李琨，裴卉，曹宇，馬麗娜，李浩

參麻益智方對(duì)血管性癡呆模型大鼠Nrf2/HO-1通路及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

李琨1，裴卉2，曹宇2，馬麗娜2，李浩2

1.北京開(kāi)放大學(xué)，北京 100081；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091

觀察參麻益智方對(duì)血管性癡呆（VaD）模型大鼠Nrf2/HO-1通路及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，探討其治療VaD的分子機(jī)制。Wistar大鼠60只隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組和參麻益智方低、中、高劑量組，各給藥組給予相應(yīng)劑量藥物。大鼠采用微血栓栓塞法造模，給藥4周后進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力測(cè)試，采用RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)大鼠海馬組織核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶1（HO-1）基因和蛋白的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期均明顯延長(zhǎng)，海馬組織Nrf2、HO-1蛋白和mRNA表達(dá)均明顯升高，iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，標(biāo)記程度增強(qiáng)，形態(tài)上胞體變圓，分支減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，參麻益智方中、高劑量組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期均明顯縮短，Nrf2蛋白和mRNA表達(dá)均明顯升高，參麻益智方高劑量組大鼠HO-1 mRNA表達(dá)顯著升高，參麻益智方中、高劑量組大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞被iba-1標(biāo)記的程度減輕，數(shù)量減少，胞體變小，分支細(xì)長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。參麻益智方可明顯改善VaD大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與參麻益智方促進(jìn)Nrf2/HO-1通路蛋白及基因表達(dá)，以及抑制小膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度激活而發(fā)揮抗炎、抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)。

參麻益智方；血管性癡呆；核因子E2相關(guān)因子2；血紅素加氧酶1；小膠質(zhì)細(xì)胞；大鼠

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是繼發(fā)于缺血性和出血性腦血管疾病的認(rèn)知損害[1]。VaD是發(fā)病人數(shù)僅次于阿爾茨海默病的癡呆類型，嚴(yán)重影響老年人的生命健康和生活質(zhì)量。目前，VaD治療主要依靠藥物，常用藥物包括膽堿酯酶抑制劑、興奮氨基酸受體拮抗劑、促智藥、鈣離子拮抗劑等[2]，尚無(wú)針對(duì)VaD的特效藥物[3]。中醫(yī)藥在治療VaD方面取得了較好的效果[4]，參麻益智方由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院周文泉教授的經(jīng)驗(yàn)方化裁而來(lái)[5]。參麻益智方臨床治療VaD可有效改善患者認(rèn)知障礙等癥狀，提高M(jìn)MSE量表積分[6]。腦卒中引起的腦損傷是VaD的直接原因，而氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是加重腦卒中后腦損傷的重要機(jī)制，Nrf2/HO-1通路是抗炎抗氧化的主要通路。本研究觀察參麻益智方對(duì)VaD模型大鼠Nrf2/HO-1通路及小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，從而明確參麻益智方治療VaD的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠60只，鼠齡10周，體質(zhì)量260～340 g，北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物室，自由攝食飲水。

1.2 藥物

根據(jù)人與大鼠藥物劑量換算，按3∶3∶3∶2比例取人參、天麻、鬼箭羽、川芎飲片共5.2 kg，飲片由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院中藥房提供，純凈水浸泡，常規(guī)煎煮2次，合并2次藥液，100 ℃恒溫水浴箱濃縮至含原藥材1 g/mL，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

血紅素加氧酶1（HO-1）兔多克隆抗體，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR237605-11；核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）小鼠單克隆抗體，美國(guó)Abcam公司，批號(hào)GR293311-1；iba-1兔多克隆抗體，德國(guó)Proteintech公司，批號(hào)00024334。ZS-001型Morris水迷宮系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)1056001），多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek Synergy HTX），SDS-PAGE電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)UVP EC3410），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（瑞士Roche Light Cycler 96）。

1.4 分組、造模及給藥

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、假手術(shù)組、模型組和參麻益智方低（3.3 g/kg）、中（6.6 g/kg）、高劑量組（16.5 g/kg），每組10只。參麻益智方低、中、高劑量組藥物濃度依據(jù)人與大鼠藥物劑量換算取得。采用微血栓栓塞法構(gòu)建多梗死性癡呆和腔隙性腦梗死性癡呆大鼠模型[7]。自大鼠腹主動(dòng)脈取血，靜置24 h形成凝血塊后生理鹽水沖洗，取凝血塊0.5 g，加入生理鹽水10 mL，組織勻漿，200 μm細(xì)胞篩過(guò)濾備用。術(shù)前大鼠禁食8 h，腹腔注射4%水合氯醛0.9 mL/kg麻醉，頸部正中切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈，模型組和參麻益智方各劑量組夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈，結(jié)扎右側(cè)頸外動(dòng)脈，于結(jié)扎近心端注射制備好的凝血塊0.3 mL，松開(kāi)頸總動(dòng)脈夾，傷口碘伏消毒后縫合皮膚?？瞻捉M不做任何處理，假手術(shù)組頸外動(dòng)脈注射0.3 mL生理鹽水后即縫合。術(shù)后第2日各給藥組給予相應(yīng)藥物（6 mL/kg）灌胃，1次/d，連續(xù)4周，模型組及假手術(shù)組予等體積蒸餾水灌胃。

1.5 記憶功能檢測(cè)

給藥4周后，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，連續(xù)5 d依次將大鼠放入水迷宮進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每日分別從水迷宮不同象限下水進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，計(jì)算平均逃避潛伏期。

1.6 Western blot檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子2、血紅素加氧酶1蛋白表達(dá)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，腹腔注射4%水合氯醛麻醉，大鼠主動(dòng)脈灌流后固定取腦。每組取5只大鼠全腦石蠟包埋，切片后進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。另5只分離右側(cè)海馬組織，液氮速凍后取部分組織RIPA裂解液裂解，超聲破碎至底部無(wú)組織沉淀，制成海馬組織勻漿。冰上孵育20 min，4 ℃、13 000 r/min離心20 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入loading buffer，95 ℃處理5 min，-20 ℃冰箱保存。SDS-PAGF凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，TBST洗膜后將PVDF膜放入裝有5%BSA濕盒中搖床孵育30 min，加一抗Nrf2、HO-1、GAPDH，搖床孵育30 min，4 ℃冰箱封閉過(guò)夜。TBST洗膜，5%BSA溶液搖床孵育30 min，加二抗，搖床孵育90 min，TBST洗膜。經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物覆蓋后，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行條帶灰度分析。

1.7 RT-qPCR檢測(cè)核因子E2相關(guān)因子2、血紅素加氧酶1 mRNA表達(dá)

取部分海馬組織，Trizol試劑盒提取RNA，加入去RNA酶水溶解RNA，DNAaseⅠ去除樣品中DNA，樣品進(jìn)行RNA瓊脂糖凝膠電泳，紫外分光光度計(jì)觀察顯示18 s和28 s兩條RNA條帶，計(jì)算Ratio值在1.8～2.0，證明mRNA完整性好、純度高。引物由北京中美泰和生物技術(shù)有限公司合成，Nrf2上游引物為5’-ATATACGCAGGAGAGGGAAG-3’，下游引物為5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’；HO-1上游引物為5’-TCCCATCCTCATCACGTAAC-3’，下游引物為5’-CCAGGCATCTCCTTCCATTC-3’。RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系分別加入2×Ex TaqMix（12.5 μL）、10 μmol/L上游引物及下游引物復(fù)合物（0.75 μL）及其對(duì)應(yīng)的cDNA（1.0 μL），再加入ddH2O調(diào)節(jié)液體，總量至25 μL，陰性對(duì)照組不加模板RNA。液體充分混勻，置于PCR儀中94 ℃初始變性5 min，94 ℃、30 s→60 ℃、30 s→72 ℃、60 s，循環(huán)40次，4 ℃終止。120 V進(jìn)行DNA瓊脂糖凝膠電泳20 min，凝膠紫外分析儀成像。

1.8 免疫組化檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞激活程度

腦組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片（厚度5 μm）處理后，按1∶500比例進(jìn)行抗體稀釋，加入一抗iba-1 20 μL，置于濕盒37 ℃孵育2 h，4 ℃過(guò)夜，次日于37 ℃復(fù)溫45 min，PBS振蕩清洗，每次5 min，連續(xù)5次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗20 μL，置于濕盒37 ℃孵育30 min，PBS振蕩清洗，每次5 min，連續(xù)5次。滴加DAB工作液100 μL至切片組織變?yōu)辄S褐色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 參麻益智方對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)（＜0.01）；與模型組比較，參麻益智方高、中劑量組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05），參麻益智方低劑量組大鼠逃避潛伏期差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（±s，s）

注：與假手術(shù)組比較，△△＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

2.2 參麻益智方對(duì)核因子E2相關(guān)因子2、血紅素加氧酶1蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，假手術(shù)組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，參麻益智方中、高劑量組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與空白組比較，#＜0.05，##＜0.01；與假手術(shù)組比較，△△＜0.01；與模型組比較，*＜0.05，**＜0.01

注：a.空白組；b.假手術(shù)組；c.模型組；d.參麻益智方低劑量組；e.參麻益智方中劑量組；f.參麻益智方高劑量組

2.3 參麻益智方對(duì)模型大鼠海馬組織核因子E2相關(guān)因子2、血紅素加氧酶1 mRNA表達(dá)的影響

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)均明顯升高（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，參麻益智方高、中劑量組大鼠海馬組織Nrf2 mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.01），參麻益智方高劑量組大鼠海馬組織HO-1 mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.01）。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△＜0.05；△△＜0.01；與模型組比較，**＜0.01

注：a.空白組；b.假手術(shù)組；c.模型組；d.參麻益智方低劑量組；e.參麻益智方中劑量組；f.參麻益智方高劑量組

2.4 參麻益智方對(duì)模型大鼠海馬組織小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

鏡下觀察海馬CA1區(qū)iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞顯示，空白組、假手術(shù)組標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量較少，胞體小，分支細(xì)而長(zhǎng)；模型組較假手術(shù)組標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多，標(biāo)記程度增強(qiáng)，形態(tài)上胞體變圓，分支減少；參麻益智方低劑量組小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)略變小，數(shù)量略減少；參麻益智方高、中劑量組較模型組小膠質(zhì)細(xì)胞被iba-1標(biāo)記的程度減輕，較模型組數(shù)量減少，胞體變小，分支細(xì)長(zhǎng)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

注：a.空白組；b.假手術(shù)組；c.模型組；d.參麻益智方低劑量組；e.參麻益智方中劑量組；f.參麻益智方高劑量組

3 討論

Nrf2/HO-1信號(hào)通路是體內(nèi)重要的抗炎、抗氧化通路，Nrf2是體內(nèi)抗氧化應(yīng)激、抗炎的關(guān)鍵性物質(zhì)。Nrf2基因敲除小鼠VaD癥狀較野生型更重[8]。正常條件下Nrf2的Neh2功能區(qū)與Keap1 DGR功能區(qū)相連形成異二聚體，使Nrf2錨定于細(xì)胞質(zhì)中。腦缺血缺氧時(shí)，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，從而激活Nrf2，使Nrf2發(fā)生核轉(zhuǎn)位，與ARE反應(yīng)元件結(jié)合，從而激活下游200多種基因的表達(dá)[9]。HO-1是其中一種重要的酶，通過(guò)分解血紅素的分解產(chǎn)物而產(chǎn)生抗炎、抗氧化的作用[10]，HO-1在腦內(nèi)主要分布于小膠質(zhì)細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白含量較假手術(shù)組、空白組高，提示缺血缺氧后Nrf2、HO-1表達(dá)升高，從而發(fā)揮抗氧化、抗炎作用；參麻益智方中、高劑量組大鼠海馬組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)較模型組明顯升高，提示中、高劑量參麻益智方可提高大鼠海馬組織內(nèi)細(xì)胞Nrf2的表達(dá)，Nrf2在發(fā)生核轉(zhuǎn)位后激活下游基因HO-1的表達(dá)，與胡躍強(qiáng)等[11]研究一致。免疫組化結(jié)果顯示，與空白組及假手術(shù)組比較，模型組iba-1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞激活數(shù)量增多，胞體變圓，分支減少，呈阿米巴狀，而參麻益智方中、高劑量組小膠質(zhì)細(xì)胞胞體相對(duì)較小，分支多而長(zhǎng)，激活數(shù)量減少，從組織層面提示參麻益智方可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減輕炎癥反應(yīng)。推測(cè)參麻益智方通過(guò)Nrf2/HO-1通路抑制炎癥，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。為了進(jìn)一步驗(yàn)證本結(jié)果，采用RT-qPCR檢測(cè)Nf2、HO-1 mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，參麻益智方中、高劑量組可提高Nrf2、HO-1 mRNA的表達(dá)，從基因?qū)用嫣崾緟⒙橐嬷欠酵ㄟ^(guò)Nrf2/HO-1通路發(fā)揮抗炎、抗氧化的作用，從而改善模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

VaD屬中醫(yī)學(xué)“呆證”范疇，《素問(wèn)?調(diào)經(jīng)論篇》有“血并于下，氣并于上，亂而喜忘”，《雜病源流犀燭?中風(fēng)》“中風(fēng)后善忘”。周文泉[12]認(rèn)為VaD是臟腑功能失調(diào)，中風(fēng)形成的病理產(chǎn)物痰濁瘀血停留于腦竅，形成窠囊，神明失用而致智能障礙，其病機(jī)以臟腑功能失調(diào)為本，以痰瘀阻絡(luò)為標(biāo)。

參芪益智方由人參、天麻、鬼箭羽、川芎4味藥物組成，其主要功效是益氣活血增智，其中君以人參，可大補(bǔ)元?dú)?、安神、益智?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載人參“主補(bǔ)五臟，安精神，止驚悸，除邪氣，明目，開(kāi)心益智”。相關(guān)研究表明，人參有效成分可提高癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制與減輕炎癥反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激有關(guān)[13]。《名醫(yī)別錄》認(rèn)為人參有“令人不忘”功效。臣以天麻，可平肝熄風(fēng)止痙?！端幮哉摗氛J(rèn)為天麻可治療“癱緩不遂，語(yǔ)多恍惚，多驚失志”。川芎活血行氣，上行頭目，引藥上入于腦，鬼箭羽破血通經(jīng)，增強(qiáng)全方化瘀之力，二藥共為佐使藥。

VaD目前發(fā)病機(jī)制不明，西藥治療效果并不理想，而中醫(yī)藥對(duì)VaD有較好療效，積極探索中醫(yī)藥治療VaD機(jī)制，可為VaD的研究和治療提供新思路。

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Effects ofPrescription on Nrf2/HO-1 Pathway and Microglia in Ratswith Vascular Dementia

LI Kun1, PEI Hui2, CAO Yu2, MA Lina2, LI Hao2

To evaluate the effects ofPrescription on Nrf2/HO-1 pathway and microglia in rats with vascular dementia (VaD); To explore its molecular mechanism of VaD treatment.Totally 60 Wistar rats were randomly divided into blank group, sham-operation group, model group,Prescription low-, medium-, and high-dosage groups. Each administration group was given relevant dosage of medicine. Microthromboembolism was used to create the model. The learning and memory abilities of model rats were tested after 4 weeks of administration. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expressions of Nrf2, HO-1 protein and gene in hippocampus of rats. Activation of microglia was detected by immunohistochemistry.Compared with the sham-operation group, the escape latency of the water maze experiment in the model group was significantly prolonged, the protein contents of Nrf2 and HO-1 increased, the mRNA expressions of Nrf2 and HO-1 increased, the number of microglia labeled by iba-1 significantly increased, the degree of labeling was enhanced, the cell body became round and the branches decreased, with statistical significance (<0.05,<0.01). Compared with the model group, the escape latency of the water maze experiment inPrescription medium- and high-dosage groups was significantly shortened, the expression of protein and mRNA of Nrf2 significantly increased, the expression of HO-1 mRNA significantly increased inPrescription high-dosage group, the degree of microglia labeled by iba-1 was reduced inPrescription medium- and high-dosage groups, the number of microglia was decreased, the cell body was smaller, and the branches were slender, with statistical significance (<0.01,<0.05).Prescription can significantly improve the learning and memory abilities of VaD rats. The mechanism may be related to the anti-inflammatory and anti-oxidative stress effects ofPrescription on promoting Nrf2/HO-1 pathway protein and gene expression, and inhibiting the over activation of microglia.

Prescription; vascular dementia; Nrf2; HO-1; microglia; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)12-0038-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202005163

國(guó)家自然科學(xué)基金（81603616）；北京市科委“十病十藥”研發(fā)項(xiàng)目（Z171100001717016）

李浩，E-mail：xyhplihao1965@126.com

（2020-05-12）

（2020-06-15；編輯：華強(qiáng)）