鮑瑤菲，薛茜茹，武海萍，鄒秉杰，宋沁馨*，周國(guó)華，3

（1中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009；2東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，南京210002；3南方醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣州510515）

自新型冠狀病毒首次出現(xiàn)以來(lái)，在全世界范圍內(nèi)快速傳播，現(xiàn)已至全球大流行，截至2020 年9月30 日全球感染人數(shù)已達(dá)3 300 萬(wàn)人，造成100 多萬(wàn)人死亡，且確診人數(shù)和死亡人數(shù)還在持續(xù)增加，給全球經(jīng)濟(jì)和公眾健康都造成了嚴(yán)重的威脅。國(guó)際病毒分類委員會(huì)將這種新的冠狀病毒正式命名為SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），SARS-CoV-2 是一種單鏈正股RNA病毒，目前用于檢測(cè)SARS-CoV-2 的基因靶標(biāo)有核衣殼（N）、包膜（E）、刺突（S）、RNA 依賴性RNA 聚合酶（RdRP）和開放閱讀框架1ab（ORF1ab）基因等［1］。

基于核酸的檢測(cè)方法具有高靈敏度和低假陰性率的優(yōu)勢(shì)，相對(duì)其他檢測(cè)方法（如抗體檢測(cè)）更靈敏、特異性更好，目前各國(guó)檢測(cè)新冠病毒最普遍方法為對(duì)口咽或鼻咽拭子進(jìn)行基于實(shí)驗(yàn)室的病毒RNA 的逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-PCR，RT-PCR），這已成為用于確診新冠感染的金標(biāo)準(zhǔn)，被中國(guó)國(guó)家衛(wèi)建委、WHO等作為新冠確診的重要依據(jù)。但這種方式普遍檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（約1.5～2 h），需要昂貴的大型儀器、專門的試劑、專業(yè)的操作人員以及在完備的符合生物安全條件的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室中才能進(jìn)行，并不適合及時(shí)檢測(cè)，這就導(dǎo)致無(wú)法在第一時(shí)間對(duì)疑似病例進(jìn)行及時(shí)快速的檢測(cè)，遲滯疫情防控工作的進(jìn)行，對(duì)公共安全造成潛在影響。因此急需能夠在資源有限的情況下實(shí)現(xiàn)快速便捷檢測(cè)新冠病毒的方法以及時(shí)控制疫情，即時(shí)檢測(cè)（point-of-care testing，POCT）［2］又稱床旁檢測(cè)就成為了對(duì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流程很好的補(bǔ)充，它是指在采樣現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑快速得到結(jié)果的一種檢測(cè)方式。即時(shí)檢測(cè)不僅適用于臨床實(shí)驗(yàn)室，還可以由受過(guò)簡(jiǎn)單訓(xùn)練的非實(shí)驗(yàn)室人員在樣品采集現(xiàn)場(chǎng)（例如床旁，醫(yī)生辦公室或急診室）中進(jìn)行。此外，即時(shí)檢測(cè)只需要很少的操作步驟，通常無(wú)需培訓(xùn)或只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單培訓(xùn)即可熟練掌握，結(jié)果易于讀取，具有準(zhǔn)確、快速、便攜、簡(jiǎn)便和低成本的優(yōu)勢(shì)，有利于更快的臨床決策并從專業(yè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室分擔(dān)工作負(fù)荷，加快篩查速度、控制疫情。

本文主要從提取、核酸擴(kuò)增、檢測(cè)和商業(yè)一體化即時(shí)檢測(cè)方法4 個(gè)方面總結(jié)了目前已有的針對(duì)新冠病毒開發(fā)的即時(shí)檢測(cè)方法及其原理，以期為檢測(cè)能力不足及資源匱乏地區(qū)新冠核酸即時(shí)篩查提供參考，合理利用即時(shí)檢測(cè)可以分擔(dān)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室的負(fù)擔(dān)，提高各國(guó)對(duì)疫情快速篩查、及時(shí)防控的能力。

1 樣本提取

新冠檢測(cè)可用的樣本類型包括肺泡灌洗液、鼻拭子、咽拭子、痰液樣本等，其中最常用為鼻咽拭子，但鼻咽拭子的采集需要專業(yè)醫(yī)護(hù)人員按照標(biāo)準(zhǔn)的操作規(guī)范操作，采集過(guò)程中受試者會(huì)有不適感且對(duì)于醫(yī)護(hù)人員來(lái)說(shuō)有暴露風(fēng)險(xiǎn)。因此選擇一種采集更便捷的樣本類型將更適合即時(shí)檢測(cè)。早先已有研究發(fā)現(xiàn)在唾液中可以檢出新冠病毒［3］，唾液樣品收集快速、無(wú)創(chuàng)，價(jià)格低廉并且易于存儲(chǔ)，還可以避免收集鼻咽拭子樣本的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)患者和醫(yī)療保健提供者而言更加安全，并且唾液樣本采集方便不需要熟練的技術(shù)人員，適合非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境甚至居家檢測(cè)。Lamb 等［4］設(shè)計(jì)針對(duì)開放閱讀框ORF1ab 的NSP3 編碼區(qū)的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP），在30～45 min 內(nèi)完成模擬患者唾液樣品中特異性檢測(cè)SARS-CoV-2，與RT-PCR 陽(yáng)性一致率為95%（N = 19/20）。SalivaDirect 方法［5］也采用唾液作為檢測(cè)樣本，將核酸提取步驟替換成簡(jiǎn)單的蛋白酶K 和熱處理步驟，與基于鼻咽拭子純化提取的常規(guī)RT-PCR 方法相比相關(guān)性達(dá)94%，且該檢測(cè)流程能與多種RT-PCR 試劑盒兼容，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間。

此外，RUCDR Infinite Biologics 開發(fā)的新唾液收集方法將比目前的鼻咽拭子方法更適合進(jìn)行廣泛的人群篩查，提供了一種方便的樣品收集方法來(lái)開發(fā)價(jià)格適宜的即時(shí)護(hù)理測(cè)試套件，F(xiàn)DA 已為該方法授予了緊急使用授權(quán)（EUA）［6］。唾液作為一種樣本收集方法，對(duì)COVID-19患者SARS-CoV-2的檢測(cè)具有良好的準(zhǔn)確性，有替代鼻咽拭子用作SARS-CoV-2 的即時(shí)檢測(cè)樣本的潛力［3］，但唾液中病毒載量在癥狀出現(xiàn)的第1周最高，隨后會(huì)隨時(shí)間下降［7］，與鼻咽拭子相比靈敏度有所下降。

目前手動(dòng)RNA 提取限制了新冠即時(shí)檢測(cè)的開發(fā)和應(yīng)用，常規(guī)的RNA 提取意味著更長(zhǎng)的周轉(zhuǎn)時(shí)間，更多的人力、試劑的成本，以及處理臨床標(biāo)本時(shí)交叉污染和生物安全的風(fēng)險(xiǎn)。為了優(yōu)化提取步驟，Zhao等［8］利用基于帶有羧基涂層的聚氨基酯磁性納米顆粒（pcMNPs）在20 min內(nèi)從多個(gè)樣品中進(jìn)行病毒RNA 提取，該方法將裂解和結(jié)合合并為一個(gè)步驟，并且pcMNPs-RNA 復(fù)合物可以直接引入后續(xù)的RT-PCR反應(yīng)中。

除了新的提取方法外，免提取方法的開發(fā)也是一種解決思路。Wee 等［9］提出了一種稱為直接快速免提取PCR（DIRECT-PCR）的方法，使用抗抑制劑的酶和試劑來(lái)免除RNA 提取步驟，可在36 min 內(nèi)在市售便攜式PCR 熱循環(huán)儀上完成快速直接PCR 檢測(cè)，針對(duì)呼吸道樣品中的病毒核衣殼（N）基因每個(gè)反應(yīng)最低可檢測(cè)到6 個(gè)拷貝，減少了實(shí)驗(yàn)室人員的操作時(shí)間和生物安全風(fēng)險(xiǎn)且具有便攜性，可在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室之外進(jìn)行。在基于等溫?cái)U(kuò)增原理開發(fā)的方法中發(fā)現(xiàn)，病毒運(yùn)輸介質(zhì)可能包含一種或多種抑制劑，將鼻咽拭子直接置于病毒運(yùn)輸介質(zhì)中不進(jìn)行RNA 分離步驟直接進(jìn)行RT-LAMP，會(huì)使RT-LAMP 的有效性降低［4］。Wei等［10］開發(fā)了一種直接在鼻咽拭子后的病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)上檢測(cè)的方法，無(wú)需事先提取RNA，敏感性為85%，可以兼容不同制造商的試劑探針。雖然病毒轉(zhuǎn)運(yùn)介質(zhì)仍會(huì)使檢測(cè)靈敏度有所降低，但可以簡(jiǎn)化工作流程，縮短周轉(zhuǎn)時(shí)間，更適合即時(shí)檢測(cè)。此外，超高靈敏度的檢測(cè)方法也可無(wú)需進(jìn)行額外的樣品處理或RNA純化［11］。

2 核酸擴(kuò)增

2.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

RT-PCR 是目前檢測(cè)新冠病毒核酸最普遍的方法，利用該原理開發(fā)的試劑盒數(shù)量占比也是最多的。RT-PCR 的原理為利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA 轉(zhuǎn)換為與其互補(bǔ)的cDNA，隨后cDNA 的特定區(qū)域經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）進(jìn)行擴(kuò)增，在體系中添加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)從而擴(kuò)增在過(guò)程中或終點(diǎn)處讀取熒光信號(hào)以實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。

基于實(shí)驗(yàn)室的RT-PCR 應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)的主要障礙包括：實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀通常體積較大、操作復(fù)雜需要專業(yè)人員、周轉(zhuǎn)時(shí)間長(zhǎng)等。這些在即時(shí)檢測(cè)上的局限性促使研究人員探索在保持常規(guī)RT-PCR 的靈敏度和特異性的同時(shí)簡(jiǎn)化和縮短流程的方法。在RT-PCR 的樣品擴(kuò)增階段，需要熱循環(huán)儀來(lái)實(shí)現(xiàn)溫度的程序變化，但熱循環(huán)儀成本較高，在資源缺乏地區(qū)難以大量配備。Arumugam等［12］開發(fā)了一種水浴加熱儀器替代PCR 循環(huán)儀，包含兩個(gè)水?。阂粋€(gè)用于變性，另一個(gè)用于逆轉(zhuǎn)錄，然后使用電機(jī)操作臂將PCR 管穿梭在兩個(gè)水浴之間進(jìn)行退火延伸步驟，這臺(tái)設(shè)備造價(jià)便宜，可實(shí)現(xiàn)96 個(gè)樣本同時(shí)處理，若使用薄膜PCR 反應(yīng)管可在12 min 內(nèi)完成反應(yīng)，與臺(tái)式PCR 儀相比速度明顯提升，適合在欠發(fā)達(dá)地區(qū)應(yīng)用。

2.2 等溫?cái)U(kuò)增

核酸等溫?cái)U(kuò)增無(wú)需進(jìn)行熱循環(huán)步驟，可以在恒定溫度下快速進(jìn)行核酸擴(kuò)增，是RT-PCR 最有潛力的替代方法，能實(shí)現(xiàn)與RT-PCR 相似水平的病毒RNA 檢測(cè)且更加適合應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)。目前用于即時(shí)檢測(cè)的常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)有環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）和Nicking酶輔助反應(yīng)（NEAR）技術(shù)。

2.2.1 逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP） RTLAMP 原理見圖1，首先將SARS-CoV-2 的RNA 基因組逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再設(shè)計(jì)4 個(gè)能與靶基因組上6 個(gè)不同區(qū)域結(jié)合的特殊設(shè)計(jì)的引物，使用具有鏈置換活性的DNA 聚合酶替代熱變性生成單鏈模板，在四引物系統(tǒng)中，有兩個(gè)內(nèi)部引物和兩個(gè)外部引物。正向內(nèi)部引物的3′末端引發(fā)了初始DNA鏈的合成，隨后被正向外部引物引發(fā)的合成所取代。正向內(nèi)部引物的5′末端的反向互補(bǔ)序列與置換的ssDNA 鏈中的下游序列退火，形成一個(gè)環(huán)。然后在每個(gè)末端環(huán)上的ssDNA 充當(dāng)LAMP 擴(kuò)增循環(huán)的起始，使目標(biāo)序列被指數(shù)擴(kuò)增。LAMP 具有很高的特異性和敏感性，操作簡(jiǎn)單，在60～65 ℃的恒溫下不到1 h 即可完成，避免了使用熱循環(huán)儀的麻煩，并且由于使用了更多的引物因此具有很高的特異性?？梢酝ㄟ^(guò)添加pH 敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等進(jìn)行可視化檢測(cè)。

圖1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）原理示意圖

Yu等［13］開發(fā)了名為iLACO的資源缺乏地區(qū)即時(shí)檢測(cè)方案，以O(shè)RF1ab 的片段作為靶標(biāo)，在65 ℃的水浴中溫育，每毫升1 000 個(gè)拷貝的濃度可以在20 min的反應(yīng)時(shí)間內(nèi)得出結(jié)果，但還不足以進(jìn)行低病毒載量樣本的靈敏篩查。為了實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度和特異性，Yang等［14］對(duì)不同靶標(biāo)進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)ORF1ab 基因具有很高的特異性但靈敏度低，而N基因具有很高的靈敏度但特異性不足，同時(shí)檢測(cè)ORF1ab 基因，E 基因和N 基因可以保證對(duì)SARSCoV-2 的敏感性和特異性。為了提高擴(kuò)增效率和耐受性，Lu 等［15］開發(fā)了基于SARS-CoV-2 的N 基因的利用高保真DNA 聚合酶的單步單管耐錯(cuò)配擴(kuò)增技術(shù)，可除去擴(kuò)增過(guò)程中引物3′端的錯(cuò)配堿基，具有極好的耐受性，檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)118.6 個(gè)拷貝。該分析的檢測(cè)速度比一般LAMP反應(yīng)更快，可在不到20 min 得到結(jié)果。作為一種常見的反應(yīng)平臺(tái)，微流控芯片具備將所有試劑存儲(chǔ)在芯片上的能力，能夠整合并簡(jiǎn)化操作步驟，對(duì)于消除對(duì)大型設(shè)備的需求至關(guān)重要，將微流體設(shè)備與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合使用可以為大眾提供更方便、便宜、便攜的新冠檢測(cè)方法［16-17］。以上這些LAMP 方法用于即時(shí)檢測(cè)均需要熱板或水浴，Gonzalez 等［18］報(bào)告了一種3D 打印孵育室的開發(fā)，將靶向N 基因的比色RT-LAMP 反應(yīng)與用于市售Eppendorf PCR 管的3D打印孵育室相結(jié)合，可以允許十二管反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行，3D 打印孵育室可以大規(guī)模生產(chǎn)，為基于LAMP的即時(shí)檢測(cè)提供了一種高成本效益的反應(yīng)平臺(tái)。

LAMP 方法靈敏度高、特異性好，具有恒溫反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)，無(wú)需使用熱循環(huán)儀進(jìn)行溫度程序設(shè)置，更加有利于即時(shí)檢測(cè)方法的開發(fā)。然而，由于LAMP 需在60～65 ℃下進(jìn)行擴(kuò)增，仍然需要水浴、熱板等外部設(shè)備提供恒定的溫度，不利于設(shè)備小型化便攜化，因此在常溫下進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增的方法在即時(shí)擴(kuò)增領(lǐng)域更有前景。

2.2.2 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA） RPA也是一種核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，相比于LAMP反應(yīng)溫度更低，在常溫下就可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)，無(wú)需外部加熱部件。RPA的原理見圖2，主要依賴于3種酶：能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA 聚合酶。重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA 復(fù)合物靶向模板DNA 中的同源序列，通過(guò)鏈置換DNA 聚合酶發(fā)生鏈置換反應(yīng)并啟動(dòng)DNA合成，對(duì)模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA 單鏈與SSB 結(jié)合防止進(jìn)一步替換以穩(wěn)定開放的雙鏈體結(jié)構(gòu)。結(jié)果可以通過(guò)與exo 探針結(jié)合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量、也可以與nfo 探針結(jié)合使用側(cè)流試紙條檢測(cè)或加入染料肉眼可視化檢測(cè)讀取，更適合應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)。

圖2 逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）原理示意圖

Behrmann 等［19］開 發(fā)了 應(yīng)用exo 探 針的 單管RT-RPA 方法，與RT-qPCR 相比具有100%的診斷敏感性和特異性，檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)7.74個(gè)拷貝，對(duì)于高RNA 濃度樣本，可在7 min 內(nèi)獲得結(jié)果，該測(cè)定方法是迄今為止SARS-CoV-2 最快的基于核酸的檢測(cè)方法之一。Xia 等［11］提出同時(shí)靶向N 和S基因的一管“樣品進(jìn)結(jié)果出”方案，檢測(cè)限低至每微升0.2 個(gè)拷貝。Tholoth 等［20］將RPA 和LAMP 相結(jié)合，構(gòu)建了用于檢測(cè)COVID-19 的兩階段等溫?cái)U(kuò)增，稱為COVID-19 Penn-RAMP，第一階段在管帽中與外部LAMP 引物初步反應(yīng)，通過(guò)RPA 擴(kuò)增所有靶標(biāo)，第二階段試管離心或翻轉(zhuǎn)，混合RPA 和LAMP 體系，啟動(dòng)高度特異性的LAMP 反應(yīng)，進(jìn)一步組合其他4種RAMP 引物，這種嵌套結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)更高的靈敏度，并且對(duì)抑制劑有更好的耐受性。

RPA方法靈敏度高，無(wú)需加熱部件在常溫下即可擴(kuò)增，并且反應(yīng)速度相較于LAMP 更快，然而由于專利原因，相關(guān)試劑需要從指定公司購(gòu)入，導(dǎo)致成本提高并且限制了該方法在即時(shí)檢測(cè)上的應(yīng)用。

2.2.3 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(nicking enzyme amplification reaction，NEAR） NEAR 原理見圖3，反應(yīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶、切口酶和恒溫?cái)U(kuò)增DNA 聚合酶驅(qū)動(dòng)，DNA 模板與引物雜交，延伸產(chǎn)物被下一個(gè)模板置換，置換產(chǎn)物互補(bǔ)鏈延伸形成切口酶識(shí)別位點(diǎn)，切口酶識(shí)別并切割雙鏈DNA 中的一條鏈的特定短序列形成缺口，恒溫?cái)U(kuò)增的DNA 聚合酶從引物的3′端延伸核苷酸繼續(xù)合成短序列，得到NEAR擴(kuò)增雙鏈，通過(guò)切割、延伸循環(huán)不斷擴(kuò)增靶標(biāo)DNA 模板，設(shè)計(jì)分子信標(biāo)產(chǎn)生熒光信號(hào)用于定量［21］。NEAR可達(dá)到指數(shù)速率擴(kuò)增，該方法的優(yōu)勢(shì)在于速度和靈敏度，缺點(diǎn)在于短序列的設(shè)計(jì)存在高假陽(yáng)性的可能。

圖3 切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(NEAR)原理示意圖

3 檢測(cè)方法

3.1 實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)原理為在體系中添加化學(xué)發(fā)光物質(zhì)從而擴(kuò)增在過(guò)程中讀取熒光信號(hào)以實(shí)現(xiàn)定量。在RT-PCR 常用的方法為嵌入熒光染料法和Taqman 探針?lè)?。嵌入熒光染料法是指使用能與DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物非特異性結(jié)合的熒光染料（例如SybrGreen），Taqman 探針?lè)ㄊ侵冈O(shè)計(jì)包含5′熒光團(tuán)和3′淬滅基團(tuán)的短的寡核苷酸探針與DNA模板中的序列退火，Taq聚合酶通過(guò)其5′至3′核酸外切酶活性切割退火的探針上的熒光基團(tuán)，使其發(fā)出熒光。測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)達(dá)到熒光閾值時(shí)所經(jīng)歷的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Ct）即可進(jìn)行定量。RPA 在常溫下就可以反應(yīng)，其結(jié)果可以通過(guò)與exo 探針結(jié)合進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。Behrmann 等［19］引入內(nèi)部淬火探針（exo-IQ）的概念，猝滅基團(tuán)通過(guò)內(nèi)部linker 連接在兩個(gè)核苷酸之間，克服了exo 探針對(duì)胸腺嘧啶距離的設(shè)計(jì)限制，該策略大大簡(jiǎn)化了exo 探針的設(shè)計(jì)。在標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)室采用的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)需要體積較大的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀，檢測(cè)人員也需要經(jīng)過(guò)專業(yè)訓(xùn)練，因而專門為即時(shí)檢測(cè)開發(fā)的商業(yè)化檢測(cè)儀器對(duì)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀進(jìn)行小型化處理，使其與樣本提取擴(kuò)增整合并且使結(jié)果易于讀取，更適合即時(shí)檢測(cè)環(huán)境，但由于仍需專門的儀器，在成本及推廣應(yīng)用方面存在限制。

3.2 可視化檢測(cè)

相比于熒光檢測(cè)需要專門的儀器進(jìn)行信號(hào)讀取，可視化檢測(cè)只需肉眼觀察即可，使得結(jié)果的讀取簡(jiǎn)單直觀，更適合即時(shí)檢測(cè)。可視化檢測(cè)包括添加pH 敏感染料比色法、濁度法或熒光染料法等方法。

可視化檢測(cè)常應(yīng)用于等溫?cái)U(kuò)增，Park 等［22］設(shè)計(jì)針對(duì)Nsp、S 和ORF8 基因的引物對(duì)，應(yīng)用無(wú)色結(jié)晶紫實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)，可在30 min 內(nèi)得出結(jié)果，特異性好，檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)100 個(gè)拷貝。Yan 等［23］通過(guò)實(shí)時(shí)濁度監(jiān)測(cè)和熒光鈣黃綠素可視化，平均可在26.28 min 中檢測(cè)到SARS-CoV-2。通過(guò)130 個(gè)臨床樣本驗(yàn)證，靈敏度和特異性均為100%。Yu等［13］選擇了一種新型的核酸染料GeneFinder?以進(jìn)一步增強(qiáng)熒光信號(hào)和靈敏度?？梢暬瘷z測(cè)可以使得等溫?cái)U(kuò)增進(jìn)一步適應(yīng)即時(shí)檢測(cè)的使用場(chǎng)景，減少操作人員的專業(yè)要求，也不需要專門的設(shè)備，但相比于熒光檢測(cè)，靈敏度會(huì)有所下降。而結(jié)合智能手機(jī)的成像和傳感平臺(tái)可以實(shí)現(xiàn)可視化結(jié)果的量化［17，24］，相比于目視判定更加客觀，可以提高檢測(cè)準(zhǔn)確度。并且使用智能手機(jī)應(yīng)用程序可以快速診斷疾病，監(jiān)控個(gè)人或人群的健康狀況，并向云端上傳地理和人口數(shù)據(jù)用于流行病學(xué)分析。開發(fā)結(jié)合智能手機(jī)的設(shè)備有利于快速、準(zhǔn)確地應(yīng)對(duì)當(dāng)前以及未來(lái)的傳染病爆發(fā)［25］。

3.3 側(cè)向流檢測(cè)

基于紙張的側(cè)向流分析（LFA）成本低，易于制造且與即時(shí)檢測(cè)完全兼容，是居家檢測(cè)或資源貧乏地區(qū)檢測(cè)的富有潛力的工具。Xia 等［11］進(jìn)一步提出一種更簡(jiǎn)化的甚至可以在家中進(jìn)行檢測(cè)的RT-RPA 方法，設(shè)計(jì)了nfo-affinity 探針系統(tǒng)以及用于RNA 檢測(cè)的側(cè)向流動(dòng)試紙條，可以目視檢測(cè)到最低1 ag N 基因RNA，考察發(fā)現(xiàn)該方法可以簡(jiǎn)單地通過(guò)使用保溫杯來(lái)執(zhí)行。AuNPs合成便利，表面可以被數(shù)百種核酸修飾?？赏ㄟ^(guò)由AuNPs 聚集引起的顏色變化進(jìn)行比色測(cè)定，閉管的反應(yīng)形式可以最大程度地減少操作步驟并避免交叉污染。Moitra 等［26］用針對(duì)SARS-CoV-2 N 基因的巰基修飾的反義寡核苷酸封閉的AuNPs 以及RNaseH 以實(shí)現(xiàn)在10 min 內(nèi)通過(guò)觀測(cè)沉淀來(lái)“裸眼”選擇性檢測(cè)SARS-CoV-2。但檢測(cè)限為0.18 ng/μL RNA，因此僅采用納米粒子不足以靈敏檢測(cè)病毒RNA，將其引入核酸擴(kuò)增系統(tǒng)中可以增強(qiáng)SARS-CoV-2 檢測(cè)的靈敏度和特異性，同時(shí)實(shí)現(xiàn)可視化側(cè)向流檢測(cè)。Zhu 等［27］結(jié)合了針對(duì)ORF1ab、N 基因的RT-LAMP與基于納米顆粒的側(cè)向流生物傳感器的分析方法，檢測(cè)限每個(gè)反應(yīng)可達(dá)12個(gè)拷貝，分析靈敏度和特異性均為100%。從樣品收集到得出結(jié)果，整個(gè)診斷測(cè)試可在1 h 內(nèi)完成。此外也有商業(yè)化儀器采用側(cè)向流技術(shù)作為檢測(cè)方法例如Accula（Mesa Biotech），避免了使用熒光探針和檢測(cè)器的需求。

3.4 CRISPR/Cas檢測(cè)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)是用于基因編輯的常用工具，有準(zhǔn)確識(shí)別和切割特定序列的能力，而活化的Cas 酶在特異性切割靶RNA 的同時(shí)能夠非特異性地切割周圍環(huán)境中的RNA 或DNA，可利用這一特性實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)。

3.4.1 SHERLOCK SHERLOCK（specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）的原理見圖4，將病毒RNA 靶標(biāo)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后通過(guò)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增的產(chǎn)物被T7RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄回RNA 以此擴(kuò)增靶RNA。Cas13a 是一種非特異性RNase，識(shí)別并結(jié)合靶向擴(kuò)增的RNA 產(chǎn)物后被激活，對(duì)附近的非靶向RNA 進(jìn)行非特異性反式核酸內(nèi)切酶切割即“附帶”切割，裂解ssRNA 報(bào)告分子使其從淬滅劑中釋放出熒光染料，用于信號(hào)放大和核酸檢測(cè)，并允許熒光，比色，側(cè)向流動(dòng)等讀出方法來(lái)快速檢測(cè)各種靶標(biāo)［28］。Zhang 等［29］發(fā)布了用于檢測(cè)SARS-CoV-2 的SHERLOCK 流程，靶向Orf1ab 和S 基因，RPA 等溫?cái)U(kuò)增后Cas13 切割，在商業(yè)化試紙條上讀取結(jié)果，3 步檢測(cè)僅需約1 h，但只使用合成的RNA 對(duì)新冠病毒CRISPR 檢測(cè)的表現(xiàn)進(jìn)行了評(píng)估，未用患者樣本進(jìn)行檢測(cè)。Hou等［30］在RNA 提 取 步 驟 之 后，用 靶 向Orf1ab 的SHERLOCK 方法得到近單拷貝的靈敏度及良好的特異性。在52 個(gè)患者臨床樣本中驗(yàn)證具有100%的臨床靈敏度，周轉(zhuǎn)時(shí)間僅需40 min，證明了其診斷潛力。

圖4 SHERLOCK原理示意圖

SHERLOCK 是兩步反應(yīng)：首先RT-RPA擴(kuò)增再轉(zhuǎn)錄回RNA 進(jìn)行Cas13 檢測(cè)，由于涉及兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)步驟，因此需要進(jìn)行液體處理和開管，這不僅增加了復(fù)雜性，而且大大增加了樣品交叉污染的可能性，不適宜在良好控制的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境范圍外使用。為了使SHERLOCK 能在即時(shí)檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，Joung 等［31］開發(fā)了在一鍋中進(jìn)行SHERLOCK 測(cè)試的方法，稱為STOPCovid（SHERLOCK Testing in One Pot），將LAMP 與CRISPR 介導(dǎo)的檢測(cè)步驟相結(jié)合，將經(jīng)典的兩步SHERLOCK轉(zhuǎn)化為單步反應(yīng)，不需要樣本提取，檢測(cè)限為100個(gè)拷貝，可在1 h 內(nèi)用商業(yè)側(cè)向流試紙條或熒光讀數(shù)檢測(cè)，并通過(guò)臨床樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，適用于即時(shí)檢測(cè)。

3.4.2 DETECTR Cas12 是CRISPR-Cas 效 應(yīng) 子家族的另一個(gè)成員，具有靶標(biāo)激活的非特異性單鏈脫氧核糖核酸酶（ssDNase）特性，是一種RNA 引導(dǎo)的DNA 核酸內(nèi)切酶，在結(jié)合靶序列后會(huì)不加區(qū)別地裂解ssDNA。在DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）方法中（圖5），病毒RNA 首先被轉(zhuǎn)化為DNA，然后等溫?cái)U(kuò)增后的DNA 中的特定靶序列激活Cas12a，Cas12a 依次切割ssDNA 報(bào)告探針釋放肉眼可見的熒光分子，可實(shí)現(xiàn)靈敏且特異的DNA檢測(cè)［32］。

圖5 DETECTR檢測(cè)原理示意圖

基于熒光的檢測(cè)方法相對(duì)靈敏度更高且可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，Huang 等［33］采用一步式RT-RPA方法從鼻拭子提取的病毒RNA 中擴(kuò)增靶區(qū)域，并將所得的擴(kuò)增產(chǎn)物整體轉(zhuǎn)移至96孔微量滴定板中進(jìn)行熒光檢測(cè)，使用熒光板讀取器進(jìn)行信號(hào)讀取，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，樣品到結(jié)果的時(shí)間約為50 min，檢測(cè)限為每個(gè)反應(yīng)2 個(gè)拷貝，靈敏度優(yōu)于qPCR 測(cè)定法。該方法可以應(yīng)用于大多數(shù)設(shè)備齊全的臨床實(shí)驗(yàn)室中，但是需要進(jìn)一步設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)脑O(shè)備應(yīng)用于即時(shí)檢測(cè)，以使資源缺乏的小型診所也能進(jìn)行該測(cè)試。CRISPR 還可以使用側(cè)向流試紙條來(lái)檢測(cè)信號(hào)，它不需要任何設(shè)備即可快速讀取結(jié)果，更適合應(yīng)用于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的即時(shí)檢測(cè)，對(duì)于單樣本測(cè)試，這是一個(gè)很好的解決方案，具有便攜低成本的優(yōu)勢(shì)，但使用側(cè)向流試紙條檢測(cè)結(jié)果的方法靈敏度會(huì)有所降低［34-35］。以上開發(fā)的方法仍需對(duì)樣本進(jìn)行開管進(jìn)行液體操作，為了解決這一問(wèn)題，Ding 等［36］提出All-In-One Dual CRISPR-Cas12（AIOD-CRISPR）檢測(cè)方法，用于核酸擴(kuò)增和CRISPR 檢測(cè)的所有成分都在一個(gè)單管反應(yīng)系統(tǒng)中，靈敏度能達(dá)到每微升4.6 個(gè)拷貝。而Guo 等［37］建立了一個(gè)集成樣品處理方案、重組酶輔助擴(kuò)增（RAA）及CRISPR 檢測(cè)的病毒核酸檢測(cè)平臺(tái)，檢測(cè)限為每毫升1×104拷貝，為了使該平臺(tái)更適合即時(shí)檢測(cè)，還構(gòu)建了一個(gè)帶有藍(lán)色LED 的便攜式暗盒以便實(shí)現(xiàn)可視化。

基于RNA 的CRISPR/Cas 策略與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合的快速核酸檢測(cè)技術(shù)，可以提高等溫?cái)U(kuò)增測(cè)定的靈敏度，特異性和可靠性，CRISPR 檢測(cè)還可與側(cè)向流讀數(shù)耦合，很適合居家檢測(cè)的場(chǎng)景，為下一代分子診斷技術(shù)的發(fā)展和即時(shí)檢測(cè)的應(yīng)用展示了廣闊的前景。

4 商業(yè)一體化即時(shí)檢測(cè)方法

商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)方法通常通過(guò)開發(fā)配套儀器設(shè)備來(lái)實(shí)現(xiàn)整合提取、擴(kuò)增及檢測(cè)過(guò)程，將所有試劑裝在一個(gè)盒中，并通過(guò)使用機(jī)械操作或微流控技術(shù)以基本實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、最大程度地減少人工操作，減少總測(cè)試時(shí)間，提高周轉(zhuǎn)速度。

從2020 年3 月開始，美國(guó)食品和藥物管理局（FDA）對(duì)多項(xiàng)測(cè)試授予了EUA，值得注意的是有越來(lái)越多基于RT-PCR 原理的即時(shí)檢測(cè)商業(yè)化測(cè)試正在被開發(fā)。目前獲得臨床實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)修正案的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（CLIA）豁免的基于RT-PCR 原理進(jìn)行SARS-CoV-2 測(cè)試的即時(shí)檢測(cè)有Cepheid 公司的Xpert Xpress SARS-CoV-2 和Mesa Biotech 公 司Accula SARS-CoV-2［38］。Xpert Xpress SARS-CoV-2（Cepheid）通過(guò)RT-PCR 檢測(cè)E 基因和N2 基因兩個(gè)靶標(biāo)，在大約45 min 內(nèi)即可得到結(jié)果，將整個(gè)過(guò)程自動(dòng)化，不需要用戶進(jìn)行特殊培訓(xùn)。許多研究團(tuán)隊(duì)將Xpert Xpress SARS-CoV-2 與基于實(shí)驗(yàn)室的RT-PCR 在臨床樣本中進(jìn)行了比較，顯示出極好的一致性（＞99%），并且發(fā)現(xiàn)在較低的病毒水平也能可靠檢測(cè)［39］。Mesa Biotech 公司的Accula 結(jié)合了RT-PCR 分子診斷和側(cè)向流分析技術(shù)，僅需30 min即得到結(jié)果并且儀器僅手掌大小便于攜帶。為了評(píng)估Accula 測(cè)試的性能，Hogan 等［40］比較了100 份鼻咽拭子樣品的結(jié)果，總體一致性為84.0%，陽(yáng)性一致性僅有68.0%。對(duì)于病毒載量低的樣品，陽(yáng)性一致性較低，易出現(xiàn)假陰性。這表明Accula 即時(shí)檢測(cè)靈敏度不高，應(yīng)仔細(xì)考慮即時(shí)檢測(cè)的潛在優(yōu)勢(shì)與降低診斷準(zhǔn)確性之間的平衡。國(guó)內(nèi)基于RT-PCR 原理的商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)裝置有圣湘生物科技股份有限公司的iPonatic 移動(dòng)分子診斷系統(tǒng)、上海透景生命科技股份有限公司2019新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑盒（卡式熒光PCR 法）。iPonatic采用一步核酸免提取技術(shù)，并搭配快速核酸檢測(cè)系統(tǒng)，一站式完成樣本裂解、核酸提取、PCR 擴(kuò)增及結(jié)果分析。透景生命的檢測(cè)卡盒采用磁珠法進(jìn)行核酸提取，實(shí)現(xiàn)提取擴(kuò)增全程自動(dòng)化，但該方法需要手動(dòng)裝載磁珠和樣本，需要在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行。此外還有能夠?qū)崿F(xiàn)多重PCR（mPCR）的商業(yè)化平臺(tái)，例如QIAstat-Dx（QIAGEN 公司）、BioFire FilmArray（bioMérieux 公司）等平臺(tái)。QIAstat-Dx 除了支持液體運(yùn)輸介質(zhì)外，還有獨(dú)特的干拭子直接上樣程序，手動(dòng)操作少于1 min，可在1 h內(nèi)得出結(jié)果。BioFire FilmArray（bioMérieux 公司）利用巢式多重PCR 結(jié)合微流控芯片技術(shù)實(shí)現(xiàn)1 h快速檢測(cè)，巢式PCR 技術(shù)可以最大程度排除其他非特異性病原體核酸物質(zhì)的干擾，同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度。表1列舉了目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時(shí)檢測(cè)方法［38，41］。

表1 目前商業(yè)化的基于RT-PCR原理的即時(shí)檢測(cè)方法

等溫?cái)U(kuò)增由于不需要借助熱循環(huán)儀，在恒定溫度下即可實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和可視化檢測(cè)，因而可以大大減小設(shè)備體積，相對(duì)于RT-PCR 更適合用于資源缺乏地區(qū)即時(shí)檢測(cè)的開發(fā)。北京航空航天大學(xué)、華西醫(yī)院聯(lián)合研發(fā)出一款針對(duì)ORF/N/E 3 個(gè)基因位點(diǎn)的便捷式病原體核酸快速檢測(cè)儀，由便攜式檢測(cè)儀和等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)錐形微孔陣列高通量芯片構(gòu)成，能實(shí)現(xiàn)高靈敏度、低成本（1萬(wàn)元/臺(tái)，10元/人份）、快速（25 min）、高通量（64 個(gè)）即時(shí)檢測(cè)，113例核酸樣本檢測(cè)表明靈敏度大于95%，特異性大于95.3%。優(yōu)思達(dá)公司EasyNAT 即時(shí)分子診斷系統(tǒng)是已獲批的一體化等溫?cái)U(kuò)增儀器，試劑用玻璃化技術(shù)預(yù)混裝在全自動(dòng)反應(yīng)管中，將裂解、磁珠提取、純化、洗脫、擴(kuò)增等過(guò)程在外部磁導(dǎo)的作用下自動(dòng)化完成，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)79 min，全程密閉檢測(cè)，無(wú)需專業(yè)PCR 實(shí)驗(yàn)室。Abbott 公司的ID Now 是利用NEAR原理的一種商業(yè)化即時(shí)檢測(cè)方法，它設(shè)計(jì)靶向擴(kuò)增SARS-CoV-2 的RdRp 片段，可在5 min 內(nèi)提供0.125 copies/μL 的靈敏度。檢測(cè)陽(yáng)性樣品僅需5 min，陰性樣品也只需13 min。用熒光標(biāo)記的分子信標(biāo)特異性鑒定擴(kuò)增的RNA 靶標(biāo)。然而，有評(píng)估顯示ID NOW 與RT-PCR 陽(yáng)性一致率僅有約80%［42］，這意味著Abbott 公司的ID Now 的性能有很大的局限性，對(duì)于強(qiáng)陽(yáng)性和中等陽(yáng)性樣品，ID NOW 表現(xiàn)良好，但對(duì)于弱陽(yáng)性樣品靈敏度降低［43］，因此在對(duì)疑似患者使用此測(cè)試時(shí)，應(yīng)考慮到靈敏度的問(wèn)題。等溫?cái)U(kuò)增一體化儀器適合資源缺乏地區(qū)以及人流聚集環(huán)境下的便攜式病原體快速檢測(cè)，但目前對(duì)于低成本、高準(zhǔn)確度、適合即時(shí)檢測(cè)的等溫核酸擴(kuò)增儀的開發(fā)仍處于探索階段，有廣闊的發(fā)展前景。

5 總結(jié)和展望

相比于基于實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR 流程，即時(shí)檢測(cè)方法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)“樣本進(jìn)，結(jié)果出”，可以促進(jìn)更快的臨床決策，以社區(qū)為單位進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)可以減輕中心醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室的負(fù)擔(dān)。目前已開發(fā)出許多為了更好地應(yīng)用于新冠即時(shí)檢測(cè)而在提取、擴(kuò)增、檢測(cè)等方面進(jìn)行相應(yīng)改進(jìn)的方法，包括簡(jiǎn)化提取步驟，優(yōu)化即時(shí)檢測(cè)場(chǎng)景下基于RT-PCR、核酸等溫?cái)U(kuò)增等原理開發(fā)的方法（表2）的擴(kuò)增性能、采用熒光讀取、可視化技術(shù)、側(cè)向流檢測(cè)和CRISPR 檢測(cè)以方便結(jié)果識(shí)別讀出等，推動(dòng)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確，快速，便攜，簡(jiǎn)便和低成本的即時(shí)檢測(cè)目標(biāo)。但目前針對(duì)新冠檢測(cè)的即時(shí)檢測(cè)方法大多為概念研究階段，距離商品化應(yīng)用還有距離。而已被批準(zhǔn)上市的即時(shí)檢測(cè)方法需要在專門的配套儀器上使用，實(shí)現(xiàn)了提取、擴(kuò)增、檢測(cè)一體化，極大推動(dòng)了即時(shí)檢測(cè)的發(fā)展，但大多仍然需要專業(yè)人員在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境操作，且儀器價(jià)格較高、市場(chǎng)占有率小等問(wèn)題也會(huì)限制其在即時(shí)檢測(cè)場(chǎng)景中的應(yīng)用，此外部分商品化儀器實(shí)際檢測(cè)性能仍有待進(jìn)一步評(píng)估和改進(jìn)，市場(chǎng)上仍缺少真正能夠?qū)崿F(xiàn)普通大眾居家或資源缺乏地區(qū)在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境進(jìn)行測(cè)試的準(zhǔn)確可靠的即時(shí)檢測(cè)試劑盒，對(duì)于在受控環(huán)境之外和非專業(yè)訓(xùn)練的工作人員進(jìn)行測(cè)試時(shí)的污染和假陽(yáng)性風(fēng)險(xiǎn)也是即時(shí)檢測(cè)所面臨的問(wèn)題。即時(shí)檢測(cè)方法的開發(fā)主要是為了應(yīng)用于資源短缺地區(qū)或待檢樣品數(shù)超過(guò)當(dāng)?shù)貦z測(cè)能力地區(qū)的現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)，這就要求理想的研發(fā)方法能夠具有以下特征：（1）裝置盡量小型化、便攜化；（2）用戶友好，操作簡(jiǎn)單，方便非專業(yè)操作人員的培訓(xùn)；（3）考慮到生物安全問(wèn)題，盡量設(shè)計(jì)為免提取密閉自動(dòng)化操作，減少開蓋，保證非專業(yè)人員在非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境操作的安全；（4）周轉(zhuǎn)時(shí)間短，能在1～2 h 或更短時(shí)間內(nèi)出結(jié)果；（5）信號(hào)讀取方便直觀，可以直接得出是否為陽(yáng)性的結(jié)果，例如可視化技術(shù)。除了為快速控制新冠病毒的傳播提供有力支持以外，這些針對(duì)新型冠狀病毒的即時(shí)檢測(cè)研究成果也可以應(yīng)用于其他疾病的緊急防御和快速部署，有助于應(yīng)對(duì)未來(lái)可能的新興傳染病。

表2 基于不同原理的SARS-CoV-2核酸即時(shí)檢測(cè)方法對(duì)比