盧雯瑩 崔賀云 高杉 崔順梅 吳營(yíng)照

摘? ? 要：小麥（Triticum aestivuml）是世界上廣泛種植的糧食作物，在逐漸提高小麥產(chǎn)量的同時(shí)，高產(chǎn)與倒伏之間的矛盾問(wèn)題日益顯現(xiàn)。木質(zhì)素是一種酚類多聚體，它是維管植物細(xì)胞壁中不可忽視的重要成分，其在植物中的含量與莖稈是否具有抗倒伏性以及抗倒伏的強(qiáng)弱密切相關(guān)。肉桂醇脫氫酶（CAD）是木質(zhì)素單體合成途徑下游的一個(gè)關(guān)鍵酶，大部分植株木質(zhì)素的總含量會(huì)在CAD活性降低或受抑制時(shí)隨之降低。本文綜述了肉桂醇脫氫酶基因及其在小麥抗倒伏中的研究進(jìn)展，有望對(duì)小麥肉桂醇脫氫酶基因的克隆表達(dá)分析及其對(duì)小麥抗倒伏的影響作用奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：肉桂醇脫氫酶;木質(zhì)素;小麥;抗倒伏

中圖分類號(hào)：S512.1? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.10.002

Research Progress of Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase Gene and Its Application in Lodging Resistance in Wheat

LU Wenying1， CUI Heyun2， GAO Shan1， CUI Shunmei3， WU Yingzhao3

（1.Luohe Academy of? Agricultural Science， Luohe， Henan 462300，China; 2.Luohe Agricultural and Rural Bureau， Luohe，Henan 462300，China;3.Golden Autumn Seed Industry Limited company of Luohe， Luohe，Henan 462300，China）

Abstract： Wheat （Triticum aestivuml） is a widely cultivated crop in the world. The production of wheat is highly increasing in recent years. However， high yield in wheat often causes lodging. Lignin is a phenolic polymer. It is an important component of vascular plant cell walls， and its content in plants is closely related to lodging resistance. Cinnamol alcohol dehydrogenase （CAD） is a key enzyme of downstream about lignin monomer synthesis pathway. The total lignin content of most plants will decrease with CAD activity decreased or inhibited. This paper reviewed the effects of CAD gene on lodging resistance of wheat. It may help the cloning and expression analysis of CAD gene and its further impacts on wheat lodging resistance in the future.

Key words： Cinnamyl Alcohol Dehydrogenase; Lignin; Triticum aestivuml; anti-lodging

小麥?zhǔn)且荒晟瘫究谱魑?，在世界范圍?nèi)廣泛種植，隨著栽培技術(shù)的不斷改進(jìn)、分子輔助育種技術(shù)的不斷發(fā)展，小麥生產(chǎn)水平逐漸提高。然而，高產(chǎn)和倒伏之間的矛盾也逐漸凸顯。小麥在籽粒灌漿以后的一段時(shí)期容易發(fā)生倒伏，倒伏一旦發(fā)生，將大大影響小麥產(chǎn)量，一般情況下會(huì)導(dǎo)致小麥減產(chǎn)達(dá)到10%～30%，嚴(yán)重倒伏的可能減產(chǎn)80% 以上[1]。因此，解決小麥的倒伏問(wèn)題是當(dāng)前研究小麥品質(zhì)的重要方向。

木質(zhì)素與纖維素、半纖維素一起構(gòu)成次生壁。多位學(xué)者的研究表明，植株莖稈強(qiáng)度與相應(yīng)的木質(zhì)素含量之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系。因此，通過(guò)促進(jìn)木質(zhì)素總量的提升或改變木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)的構(gòu)成可以提升莖稈抗折力。

木質(zhì)素的合成路徑較為復(fù)雜。在這個(gè)合成過(guò)程中涉及很多關(guān)鍵酶基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控機(jī)制。本文選取了木質(zhì)素單體合成下游中關(guān)鍵的還原酶，即肉桂醇脫氫酶（CAD）進(jìn)行相關(guān)論述分析。CAD 在NADP輔酶的作用下將5種肉桂醇（香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羥基松柏醛、芥子醛）還原成相對(duì)應(yīng)的醇（香豆醇、咖啡醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）。已有研究表明，抑制CAD的活性會(huì)降低木質(zhì)素含量或改變木質(zhì)素單體結(jié)構(gòu)。

1 肉桂醇脫氫酶基因的結(jié)構(gòu)特征

CAD是醇脫氫酶蛋白，具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域：一是醇脫氫酶GroES-like結(jié)構(gòu)域（Alcohol dehydrogenase GroES-like domain），它是CAD酶的活性中心，包括與鋅結(jié)合的催化位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，而這一結(jié)構(gòu)也是醇脫氫酶家族中所共有的結(jié)構(gòu);二是Rossmann折疊輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。除此之外，這個(gè)家族中有一個(gè)能與底物特異性結(jié)合的底物結(jié)構(gòu)域[2]。

在被子植物中，CAD基因在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段由多基因家族編碼而發(fā)揮不同作用，這些CAD基因相似性比較高，因此對(duì)單個(gè)基因功能的鑒定比較困難。高粱CAD6和水稻CAD6在C端都有一個(gè)過(guò)氧化物體定位信號(hào)肽SKL，這在植物中是普遍存在的[3]。水稻的12個(gè)CAD基因和桉樹(shù)CAD2在NAD（P）/NAD（P）H結(jié)構(gòu)域上存在保守的Ser-212。此外，水稻的CAD2中存在保守的Trp-119和Phe-298[4]，這些證據(jù)表明CAD基因在物種進(jìn)化過(guò)程中保持穩(wěn)定性。馬慶虎等[5]從小麥中分離出一條編碼CAD基因的cDNA，并從小麥EST數(shù)據(jù)庫(kù)中得到其他10個(gè)CAD類似基因，連續(xù)命名為TaCAD2-TaCAD11。他的研究認(rèn)為：TaCAD1基因?qū)儆谡嬲幕蚣易宀⑴c木質(zhì)素合成，TaCAD2 和TaCAD4也屬于這一家族，但由于缺乏C末端結(jié)構(gòu)域因而被認(rèn)為是假基因。TaCAD1的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖與AtCAD5相似，但是在底物結(jié)合區(qū)域有兩個(gè)氨基酸被替換。

2 肉桂醇脫氫酶基因的家族和分類

由于核苷酸和氨基酸序列之間存在差異因而可將CAD基因分成三種類型，其中只有一種類型參與了木質(zhì)素的生物合成并發(fā)揮重要作用，這一類型的CAD在NADP輔酶的作用下將肉桂醇（香豆醛、咖啡醛、松柏醛、5-羥基松柏醛、芥子醛）還原成相對(duì)應(yīng)的醇（香豆醇、咖啡醇、松柏醇、5-羥基松柏醇、芥子醇）;尚未發(fā)現(xiàn)另外兩種CAD類型在木質(zhì)素合成中發(fā)揮作用，有可能是第一種類型的假基因或是參與了其他代謝活動(dòng)[6]。

許多學(xué)者的研究均表明CAD基因是以基因家族的形式存在的，但是CAD基因功能各不相同，有的CAD基因參與木質(zhì)素生物合成，有的CAD基因與發(fā)揮主要作用的CAD基因互相補(bǔ)充共同作用，還有的CAD基因并不發(fā)揮任何作用。植物中一些已經(jīng)被克隆和已研究清楚的CAD基因家族情況如表1所示。

3 肉桂醇脫氫酶基因的研究進(jìn)展

3.1 肉桂醇脫氫酶基因的克隆

NCBI網(wǎng)站上已經(jīng)注冊(cè)的完整的CAD基因的mRNA有200條左右，包括擬南芥、水稻、小麥、棉花、高粱、毛白楊和茶樹(shù)等等。雖然不同種屬的CAD基因家族各有不同，但是在CAD基因系統(tǒng)進(jìn)化上還具有一定的保守性。NCBI中很多是CAD類似基因，與真正的CAD基因同源性并不是很高，其蛋白結(jié)構(gòu)、酶學(xué)特征也沒(méi)有完全揭示。

3.2 肉桂醇脫氫酶在木質(zhì)素合成中的調(diào)控

前人研究表明，通過(guò)CAD基因的正義和反義表達(dá)以及突變體的發(fā)生來(lái)調(diào)整木質(zhì)素的總含量及木質(zhì)素單體的比例，目前在楊樹(shù)、松樹(shù)、高粱、水稻和玉米等植物中均有研究。大部分植株在CAD活性受到抑制時(shí)，木質(zhì)素的總含量會(huì)降低;還有一部分木質(zhì)素總量不發(fā)生變化但木質(zhì)素單體的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變或發(fā)生其他情況的變化，具體見(jiàn)表2。

3.3 肉桂醇脫氫酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的研究

以上論述已經(jīng)表明在不同品種植株中CAD基因的功能各不相同，即使在同一植株中，不同的器官、組織和不同的生育時(shí)期其表達(dá)量也不盡相同。

楊樹(shù)CAD基因家族中有19個(gè)CAD基因，按照其表達(dá)模式的不同可以分成三類：一類在韌皮部、木質(zhì)部高度表達(dá)，二類在根部高度表達(dá)，三類在根和頂芽中高度表達(dá)。除了表達(dá)部位不同外，一二類表達(dá)量隨時(shí)間推移不斷增加而三類在夏季和秋季的表達(dá)量明顯高于春季和冬季[16]。

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)對(duì)擬南芥的9個(gè)CAD基因進(jìn)行表達(dá)研究，其中AtCAD2和AtCAD3在木質(zhì)部中并沒(méi)有熒光信號(hào)，但是在其根冠和分生組織有表達(dá)。AtCAD4和AtCAD5在根中高度表達(dá)。此外，AtCAD在花中是高度表達(dá)，但在莖中表達(dá)量較低[17]。

對(duì)小麥TaCAD1基因的功能分析發(fā)現(xiàn)，小麥TaCAD1基因在莖稈中高度表達(dá)，在葉片中有微量的表達(dá)而在根中幾乎不表達(dá)，并且與不抗倒伏的品種C6001相比，抗倒伏品種H4564的mRNA表達(dá)豐度、蛋白水平和酶活性水平都明顯較高[5]。

不僅如此，CAD基因還與植株生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期相關(guān)。枇杷和綠梅在果實(shí)不斷成熟的過(guò)程中，枇杷EjCAD1和綠梅肉桂醇脫氫酶Pm15的活性和表達(dá)量都是在不斷增加的[18]。

3.4 肉桂醇脫氫酶基因的啟動(dòng)子分析

啟動(dòng)子是基因的一個(gè)構(gòu)成元件，CAD基因的啟動(dòng)子可以控制CAD基因什么時(shí)候表達(dá)，也可以控制CAD基因的表達(dá)程度。楊樹(shù)中PoptrCAD基因的啟動(dòng)子有多個(gè)組成部分，在白楊不同的生育時(shí)期、不同器官和組織中有不同的組分參與調(diào)控PoptrCAD基因的表達(dá)。同時(shí)，在遇到干旱、洪澇、病蟲害等因素脅迫時(shí)，該基因可以與Myb、鋅指蛋白等調(diào)控因子結(jié)合，也可以和ABA、生長(zhǎng)素等信號(hào)分子結(jié)合共同產(chǎn)生應(yīng)答機(jī)制[19]。在甘薯的啟動(dòng)子研究中也得出類似結(jié)論：出現(xiàn)外界作用時(shí)，甘薯IbCAD1的啟動(dòng)子會(huì)有明顯的響應(yīng)機(jī)制[20]。

4 肉桂醇脫氫酶基因?qū)π←溈沟狗杂绊懙恼雇?/p>

莖倒伏是小麥發(fā)生倒伏的主要位置，也是小麥實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)的主要威脅因素[21]。木質(zhì)素通過(guò)自身交織來(lái)使細(xì)胞壁加厚，能起到良好的抗壓作用[22]。木質(zhì)素合成的路徑比較復(fù)雜，有很多因素參與調(diào)控木質(zhì)素的合成。在木質(zhì)素的整個(gè)合成過(guò)程中參與調(diào)控的基因包括苯丙氨酸解氨酶基因（Phenylalanine ammonia-lyase，PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（cinnamate acid-4-hydroxylase，C4H）、香豆酸-3-羥化酶（p-coumarate 3-hydroxylase，C3H）、咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（Caffeic acid-O-methyltransferase，COMT）、咖啡酰輔甲基轉(zhuǎn)移酶A-O酶（caffeoyl-CoA O-methyltransferase， CCoAOMT）、4-香豆酸：輔酶A連接酶（The 4-coumarate： coenzyme A ligase，4CL）、肉桂酰輔酶A 還原酶（cinnamoyl-CoA reductase，CCR）、CAD基因等。肉桂醇脫氫酶基因在催化木質(zhì)素合成途徑中，于木質(zhì)素單體生物合成的最終步驟發(fā)揮作用，這決定了其是不可或缺的關(guān)鍵酶之一，其結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性的分析將會(huì)對(duì)小麥抗倒伏性的研究提供理論基礎(chǔ)。

目前，已知的參與植物抗逆的轉(zhuǎn)錄因子研究成為增強(qiáng)植物抗逆性的重要方向之一，加之分子生物技術(shù)已相對(duì)成熟，我們可以根據(jù)已有的研究基礎(chǔ)，對(duì)肉桂醇脫氫酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及ChIP-seq分析，挖掘肉桂醇脫氫酶基因上游調(diào)控因子。在大數(shù)據(jù)背景支持下分析新的與小麥肉桂醇脫氫酶基因共同參與小麥抗倒伏的機(jī)制，嘗試是否能夠在某些與木質(zhì)素合成相關(guān)的基因片段等進(jìn)行編輯處理，研究其相關(guān)功能。在基本清楚小麥肉桂醇脫氫酶基因參與木質(zhì)素合成途徑的作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，利用分子育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)其在小麥抗倒伏中的應(yīng)用，有利于培育品質(zhì)更加優(yōu)異的小麥品種。

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收稿日期：2020-06-16

作者簡(jiǎn)介：盧雯瑩（1994—），女，河南漯河人，研究實(shí)習(xí)員，碩士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。