蔡惠麗 鄒雅倩 周 蜜 王勃霏 易 虹 王樹林 郭靜明

(三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 血液內(nèi)科 & 三峽大學(xué) 血液病研究所， 湖北 宜昌 443003； 2. 三峽大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院[宜昌市中心人民醫(yī)院] 脊柱外科， 湖北 宜昌 443003)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一種獲得性自身免疫性疾病，約占臨床出血性疾病的1/3，其特征是原因不明的單純血小板減少[1, 2]，迄今為止其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。目前學(xué)者普遍認(rèn)為機(jī)體免疫功能紊亂在ITP發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮核心作用[3]。

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后一種重要的修飾過程。糖基化與固有免疫和適應(yīng)性免疫密切相關(guān)，參與免疫細(xì)胞的活化與凋亡、抗原的處理與遞呈以及補(bǔ)體活化等過程[4, 5]。已有研究證實(shí)，ITP患者血小板脫糖基化水平較正常人明顯增高，而且ITP的治療效果與脫糖程度呈負(fù)相關(guān)，顯著脫糖基化的患者可能對(duì)傳統(tǒng)的藥物治療和脾臟切除術(shù)無反應(yīng)[6, 7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌MA782細(xì)胞表面N糖β1，6-GlcNAc分支的表達(dá)降低能夠誘導(dǎo)骨髓來源的巨噬細(xì)胞發(fā)生M1型極化，促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)展[8]。同時(shí)我們檢測(cè)了部分ITP患者的血小板標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)其表面N糖β1，6-GlcNAc分支的表達(dá)水平較正常血小板降低。而ITP血小板N糖支鏈異常與患者免疫狀態(tài)的相互關(guān)系目前尚未明確。本研究擬通過體外實(shí)驗(yàn)探討N糖β1，6-GlcNAc分支缺陷的血小板對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠動(dòng)物模型建立及血小板獲取

無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)BALB/c小鼠10只，雌性，體重為(18±2) g，去離子水配置1 mg/mL苦馬豆素(Sigma)，5只按照6 mg/kg劑量進(jìn)行灌胃，1次/d。連續(xù)灌胃1周后，眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠。取EDTA抗凝血，室溫150 g離心15 min后取上清，獲得富含血小板血漿。調(diào)整血小板濃度為107/mL。

1.2 血小板表面N糖β1，6-GlcNAc表達(dá)水平檢測(cè)

取以上血小板溶液100 μL，加入FITC-L-PHA (Vector Laboratories) 5 μL，室溫孵育30 min，500 μL PBS溶液洗滌1次， 500 μL PBS溶液重懸后上流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto II)檢測(cè)，以平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)表示β1，6-GlcNAc相對(duì)表達(dá)量。

1.3 骨髓來源巨噬細(xì)胞獲取及培養(yǎng)

參照課題組前期實(shí)驗(yàn)方法獲取和培養(yǎng)骨髓來源巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages，BMDMs)[8]。培養(yǎng)基的配置方法為DMEM(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)中加入2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素、0.37%(wt/vol)NaHCO3、10%熱滅活的胎牛血清，再加入10%(vol/vol)的L929細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)來源。處死正常SPF級(jí)BALB/c小鼠， 75%醫(yī)用酒精浸泡消毒后，在超凈工作臺(tái)內(nèi)取其股骨及脛骨骨髓內(nèi)細(xì)胞于離心管內(nèi)，1 000 rpm離心5 min去上清，紅細(xì)胞裂解液(武漢眾一生物)破紅，培養(yǎng)液重懸骨髓細(xì)胞，加入13 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)至100 mm培養(yǎng)皿。去除貼壁細(xì)胞后，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×105/mL，轉(zhuǎn)至12孔培養(yǎng)板中。在37℃、10%CO2條件下培養(yǎng)5～7 d，隔天更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次。

1.4 血小板與骨髓來源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)

將巨噬細(xì)胞與血小板按照1∶20的比例在6孔板中進(jìn)行共培養(yǎng)，每孔含2×105的巨噬細(xì)胞與4×106的血小板，在37℃、10%CO2培養(yǎng)48 h，離心收集上清及巨噬細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞表面分子

將收集的巨噬細(xì)胞重懸在含1%胎牛血清的PBS緩沖液中，分別加入10 μL PE-anti-F4/80 (eBioscience)、10 μL PE-anti-CD16/32 (BD Biosciences)、10 μL PE-anti-CD206(BD Biosciences)、10 μL PE-anti-Dectin-1 (BD Biosciences)抗體，孵育30 min，洗滌后常規(guī)上流式細(xì)胞儀(BD FACSCanto II)檢測(cè)，以陽性率及MFI表示以上各分子的表達(dá)量。

1.6 RT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和精氨酸酶1的mRNA水平

TRIZOL法提取細(xì)胞總RNA，按照SYBR Green PCR Kit(QIAGEN)說明書方法進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Applied Biosystems)檢測(cè)巨噬細(xì)胞中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和精氨酸酶1(arginase-1，Arg-1)的mRNA水平。反應(yīng)條件如下：95℃加熱5 min后，95℃加熱10 s，59℃退火15 s，72℃延伸20 s，30個(gè)循環(huán)。引物序列如下：iNOS上游引物5′-CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTG-3′，下游引物5′-GGAGTAG-CCTGTGTGCACCTGGAA-3′；Arg-1上游引物5′-CAGAAGAATGGAAGAGTCAG-3′，下游引物5′-CAGATATGCAGGGAGTCACC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。引物由上海生工合成，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后得出各組靶基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.7 上清中亞硝酸鹽含量測(cè)定(Griess法)

取離心后收集的共培養(yǎng)上清100 μL，加入100 μL的Griess試劑(武漢眾一生物)，室溫放置20 min后，以完全培養(yǎng)基加顯色劑作為空白對(duì)照，酶標(biāo)儀(Thermo)540 nm處測(cè)定各孔的吸光度值，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 巨噬細(xì)胞中精氨酸酶活性測(cè)定

將收集的巨噬細(xì)胞用PBS溶液洗滌，按照精氨酸酶測(cè)定試劑盒(Arginase Activity Assay Kit)操作說明，調(diào)整各組細(xì)胞數(shù)為1×106個(gè)，測(cè)定各組精氨酸酶活性(結(jié)果以尿素濃度表示)。每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 白介素-10及腫瘤壞死因子-ɑ含量測(cè)定

按照ELISA kit (eBioscience)說明書方法，測(cè)定各組上清中白介素(interleukin，IL)-10及腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-ɑ含量。

1.10 統(tǒng)計(jì)分析

各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來自3次實(shí)驗(yàn)的平均值，表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，采用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)作圖軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析，P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建β1，6-GlcNAc分支表達(dá)缺陷血小板

FITC-L-PHA凝集素結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果顯示，苦馬豆素灌胃后小鼠體內(nèi)血小板表面β1，6-GlcNAc分支表達(dá)較正常小鼠明顯降低(見圖1)，表明本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建β1，6-GlcNAc分支表達(dá)缺陷血小板，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板誘導(dǎo)BMDMs中iNOS表達(dá)

按照課題組前期的實(shí)驗(yàn)方法，我們成功誘導(dǎo)培養(yǎng)出小鼠BMDMs，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示巨噬細(xì)胞表面特異性分子F4/80表達(dá)陽性率達(dá)93%，表明該巨噬細(xì)胞可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，BMDMs與β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共培養(yǎng)后，其iNOS mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組增加，而Arg-1 mRNA表達(dá)水平較正常對(duì)照組降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖2，均P<0.001)。另外，BMDMs與β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共培養(yǎng)后，其Arg-1 活性(反映為尿素濃度)較正常對(duì)照組降低(見圖3A，P=0.000 3)，而其iNOS活性(反映為培養(yǎng)基上清中亞硝酸鹽的含量)較對(duì)照組顯著增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3B，P=0.012 8)。

2.3 β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板誘導(dǎo)BMDMs表面CD16/32表達(dá)

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，與β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共培養(yǎng)后，BMDMs表面分子CD16/32的平均熒光強(qiáng)度較對(duì)照組明顯升高，而CD206及Dectin-1表達(dá)下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖4，均P<0.05)。

2.4 β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板調(diào)節(jié)BMDMs表達(dá)TNF-ɑ與IL-10

ELISA法檢測(cè)結(jié)果表明，與β1，6-GlcNAc分支缺陷血小板共孵育后，BMDMs培養(yǎng)上清中TNF-ɑ的含量較對(duì)照組升高，IL-10的含量較對(duì)照組降低，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖5，均P<0.05)

3 討論

蛋白質(zhì)糖基化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要修飾，N-乙酰氨基糖基轉(zhuǎn)移酶(N-acetylglucosamine transferase，簡(jiǎn)稱GnT)是N-糖鏈合成的的中心環(huán)節(jié)，其中N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶V，簡(jiǎn)稱GnT-V 或Mgat5，是合成N-糖鏈β1，6-GlcNAc 分支的關(guān)鍵酶。由于血小板結(jié)構(gòu)的特殊性(無細(xì)胞核)，我們無法通過RNAi技術(shù)沉默Mgat5的表達(dá)從而獲得β1，6-GlcNAc 糖鏈分支表達(dá)缺陷的血小板?？囫R豆素作為高爾基復(fù)合體內(nèi)ɑ-甘露糖苷酶II的抑制劑，一直是研究糖蛋白N-連接寡糖合成的工具藥，近年來也發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗腫瘤效應(yīng)[9]?？囫R豆素作用于Mgat5催化的上游階段，能夠?qū)е娄?，6-GlcNAc 糖鏈分支表達(dá)缺陷。本研究中我們通過苦馬豆素灌胃動(dòng)物模型[10]獲取了N糖鏈表達(dá)缺陷的血小板。通過L-PHA凝集素結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，我們所獲取的血小板表面β1，6-GlcNAc 分支表達(dá)水平明顯較正常組降低，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

巨噬細(xì)胞是一類在體內(nèi)發(fā)揮重要免疫效應(yīng)的細(xì)胞，為機(jī)體穩(wěn)態(tài)維持和組織防御提供保障。一方面可以通過吞噬作用直接降解病原微生物和異源物質(zhì)，另一方面可通過與多種其他免疫細(xì)胞如NK細(xì)胞、T細(xì)胞相互作用而進(jìn)一步發(fā)揮防御功能。巨噬細(xì)胞的極化可以分為M1型和M2型兩大類，其中M1型巨噬細(xì)胞，也稱經(jīng)典活化型巨噬細(xì)胞，具有很強(qiáng)的致炎和微生物殺傷作用，并可促進(jìn)IL-12等炎性因子介導(dǎo)的Thl細(xì)胞應(yīng)答；而M2型巨噬細(xì)胞則支持Th2細(xì)胞相關(guān)的效應(yīng)功能，具有組織修復(fù)和免疫調(diào)節(jié)的作用；并且隨著巨噬細(xì)胞活化狀態(tài)的變化，保護(hù)性的Th2型細(xì)胞可向Thl型細(xì)胞轉(zhuǎn)變[11]。目前對(duì)于巨噬細(xì)胞的極化檢測(cè)，尚無單一的特異性標(biāo)志，一般從巨噬細(xì)胞表面分子表達(dá)、分泌細(xì)胞因子、iNOS及Arg-1的表達(dá)等多個(gè)方面綜合判定。本實(shí)驗(yàn)中，BMDMs經(jīng)過培養(yǎng)后表面巨噬細(xì)胞特異性分子F4/80表達(dá)顯著增高，表明BMDMs的培養(yǎng)獲得成功。BMDMs與β1，6-GlcNAc分支表達(dá)缺陷的血小板共同孵育后，巨噬細(xì)胞表面CD16/32表達(dá)、iNOS mRNA表達(dá)、培養(yǎng)上清中TNF-ɑ的表達(dá)都較對(duì)照組明顯升高，這表明β1，6-GlcNAc分支表達(dá)缺陷的血小板能夠誘導(dǎo)BMDMs體外發(fā)生M1型極化。

ITP患者血小板表面N糖鏈β1，6-GlcNAc分支表達(dá)缺陷和ITP發(fā)生發(fā)展的相互關(guān)系目前尚不明確。有研究顯示，Mgat5基因敲除的小鼠(Mgat5-/-小鼠)因β1，6-GlcNAc支鏈表達(dá)缺陷易發(fā)生自身免疫疾病，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎、腎炎、糖尿病和多發(fā)性硬化等，且遲發(fā)型超敏反應(yīng)增強(qiáng)[12-14]。而且，N-糖β1，6GlcNAc分支表達(dá)水平與自身免疫性疾病的易感性呈負(fù)相關(guān)[14]，該現(xiàn)象可能與TCR活化閾值下降、Th1細(xì)胞向Th2細(xì)胞極化及巨噬細(xì)胞活化等相關(guān)[4, 15]。ITP作為一種自身免疫性疾病，越來越多的證據(jù)表明，蛋白質(zhì)的糖基化水平異常在ITP的發(fā)病過程中也發(fā)揮著重要作用。如前所述，ITP患者血小板脫糖基化水平較正常人明顯增高，ITP的治療效果與脫糖程度呈負(fù)相關(guān)[6, 7]。有文獻(xiàn)報(bào)道，ITP血小板膜糖蛋白去唾液酸化暴露糖鏈上的半乳糖(Gal)或進(jìn)一步脫半乳糖殘基暴露N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)殘基，分別與肝細(xì)胞上的AMR受體(ashwell-morell receptors)及巨噬細(xì)胞上的ɑMβ2(MAC-1)受體結(jié)合而被吞噬清除[16]。有ITP患者采用抗病毒藥物奧司他韋(亦是一種唾液酸酶抑制劑)治療后血小板計(jì)數(shù)恢復(fù)正常[17]。以上研究結(jié)果均證實(shí)了非Fc受體依賴的血小板破壞理論，也表明了蛋白質(zhì)糖基化水平異常與ITP的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[18，19]。

本實(shí)驗(yàn)采用β1，6-GlcNAc 分支表達(dá)缺陷的血小板與BMDMs體外共同孵育后發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞發(fā)生了M1型極化，但M1型巨噬細(xì)胞后續(xù)如何影響機(jī)體免疫功能，其是否參與ITP的發(fā)生過程，巨噬細(xì)胞的M1型極化是否是ITP的始動(dòng)因素等問題，尚待進(jìn)一步研究。