李曉花，童 俊，王凱紅，李丹丹，單 文，王兆紅，張樂(lè)華*

(1.江西省中國(guó)科學(xué)院廬山植物園，江西 廬山 332900； 2.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 武漢 430065)

在自然條件下，杜鵑花屬(Rhododendron)植物存在從同種不同基因型之間到同亞屬中不同亞組之間的雜交現(xiàn)象[1-2].雜交育種是目前國(guó)內(nèi)外杜鵑花育種中應(yīng)用最廣泛、成效最顯著的育種方法.張長(zhǎng)芹等[3]開(kāi)展了59種杜鵑花屬植物雜交育種研究，發(fā)現(xiàn)常綠杜鵑組的大白杜鵑(R.decorum)×桃葉杜鵑(R.annae)、馬纓杜鵑(R.delavayi)×大白杜鵑、桃葉杜鵑×馬纓杜鵑的坐果率均在60%以上；并發(fā)現(xiàn)同亞屬間雜交親和力強(qiáng)，不同亞屬間雜交不育.耿興敏等[4-5]研究發(fā)現(xiàn)同亞屬的杜鵑雜交親和性較強(qiáng)，不同亞屬間雜交存在生殖障礙、親和性弱，而延遲授粉、3%食鹽水或花粉培養(yǎng)液涂抹柱頭、加熱花粉等方法能有效克服亞屬間遠(yuǎn)緣雜交授粉障礙，提高結(jié)實(shí)率和蒴果種子數(shù)及千粒重.莊平[6]研究了杜鵑花屬植物種間雜交的向性，發(fā)現(xiàn)相同物種的正反交其結(jié)實(shí)率存在明顯差異[7].國(guó)外大量的研究表明，杜鵑花屬植物類(lèi)群(亞屬、組及亞組)的種間雜交有3種育性表現(xiàn)，雙向可育，如映山紅亞屬(Subgen.Tsutsusi)×杜鵑亞屬(Subgen.Rhodoendron)；單向不育，如映山紅亞屬×常綠杜鵑亞屬(Subgen.Hymenanthes)；雙向不育，如羊躑躅亞屬(Subgen.Pentanthera)×映山紅亞屬[8-10].莊平在常綠杜鵑亞屬內(nèi)、杜鵑亞屬內(nèi)及不同亞屬間的種間雜交中也發(fā)現(xiàn)不同程度的單向不育現(xiàn)象[2，6，11-12]；Ma等[13]研究證實(shí)，常綠杜鵑組的蜜腺杜鵑亞組(subsect.Thomsonia)的藍(lán)果杜鵑(R.cyanocarpum)與同組不同亞組的馬纓杜鵑存在自然雜交現(xiàn)象，并能進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)的雙向交配；Hirao[14]采用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與遠(yuǎn)距離的植株間人工授粉相比，近距離授粉會(huì)導(dǎo)致R.brachycarpum有效基因流減少、后代繁殖力(種子發(fā)芽率、幼苗成活率)及適應(yīng)性下降.

現(xiàn)有的資料顯示，有關(guān)杜鵑花可育性的研究主要見(jiàn)于歐、美、日、澳等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，而國(guó)內(nèi)杜鵑雜交育種起步晚，工作十分有限[4，15-16]，特別是缺乏對(duì)雜交種子的萌發(fā)與幼苗生長(zhǎng)狀況的跟蹤研究.為探索常綠杜鵑組亞組間雜交可育性及其規(guī)律，本文以5種常綠杜鵑組(Sect.ponticum)杜鵑為材料，通過(guò)人工雜交授粉實(shí)驗(yàn)研究了其種間雜交的親和性，并以坐果率、萌發(fā)率、綠苗率為指標(biāo)對(duì)其可育性進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)，以期為我國(guó)杜鵑花雜交育種提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

以廬山植物園引種栽培的常綠杜鵑組(Sect.Ponticum)杜鵑為材料，共計(jì)4亞組、5種，分別是云錦杜鵑亞組(Subsect.Fortunea)的井岡山杜鵑(R.jinggangshanicum)、喇叭杜鵑(R.discolor)，耳葉杜鵑亞組(Subsect.Auriculata)的耳葉杜鵑(R.auriculatum)，銀葉杜鵑亞組(Subsect.Argyrophylla)的皺葉杜鵑(R.denudatum)及樹(shù)形杜鵑亞組(Subsect.Arborea)的馬纓杜鵑.

1.2 方法

1.2.1 雜交組合設(shè)計(jì) 采用亞組間的正反交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共6個(gè)雜交組合(見(jiàn)表1).

表1 6個(gè)杜鵑雜交組合授粉實(shí)驗(yàn)的結(jié)果Tab.1 Results of pollination experiments on 6 cross combinations of Rhododendron

1.2.2 試驗(yàn)方法 人工授粉試驗(yàn)于2018年4月～7月在廬山植物園杜鵑園中進(jìn)行.花蕾開(kāi)放前2 d小心去除雄蕊、套袋，待柱頭充滿黏液后授粉；在雜交前1 d，采集相應(yīng)雜交組合即將開(kāi)放的父本花蕾放入常溫玻璃瓶?jī)?nèi)，在晴天早上8∶00～12∶00取父本花粉進(jìn)行人工授粉、套袋并掛牌.各雜交組合授粉數(shù)量不少于27朵，10 d后去除套袋使蒴果自然發(fā)育，10月底至11月授粉蒴果由棕黃色變褐色且蒴果頂部稍稍開(kāi)裂時(shí)采收蒴果.

1.2.3 種子千粒重稱(chēng)量 將采收的雜交蒴果和母本自然授粉蒴果置于室內(nèi)自然晾干，待蒴果自然開(kāi)裂后取出種子.每個(gè)組合5份、每份200粒，用分析天平(Sartorius BSA224S-CW)稱(chēng)量，求平均值換算成千粒重.

1.2.4 種子萌發(fā)率、綠苗率統(tǒng)計(jì) 播種繁殖試驗(yàn)于2019年4月30日在杜鵑花繁殖溫室內(nèi)進(jìn)行.泥瓦盆播種；播種基質(zhì)為經(jīng)福爾馬林消毒后的腐殖土+珍珠巖+蛭石(3∶1∶1，V/V/V)混合基質(zhì)；基質(zhì)上盆后在表層鋪設(shè)一層薄薄的洗凈、剪碎的活體苔蘚，輕壓使苔蘚與混合基質(zhì)粘合；再將種子均勻撒播在苔蘚上，噴水使基質(zhì)完全浸透，最后用透明的塑料薄膜覆蓋保濕.35 d后子葉展開(kāi)，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù)；65 d時(shí)統(tǒng)計(jì)幼苗的綠苗數(shù).每個(gè)組合重復(fù)5次，取平均值.

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 2018年10月～11月，蒴果成熟期統(tǒng)計(jì)坐果率(Capsul set，簡(jiǎn)稱(chēng)St) (%)=(坐果數(shù)/授粉花朵數(shù))×100%；2019年6月上旬，統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)率(Germination rate，簡(jiǎn)稱(chēng)Gr) (%)=(5次重復(fù)萌發(fā)數(shù)之和/1000或?qū)嶋H播種種子數(shù)量之和)×100%；2019年7月上旬，統(tǒng)計(jì)綠苗率(Green seeding rate，簡(jiǎn)稱(chēng)Gs) (%)=(5次重復(fù)綠苗數(shù)之和/5次重復(fù)萌發(fā)幼苗數(shù)之和)×100%[17-18].采用SPSS 17軟件對(duì)所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素比較(Duncan檢驗(yàn))，設(shè)P=0.05.

1.2.6 指標(biāo)體系與等級(jí)劃分 參照莊平的方法[18]進(jìn)行各指標(biāo)等級(jí)劃分并進(jìn)行改進(jìn)(表2).1) 坐果率(St)為植物育性適應(yīng)或適合度的常用指標(biāo)，劃分為3個(gè)等級(jí)：0≤低<20、20≤中<60、高≥60；2) 萌發(fā)率(Gr)為種子生活力常用指標(biāo)，常結(jié)合綠苗率用以分析可育性，劃分為3個(gè)等級(jí)：0≤低<15、15≤中<50、高≥50；3) 綠苗率(Gs)也為種子生活力常用指標(biāo)，常結(jié)合發(fā)芽率、黃化率用以分析可育性，劃分為3個(gè)等級(jí)：0≤低<10、10≤中<60、高≥60.考慮到單一指標(biāo)的不完整性和片面性以及不同指標(biāo)的重要性差異，賦予上述指標(biāo)的權(quán)重和等級(jí)分值，累加后求出可育性值，對(duì)各雜交組合的可育性進(jìn)行綜合評(píng)價(jià).設(shè)總權(quán)重(最高分值)為10分，綠苗率是主要可育性指標(biāo)，給定其最高權(quán)重5分；其次為種子萌發(fā)率，給定最高權(quán)重3分；坐果率給定最高權(quán)重2分.各指標(biāo)等級(jí)和權(quán)重分值分配方案見(jiàn)表1.單項(xiàng)得分之和為各雜交組合的總分值，依據(jù)總分值將可育性劃分為4個(gè)等級(jí)，即0≤不育<4、4≤低<6、6≤中<8、高≥8，對(duì)應(yīng)類(lèi)型分別為不育型、弱育型、可育型和高育型.

表2 杜鵑花雜交育種可育性指標(biāo)等級(jí)與權(quán)重分配Tab.2 Fertile index grade and their weight allocation of cross breeding of Rhododendron

2 結(jié)果與分析

2.1 各雜交組合坐果率比較

2.2 母本和各雜交組合種子千粒重比較

由表1可見(jiàn)，5種杜鵑親本自然授粉結(jié)實(shí)種子的千粒重由重至輕依次為井岡山杜鵑、耳葉杜鵑、皺葉杜鵑、馬纓杜鵑和喇叭杜鵑，分別為362、291、234、158、120 mg.方差分析表明，除井岡山杜鵑種子千粒重顯著大于其他杜鵑外，其他4種杜鵑間無(wú)顯著差異.

2.3 母本和各雜交組合萌發(fā)率及綠苗率比較

2.3.1 萌發(fā)率比較 5種杜鵑親本自然結(jié)實(shí)種子的萌發(fā)率由高至低依次為井岡山杜鵑、耳葉杜鵑、皺葉杜鵑、馬纓杜鵑和喇叭杜鵑，分別為59.30%、48.20%、18.70%、8.80%和6.50%(見(jiàn)表2).方差分析表明，井岡山杜鵑與耳葉杜鵑種子萌發(fā)率無(wú)顯著差異，但兩者顯著高于其他3個(gè)物種；皺葉杜鵑種子萌發(fā)率居中；馬纓杜鵑和喇叭杜鵑種子萌發(fā)率無(wú)顯著差異但顯著低于其他3個(gè)物種.

2.3.2 綠苗率比較 綠苗率是種間雜交可育性的重要指標(biāo)，種子活力越強(qiáng)、綠苗率越高.5種杜鵑親本自然結(jié)實(shí)種子苗的綠苗率由高至低依次為的皺葉杜鵑、喇叭杜鵑、馬纓杜鵑、耳葉杜鵑和井岡山杜鵑，分別為100%、92.36%、90.91%、84.02%和58.52%(表1).方差分析表明，皺葉杜鵑綠苗率顯著高于其他4種杜鵑，而喇叭杜鵑、馬纓杜鵑、耳葉杜鵑之間差異不顯著，但三者顯著高于井岡山杜鵑.

圖1 6個(gè)杜鵑雜交組合坐果率、萌發(fā)率與綠苗率Fig.1 Capsul set，germination rate and green seedling rate on 6 cross combinations of Rhododendron

2.4 各雜交組合可育性綜合評(píng)價(jià)

圖2 6個(gè)杜鵑雜交組合可育性綜合評(píng)價(jià)Fig.2 Fertility assessment on 6 cross combinations of Rhododendron

3 討論與結(jié)論

杜鵑花屬植物自交親和(self compatibility，SC)與自交不親和(self incompatibility，SI)現(xiàn)象并存，不同分類(lèi)類(lèi)群間的人工雜交親和性或可育性與雙親的系統(tǒng)發(fā)育及染色體倍性密切相關(guān)，總體趨勢(shì)是親緣關(guān)系越近、親和性越強(qiáng)，自交親和的親本種間雜交可育性大于自交不親和親本[1，6，19]；而不同亞屬間的種間雜交存在明顯的生殖障礙——不育[3]或育性較弱[12，19-21]；常綠杜鵑組種間自然雜交現(xiàn)象普遍，也有跨亞組間的自然雜交現(xiàn)象[13，19]，其組內(nèi)異種雜交可育性較強(qiáng)且大多雙向可育[1-2].

3.1 各雜交組合的坐果率

3.2 母本和各雜交組合種子千粒重

3.3 母本和各雜交組合種子萌發(fā)率與綠苗率

3.4 各雜交組合育性綜合評(píng)價(jià)

育性是植物雜交育種成敗的關(guān)鍵.本研究中，6個(gè)雜交組合坐果率為57.14%～88.89%、種子萌發(fā)率為12.60%～65.00%、綠苗率為65.07%～90.45%，綜合評(píng)價(jià)得分最達(dá)8～10分，均為高育型類(lèi)型，表明常綠杜鵑組亞組間雜交是可行的，以前人研究結(jié)果一致[1-2].

綜上所述，本研究中雖然不同雜交組合間坐果率、種子千粒重、萌發(fā)率和綠苗率存在一定差異，且親本間有正反交不對(duì)稱(chēng)現(xiàn)象，并存在種子千粒重、綠苗率下降等問(wèn)題，但所有雜交組合均達(dá)到高育型水平，說(shuō)明常綠杜鵑組亞屬間雜交育種是完全可行的.今后工作中應(yīng)以自然授粉結(jié)實(shí)率高、可育性強(qiáng)的杜鵑為母本，進(jìn)一步拓展雜交種源，并借助于倍性育種、胚胎拯救、體細(xì)胞融合、基因工程等現(xiàn)代育種技術(shù)，改良杜鵑花性狀、培育新種質(zhì)，為我國(guó)杜鵑花資源發(fā)掘與利用提供支撐.