王子苑， 舒健虹， 王小利， 尚以順

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550006)

光葉紫花苕(ViciavillosaRothvar.glabresensKoch)又名光葉紫花苕子、稀毛苕子等，為越年生或一年生雙子葉植物綱豆科巢菜屬植物，其具有適應(yīng)性廣、生物量大、耐寒、耐旱、耐貧瘠等特點(diǎn)。我國(guó)于20世紀(jì)40年代引入江蘇，而后在河南、山東、安徽、湖北、云南、四川、貴州、新疆等省市推廣栽培。光葉紫花苕作為豆科綠肥，有特殊的生物固氮能力，能增加土壤肥力，在貧瘠土地上連續(xù)種植2～3季，土壤肥力能得到明顯提升[1]。同時(shí)，光葉紫花苕適口性好，柔嫩多汁，蛋白質(zhì)含量高，碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)含量豐富，是冬春季節(jié)畜禽主要的青綠飼草來(lái)源。徐然等[2]分析表明，初花期光葉紫花苕干物質(zhì)含量28.08%，粗蛋白含量25.01%，中性洗滌纖維含量為43.1%，酸性洗滌纖維含量為30.8%。目前，關(guān)于光葉紫花苕研究主要集中在栽培管理技術(shù)[3-6]、種質(zhì)資源評(píng)價(jià)[7-8]和飼料利用[9-10]等方面，而在分子生物學(xué)層面對(duì)光葉紫花苕遺傳多樣性的研究甚少。

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的主要方式之一，能對(duì)生物體內(nèi)或外界環(huán)境的刺激作出響應(yīng)，在不改變DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)前提下參與基因的表達(dá)調(diào)控，從而影響生物體的表型可塑性和環(huán)境適應(yīng)性[11]，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用。施江等[12]研究表明，遮蔭顯著誘導(dǎo)半夏基因組甲基化水平的提升；SHELDON等[13]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥在開(kāi)花過(guò)程中由于DNA甲基化水平的降低，導(dǎo)致開(kāi)花基因表達(dá)下調(diào)而延遲開(kāi)花；陳家慧等[14]對(duì)不同甘蔗品種DNA甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化在甘蔗生長(zhǎng)過(guò)程中(伸長(zhǎng)期和成熟期)頻繁發(fā)生，并且不同品種之間甲基化模式也存在差異。筆者等利用甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(Methylation Sensitive Amplification Polymorphism，MSAP)技術(shù)，對(duì)貴州境內(nèi)海拔差異較大的2個(gè)地區(qū)光葉紫花苕種子進(jìn)行基因組甲基化多態(tài)性檢測(cè)，旨在研究不同海拔高度對(duì)其DNA甲基化水平的影響，為光葉紫花苕在環(huán)境適應(yīng)性方面的表觀遺傳機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試的光葉紫花苕種子2020年5月18日分別采集于貴州省大方縣和興義市市。大方縣海拔1 256 m,E105°42′54″,N27°3′21″;興義市海拔1 523 m,E104°47′36″,N25°7′29″。

1.2 基因組DNA提取與MSAP分析

采用改良CTAB法[15]對(duì)光葉紫花苕種子進(jìn)行基因組DNA提取，MSAP分析參照王子苑等[16]的方法實(shí)施。試驗(yàn)所用接頭和引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 接頭和引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳位置在凝膠的某個(gè)相同遷移率位置上有DNA條帶記為1，無(wú)DNA條帶記為0，獲得01矩陣，最終得到24對(duì)引物的01數(shù)據(jù)并進(jìn)行甲基化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的基因組DNA(圖1)主帶清晰，基本沒(méi)有降解，可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 預(yù)擴(kuò)增電泳檢測(cè)

所提取DNA通過(guò)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表明(圖2)，預(yù)擴(kuò)產(chǎn)物符合MSAP選擴(kuò)模板要求。

2.3 不同海拔地區(qū)光葉紫花苕甲基化分析

根據(jù)2種同裂酶HpaⅡ (H)和MspⅠ(M)識(shí)別CCGG序列上甲基化胞嘧啶的敏感性不同，將其與內(nèi)切酶EcoRⅠ(E)組合對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，酶切后的MSAP帶型分為4類。 Ⅱ 類是非甲基化位點(diǎn)，E+H和E+M都有帶，說(shuō)明CCGG位點(diǎn)未發(fā)生甲基化； Ⅱ 類是半甲基化位點(diǎn)，E+H有帶，E+M無(wú)帶，說(shuō)明位點(diǎn)發(fā)生單鏈DNA外甲基化； Ⅲ類是全甲基化位點(diǎn)，E+H無(wú)帶，E+M有帶，說(shuō)明位點(diǎn)發(fā)生雙鏈DNA內(nèi)甲基化； Ⅳ類是超甲基化位點(diǎn)，E+H和E+M無(wú)帶，不計(jì)入甲基化范圍。

利用隨機(jī)的24對(duì)選擇性擴(kuò)增引物對(duì)酶切后的光葉紫花苕樣本進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增產(chǎn)生1 832個(gè)位點(diǎn)，部分MSAP擴(kuò)增圖譜見(jiàn)圖3。根據(jù)光葉紫花苕MSAP條帶類型分析結(jié)果(表2)，在所有擴(kuò)增位點(diǎn)中檢測(cè)出總甲基化位點(diǎn)大方為1 304個(gè)，興義為1 240個(gè)，總甲基化率分別為84.90%和80.73%。其中全甲基化條帶數(shù)分別為403條和393條，全甲基化率分別為67.32%和65.23%。半甲基化條帶數(shù)分別為270條和238條，半甲基化率為17.58%和15.49%。表明，大方地區(qū)光葉紫花苕DNA甲基化水平較高，且不同類型的條帶總數(shù)為Ⅳ> Ⅲ> Ⅱ >Ⅰ，說(shuō)明不同海拔地區(qū)的甲基化均以內(nèi)側(cè)胞嘧啶雙鏈甲基化為主。

2.4 不同海拔地區(qū)光葉紫花苕甲基化模式變化

按照引物在酶切擴(kuò)增泳道上是否擴(kuò)增出條帶，將甲基化模式分為A、B、C、D 4大類，即，有擴(kuò)增帶計(jì)為“1”，無(wú)擴(kuò)增帶計(jì)為“0”。如表3所示，A類包含3個(gè)亞類，為甲基化位點(diǎn)無(wú)變化。興義與大方光葉紫花苕相比，未發(fā)生甲基化變化的位點(diǎn)占總甲基化擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)的9.90%；B類包含5個(gè)亞類，表現(xiàn)為甲基化程度降低，即去甲基化，興義與大方相比有42.58%的位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化；C類包含5個(gè)亞類，表現(xiàn)為甲基化程度升高，興義與大方相比，44.73%的位點(diǎn)發(fā)生了甲基化；此外，還有一種較為復(fù)雜的“未知模式”將其歸為D類，變化率不超過(guò)總甲基化擴(kuò)增位點(diǎn)的3%。說(shuō)明，與興義地區(qū)的光葉紫花苕相比，大方地區(qū)去甲基化模式和甲基化模式并存，但以甲基化模式變化為主。

表2 不同海拔地區(qū)光葉紫花苕MSAP條帶類型

表3 不同海拔地區(qū)光葉紫花苕DNA甲基化模式

3 結(jié)論與討論

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳機(jī)制，不僅提供了基因表達(dá)的開(kāi)關(guān)，而且一旦形成穩(wěn)定的表型可以延續(xù)若干個(gè)世代[17-18]，BOYKO等[19]認(rèn)為這種表觀遺傳改變可能引起脅迫誘導(dǎo)的基因進(jìn)化。在眾多甲基化類型中，5-甲基胞嘧啶是真核生物體中最重要的一種甲基化存在形式，通過(guò)將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，轉(zhuǎn)移到脫氧胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶[20]。簡(jiǎn)單地說(shuō)，DNA甲基化是一種在DNA序列的胞嘧啶核苷酸的特定位置上共價(jià)加減甲基基團(tuán)的一種基因修飾方式[21]。根據(jù)檢測(cè)目的不同，DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)可分為基因組整體甲基化水平檢測(cè)和特定位點(diǎn)甲基化檢測(cè)，前者的典型檢測(cè)方法有高效液相色譜(HPLC)、毛細(xì)管電泳(CE)等[22]，研究表明，采用的MSAP技術(shù)能特定識(shí)別CCGG位點(diǎn)，具有操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在植物DNA甲基化檢測(cè)中較為廣泛地應(yīng)用。

環(huán)境溫度的改變是影響植株生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，藜麥葉片的葉綠素、可溶性蛋白以及抗壞血酸過(guò)氧化酶(APX)含量隨海拔的升高而降低，而超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)等抗氧化酶活性與海拔高度負(fù)相關(guān)，說(shuō)明高海拔條件下太陽(yáng)輻射強(qiáng)度增大，溫度降低，藜麥植株為了能正常生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)高海拔脅迫作出了相應(yīng)的生理響應(yīng)[23]。STEWARD等[24]研究玉米幼苗在冷應(yīng)激(4℃)條件下的甲基化變化發(fā)現(xiàn)，其根部組織的基因組發(fā)生了低甲基化，并且只有在冷應(yīng)激條件下轉(zhuǎn)錄的ZmMI1基因也發(fā)生了去甲基化，即便是經(jīng)過(guò)7 d恢復(fù)，低甲基化水平也沒(méi)有恢復(fù)到正常水平。王芳等[25]研究表明，超低溫保存導(dǎo)致馬鈴薯基因組DNA發(fā)生了甲基化現(xiàn)象，其中以去甲基化變化為主。通常來(lái)說(shuō)，DNA發(fā)生甲基化與基因的沉默有關(guān)，而DNA發(fā)生去甲基化會(huì)開(kāi)啟基因表達(dá)。本研究采集來(lái)自不同海拔高度的光葉紫花苕樣本，對(duì)甲基化分析后發(fā)現(xiàn)，海拔較低的大方地區(qū)總甲基化率和半甲基化率分別低于高海拔興義地區(qū)4.17%和2.09%，說(shuō)明低海拔地區(qū)DNA發(fā)生去甲基化現(xiàn)象高，與前人研究結(jié)果類似[26-27]，這種變化趨勢(shì)可能是植物通過(guò)改變甲基化水平和模式來(lái)調(diào)控環(huán)境應(yīng)答基因網(wǎng)絡(luò)，并且這種甲基化的改變能延續(xù)給后代，從而增強(qiáng)當(dāng)代或者后代的環(huán)境適應(yīng)性。