程中所采樣品(正常發(fā)酵樣品和疑似污染的發(fā)酵樣品)，使用無(wú)菌過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾去除果肉組織后10倍稀釋(使用蒸餾水)。取一滴稀釋液，滴至顯微鏡載玻片的中心位置，緩慢的蓋上蓋玻片(蓋玻片與載玻片成45度角)。找到目標(biāo)視野，高倍鏡觀察并拍下照片。

2.2.2 樣品總DNA的提取

分別取水果酵素正常發(fā)酵樣品和污染發(fā)酵樣品的發(fā)酵初期、中期和末期三個(gè)時(shí)期的酵素作為樣品，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總DNA。

總DNA送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行。取樣本微生物DNA中的V4-V5區(qū)，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]、回收，運(yùn)用Illumina Miseq高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)序[15]，得到物種的FASTA序列。

利用MEGA7軟件對(duì)物種進(jìn)行分析，從NABI NR數(shù)據(jù)庫(kù)得到標(biāo)準(zhǔn)菌株的系列，進(jìn)行對(duì)比分析，得到這一菌株的進(jìn)化樹(shù)，即每種菌所包含的種類，對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展示，挖掘數(shù)據(jù)中的有效信息。

3 結(jié)果與分析

3.1 水果酵素鏡檢結(jié)果

把水果酵素(正常發(fā)酵和染菌發(fā)酵)發(fā)酵中期的樣品取出觀察。圖1a所示為水果酵素在正常發(fā)酵中期的鏡檢結(jié)果，能夠看到視野中桿狀菌占到50%。酵素在正常發(fā)酵過(guò)程中含有大量醋酸桿菌和乳酸桿菌。從圖1b中可以看到，桿菌遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于球菌。污染的雜菌多為圓形的球菌。

圖1 水果酵素鏡檢結(jié)果(發(fā)酵中期)

3.2 水果酵素總DNA提取結(jié)果

提取的總DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，得到圖2a三個(gè)樣品的總DNA的清晰條帶。本階段提取的DNA樣品送至深圳華大基因科技服務(wù)有限公司進(jìn)行分析。

圖2 水果酵素DNA(1-發(fā)酵初期，2-發(fā)酵中期，3-發(fā)酵末期)

3.3 宏基因組測(cè)序結(jié)果分析

通過(guò)測(cè)序結(jié)果的分析，得到水果酵素正常發(fā)酵和染菌水果酵素發(fā)酵中細(xì)菌的種類與所占百分比。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析正常發(fā)酵和染菌發(fā)酵細(xì)菌種類的差異，列出表1中24種主要細(xì)菌的對(duì)比結(jié)果。

表1 正常發(fā)酵與染菌水果酵素中的細(xì)菌種類對(duì)比

表1(續(xù))

水果酵素最終產(chǎn)生的各種代謝成分是由多種細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程的各個(gè)階段共同作用形成的。如表1所示的在發(fā)酵中總體數(shù)目較多的24種細(xì)菌，乳酸桿菌和醋酸桿菌在水果酵素的整個(gè)發(fā)酵階段中所占比例相對(duì)較大。

通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)處理，分析得到水果酵素中百分比的細(xì)菌種類有6種，分別是醋酸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、酸硫桿狀菌、明串珠菌、嗜酸菌。下面分別進(jìn)行分析。

圖3 醋酸桿菌進(jìn)化樹(shù)

醋酸桿菌是一類短桿菌，均能使糖類和酒精氧化成醋酸等產(chǎn)物。如圖3所示，水果酵素發(fā)酵過(guò)程的醋酸桿菌有釀酒醋酸桿菌(Acetobacter cerevisiae)、奧爾良醋桿菌(Acetobacter orleanensis)、蘋果酸醋桿菌(Acetobacter malorum)、河口醋桿菌(Acetobacter estunensis)、硝化醋酸桿菌(Acetobacter nitrogenifigens)、干燥醋酸桿菌(Acetobacter sicerae)、歐洲醋桿菌(Acetobacter europaeus)等多種。

醋酸桿菌在總細(xì)菌中的比重隨發(fā)酵時(shí)期的不同而不斷變化。如圖4所示，在正常發(fā)酵過(guò)程中醋酸桿菌隨發(fā)酵的進(jìn)行不斷增加；醋酸桿菌含量從26%升至56%，含量最高。水果酵素發(fā)酵初期的醋酸桿菌隨著發(fā)酵的進(jìn)行增殖代謝越來(lái)越旺盛[16]，可利用糖類生成醋酸等產(chǎn)物。但在染菌酵素中醋酸桿菌的數(shù)量隨著發(fā)酵進(jìn)行不斷減少，從26%降至16%。

圖4 醋酸桿菌在水果酵素發(fā)酵和染菌酵素發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量變化

圖5 乳酸桿菌進(jìn)化樹(shù)

圖6 乳酸桿菌在水果酵素發(fā)酵和染菌酵素發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量變化

如圖5所示，乳酸桿菌包含副酸乳桿菌(Lactobacillus paralimentarius)、乳酸桿菌(Lactobacillus)、未分類乳酸桿菌(Lactobacillusunclassified)。在正常發(fā)酵中，乳酸桿菌在整個(gè)發(fā)酵中緩慢增加，從15%增加至19%在發(fā)酵末期達(dá)到最高。而在染菌發(fā)酵過(guò)程中，乳酸桿菌的數(shù)量初期很低，隨著發(fā)酵的進(jìn)行而增加，但也低于正常發(fā)酵(圖6)。

圖7 芽孢桿菌進(jìn)化樹(shù)

圖8 芽孢桿菌在水果酵素發(fā)酵和染菌酵素發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量變化

如圖7所示芽孢桿菌包含枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)等。在正常發(fā)酵中，芽孢桿菌隨發(fā)酵進(jìn)行百分比降低，從13%降至3%。在染菌發(fā)酵過(guò)程中，芽孢桿菌隨著發(fā)酵進(jìn)行百分比增加(圖8)。

圖9 明串珠菌進(jìn)化樹(shù)

圖10 明串珠菌在水果酵素發(fā)酵和染菌酵素發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量變化

如圖9所示，明串珠菌包含腸系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、酒明串珠菌(Oenococcusoeni)。在水果酵素正常發(fā)酵過(guò)程中，明串珠菌在所有發(fā)酵細(xì)菌中所占百分比隨發(fā)酵進(jìn)行逐步降低，從18%降至7%。明串珠菌在pH值為3.0～6.5時(shí)生長(zhǎng)最好，但隨著發(fā)酵進(jìn)行pH值逐漸降低至3以下，導(dǎo)致明串珠菌減少。而在染菌發(fā)酵中，明串珠菌隨著發(fā)酵的進(jìn)行，不斷增加(圖10)，從3%升至18%。

圖11 嗜酸菌進(jìn)化樹(shù)

圖12 嗜酸菌在水果酵素發(fā)酵和染菌酵素發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量變化

如圖11所示，嗜酸菌主要有嗜酸硫化桿菌(Sulfobacillus acidophilus)系列。水果酵素正常發(fā)酵過(guò)程嗜酸菌百分比不斷增加，從2%增加至6%；而在染菌發(fā)酵過(guò)程中，嗜酸菌的數(shù)量隨著發(fā)酵的進(jìn)行而減少，發(fā)酵中后期僅有2%(圖12)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)水果酵素正常發(fā)酵的初中末期的和染菌發(fā)酵不同階段的樣品取樣，通過(guò)鏡檢、對(duì)DNA進(jìn)行提取、總DNA的PCR擴(kuò)增及宏基因組測(cè)序等步驟測(cè)定酵素發(fā)酵液中細(xì)菌種類及數(shù)量變化。確定了正常發(fā)酵水果酵素中主要含有的細(xì)菌種類，正常發(fā)酵過(guò)程醋酸桿菌、乳酸桿菌、嗜酸菌均逐漸增加，而芽孢桿菌、明串珠菌是逐漸減少的。而染菌發(fā)酵過(guò)程醋酸桿菌不斷降低，腸膜明串珠菌、乳酸鏈球菌和酒明串珠菌的迅速增殖抑制了醋酸桿菌。本次研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在繁殖過(guò)程中相互作用，雜菌的繁殖影響了水果酵素正常代謝，后續(xù)研究可以在發(fā)酵過(guò)程中控制某些細(xì)菌的生長(zhǎng)，使水果酵素發(fā)酵過(guò)程控制在穩(wěn)定的狀態(tài)。