吳逸璇　熊啟

摘 要 從種子壽命的概念出發(fā)，對(duì)其內(nèi)外影響因素、生理機(jī)制進(jìn)行綜述?；跍囟葘?duì)種子貯藏和壽命的影響，對(duì)種子超低溫貯藏技術(shù)的理論基礎(chǔ)、主要方法和貯藏要點(diǎn)進(jìn)行探究，突出強(qiáng)調(diào)了頑拗性種子的超低溫貯藏困境與破解方法。

關(guān)鍵詞 種子壽命;超低溫貯藏;頑拗性種子

中圖分類號(hào)：S339.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.30.105

對(duì)于單個(gè)種子，種子壽命是指種子從完全成熟到喪失生活力所經(jīng)歷的時(shí)間。實(shí)踐中，每粒種子的壽命周期各不相同。因此，種子批的壽命指的是種子群體的發(fā)芽率從種子收獲后到降到50%所經(jīng)歷的時(shí)間，稱為種子的“半活期”。不同植物種子的壽命相差甚大[1]。

1 影響種子壽命的因素

1.1 內(nèi)在因素

種子的物理性狀如種子本身的種皮結(jié)構(gòu)、硬度、種子大小、胚大小等都與種子壽命密切相關(guān)。

種子的化學(xué)性質(zhì)也決定了種子壽命的長短，主要包含種子的化學(xué)組成和生理狀態(tài)。在三大能源貯藏物質(zhì)中，脂肪含量對(duì)種子壽命的影響高于糖類和蛋白質(zhì)類物質(zhì)。原因在于脂肪更為容易酸敗，產(chǎn)生大量有毒物質(zhì)，從而導(dǎo)致種子壽命縮短。因此，含油量較高的種子，如花生種子，往往比其他糖類、蛋白質(zhì)類種子壽命更短，更難以貯藏。含水量的高低會(huì)影響種子的生理狀態(tài)、呼吸強(qiáng)度，繼而影響種子壽命。經(jīng)典的種子生理學(xué)理論認(rèn)為，種子貯藏水分的下限為5%～7%的含水量[2]，若低于此值，會(huì)發(fā)生種子結(jié)構(gòu)或功能的破壞，從而導(dǎo)致種子活力下降。不過隨著研究的進(jìn)展，人們發(fā)現(xiàn)5%～7%含水下限的傳統(tǒng)觀點(diǎn)并非完全適用，種子超干貯藏理論逐漸發(fā)展起來。這種理論旨在應(yīng)用其他方法突破技術(shù)可達(dá)到的種子含水量下限，同時(shí)提高種子的耐藏性[3]。

1.2 環(huán)境因素

種子的生命活動(dòng)是在一定的溫度、濕度、氧氣和光照條件下進(jìn)行的，這些環(huán)境因子的變化都會(huì)直接或間接影響種子壽命。隨著環(huán)境溫度的升高，種子的代謝活動(dòng)加快，種子的貯藏壽命隨之縮短。經(jīng)過干燥處理后的種子，可以在零下低溫條件下長期貯藏，且不會(huì)造成種子結(jié)構(gòu)的破壞和進(jìn)而導(dǎo)致的生活力降低，因此，目前超低溫貯藏這一方向已成為種子貯藏的熱門研究領(lǐng)域。

同時(shí)，在長時(shí)間的日光照射下，種子溫度會(huì)相應(yīng)提高，促進(jìn)脂肪的氧化，從而導(dǎo)致種子失去活力，壽命縮短。室內(nèi)散光雖然長時(shí)間作用于種子，但不會(huì)起顯著影響[4]。

2 決定種子壽命的生理機(jī)制

2.1 有毒物質(zhì)積累

在種子劣變過程中，各種生理活動(dòng)產(chǎn)生的有毒物質(zhì)逐漸積累，如無氧呼吸產(chǎn)生的酒精和CO2，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的胺類物質(zhì)，脂質(zhì)氧化作用產(chǎn)生的自由基[5]等，這些物質(zhì)都會(huì)對(duì)種子產(chǎn)生毒害作用，致使其生理活性降低，乃至死亡。另外，其他的代謝產(chǎn)物如多種醛類、酚類、酸類物質(zhì)都會(huì)對(duì)種子的正常生理功能產(chǎn)生損害。同樣，過量的植物生長調(diào)節(jié)劑，如吲哚乙酸（IAA）等也會(huì)抑制種子的正常生理過程。

2.2 脂質(zhì)過氧化

脂質(zhì)過氧化和自由基增生是種子劣變的重要原因。脂質(zhì)過氧化不但會(huì)損害膜結(jié)構(gòu)，近些年來，關(guān)于脂質(zhì)過氧化對(duì)DNA的損害理論也逐漸發(fā)展起來。一般認(rèn)為，DNA的鳥嘌呤（G）最容易受脂質(zhì)過氧化的危害，由于G堿基被占據(jù)的最高分子軌道是最高的，因而最容易被氧化。當(dāng)種子老化到一定程度，核酸的修復(fù)能力下降，當(dāng)核酸損傷到某一臨界值后，種子將變成無活力種子。同時(shí)，脂氧合酶（LOX）是直接反應(yīng)生成脂肪酸氫過氧化物的關(guān)鍵酶，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。LOX活性增加，種子劣變加速，活力下降，壽命變短。

3 種子超低溫貯藏技術(shù)概述

3.1 理論基礎(chǔ)

種子超低溫貯藏是指利用液態(tài)氮（-196 ℃）為冷源，將種子等生物材料置于超低溫（<-80 ℃）下，使其新陳代謝活動(dòng)處于基本停止?fàn)顟B(tài)而達(dá)到的長期貯藏種子的方法。在如此低溫下，由于種子代謝過程的停止，減少了與代謝有關(guān)的劣變，從而極大地延長了種子壽命。

種子內(nèi)部的一切生理過程都以水為機(jī)制，如果可以將液態(tài)水轉(zhuǎn)化為固態(tài)水或氣態(tài)水，可以有效地控制種子內(nèi)部的生理活性。在液態(tài)水缺失的狀態(tài)下，種子處于“假死”狀態(tài)，同時(shí)水的狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)化是可逆的，故當(dāng)恢復(fù)到正常液體狀態(tài)后，植物種子又可以表現(xiàn)出正常的生理活性。因此，從理論上講，種子在超低溫保存過程中不會(huì)發(fā)生遺傳性狀和形態(tài)發(fā)生潛能的改變[6]。

然而，在降溫過程中，如果種子內(nèi)部的水分發(fā)生結(jié)冰現(xiàn)象，會(huì)造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，乃至死亡。因此，植物種子超低溫貯藏成功的關(guān)鍵，在于避免細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在降溫過程中，如果溶液內(nèi)沒有形成均一晶核或晶核沒有充足的時(shí)間繼續(xù)生長，便會(huì)形成過冷溶液;如果繼續(xù)降溫，會(huì)形成均一晶核：如果降溫速度較為緩慢，會(huì)形成尖銳的冰晶，如果降溫速度足夠快，細(xì)胞會(huì)來不及形成冰晶而直接被“固化”成玻璃態(tài)。在玻璃化形成過程中，則不會(huì)因產(chǎn)生大型冰晶而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械損傷。因此，在實(shí)際操作的冰凍過程中，先將種子經(jīng)過滲透性化合物處理后，快速投入液氮，便會(huì)保持無定形態(tài)，避免結(jié)冰現(xiàn)象對(duì)細(xì)胞造成的損害[7]。

同時(shí)，在快速解凍過程中，同樣可以使用高濃度大分子的冰凍保護(hù)劑并增大壓力，來增強(qiáng)“玻璃化”現(xiàn)象，從而保證種子復(fù)蘇后的活力。

3.2 超低溫貯藏的主要方法

超低溫保存的方法多種多樣，包括玻璃化法、兩步法、預(yù)凍法、包埋脫水法等。在實(shí)際運(yùn)用中，以玻璃化法和兩步法最為常用。

3.2.1 玻璃化法

樣品在加入冰凍保護(hù)劑和脫水處理之后快速投入液氮中，運(yùn)用了玻璃化原理，避免了大型冰晶的形成，保護(hù)細(xì)胞的形態(tài)與活力。該方法具有操作簡(jiǎn)易性、高度重演性、普適性等特點(diǎn)，因而得到廣泛利用。

3.2.2 兩步法

樣品在加入冰凍保護(hù)劑和脫水處理后，用程序降溫儀，以速率0.1～10.0 ℃·min-1降溫至-40～-70 ℃，然后投入液氮中。

3.3 超低溫貯藏技術(shù)的關(guān)鍵影響因素

3.3.1 種子含水量

針對(duì)超低溫冷凍貯藏，種子含水量是關(guān)鍵的限制因素。種子含水量過高，則會(huì)在冷凍和解凍過程中加劇細(xì)胞的死亡，含水量過低又會(huì)導(dǎo)致種子生活力的部分喪失。不同的植物品種種子有其不同的含水量臨界值，即適合于冷凍保存的最高含水量（High moisture freezing limits，HMFL）。若種子含水量超過HMFL，冷凍到一定溫度，種子會(huì)死亡[8]。

3.3.2 冷凍保護(hù)劑

植物種子在超低溫冷凍過程中，需要為其營造一個(gè)適宜的條件，以避免其受到冰凍傷害。研究表明，冰凍保護(hù)劑具有較好的保護(hù)效果，關(guān)于冷凍保護(hù)劑的使用量，應(yīng)該取適宜的量，不宜過多，也不宜過低。過多會(huì)使細(xì)胞中毒并因滲透壓變化而導(dǎo)致一系列破壞，過少又不足以起到冷凍保護(hù)效果。研究還發(fā)現(xiàn)，保護(hù)劑混合使用比單獨(dú)使用效果更好，目前比較主流的觀點(diǎn)認(rèn)為其之間存在協(xié)同效應(yīng)[9]。

4 頑拗性種子的超低溫貯藏

影響頑拗性種子超低溫貯藏的因素有很多，包括取材部位、發(fā)育階段、含水量、冷凍保護(hù)劑的使用、降溫速度和解凍速度等。

1）在近些年的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用離體胚或胚軸為材料時(shí)，頑拗性種子的超低溫保存效果較好，因?yàn)殡x體胚或胚軸體積較小，可以在短時(shí)間內(nèi)脫水，而胚自身相比整個(gè)頑拗性種子有較強(qiáng)的抗逆能力。2）隨著研究的逐漸深入，利用超低溫貯藏可以實(shí)現(xiàn)某些種子的成功保存。在Hirano關(guān)于白芨不成熟種子的玻璃化貯藏研究中，成功運(yùn)用3種不同低溫保存方案實(shí)現(xiàn)了白芨種子的超低溫貯藏[10]。3）頑拗性種子也存在一個(gè)最高的凍結(jié)含水量，不同點(diǎn)在于頑拗性種子具有較高限度的最低安全含水量。而當(dāng)種子的最低安全含水量低于最高凍結(jié)含水量時(shí)，超低溫貯藏便具有較高的可行性。4）冷凍保護(hù)劑的使用可以有效地減少超低溫貯藏對(duì)頑拗性種子活力造成的損害。5）對(duì)于頑拗性種子來說，較快的降溫速度是較為理想的，因?yàn)檫@樣可以因細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的玻璃化而減少大型冰晶的形成，減少傷害。

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（責(zé)任編輯：趙中正）