孟凡怡，杜勝男，馮憲明，王 超，王衛(wèi)強(qiáng)

（1.遼寧石油化工大學(xué) 石油天然氣工程學(xué)院，遼寧撫順113001；2.中油（新疆）石油工程有限公司 設(shè)計(jì)分公司，新疆 克拉瑪依834000）

在含蠟原油的管輸過程中，當(dāng)溫度低于含蠟原油析蠟點(diǎn)時(shí)，蠟晶逐漸析出并沉積在管壁處，形成蠟沉積[1]。蠟的沉積會(huì)使蠟晶成塊狀聚集，蠟分子之間形成較強(qiáng)的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使原油黏度增加[2]。并且，蠟沉積使管道流通面積減小，增加油流摩擦阻力，降低管道輸送效率，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)l(fā)生凝管事故[3]。因此，解決含蠟原油蠟沉積問題，提高含蠟原油運(yùn)輸效率，保障含蠟原油的流動(dòng)，是油氣行業(yè)關(guān)注的重要問題。

傳統(tǒng)的除蠟方法，包括熱處理、清管和化學(xué)除蠟都存在一定的缺陷[4-5]。與傳統(tǒng)的除蠟方法相比，微生物清防蠟方法具有易于操作、環(huán)保、低毒性和可持續(xù)發(fā)展等特點(diǎn)[6-7]。M.H.Joo 等[8]將實(shí)驗(yàn)室已有菌種枯草芽孢桿菌用于原油除蠟，結(jié)果表明，在經(jīng)過枯草芽孢桿菌JK-1 處理的原油中，C1—C29 碳鏈在48 h 內(nèi)幾乎完全降解。N.Sakthipriya 等[9]從印度古吉拉特邦油田中篩選出一株枯草芽孢桿菌，在37 ℃的條件下使含蠟原油黏度降低了60.00%，在50 ℃條件下使含蠟原油黏度降低了82.00%。結(jié)果表明，該菌株對(duì)熱帶氣候國(guó)家原油的降黏效果非常明顯。A.Daryasafar 等[10]從伊朗油田中篩選出一株地衣芽孢桿菌并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，該菌株能夠產(chǎn)生生物表面活性劑，結(jié)果表明含蠟原油黏度降低了41.24%。C.Luo 等[11]發(fā)現(xiàn)假單胞菌DG2 并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該菌可以產(chǎn)生脂肽類生物表面活性劑，并且能夠乳化原油，降低油水界面張力，使原油黏度降低了23.00%，有效地提高了原油流動(dòng)性。上述研究結(jié)果表明，微生物可以降解烷烴，產(chǎn)生的生物表面活性劑對(duì)原油有乳化作用，可降低油水界面張力，提高含蠟原油流動(dòng)性。

在微生物清防蠟技術(shù)的發(fā)展過程中，篩選出能夠高效降解原油中烷烴的菌株是該技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵。目前，研究重點(diǎn)大多放在單一菌種降解烷烴并提高原油流動(dòng)性方面，對(duì)復(fù)配菌提高原油流動(dòng)性方面的研究不夠成熟。本文利用微生物之間產(chǎn)生的協(xié)同效應(yīng)，對(duì)兩株實(shí)驗(yàn)室已有菌種枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞桿菌進(jìn)行混合培養(yǎng)。結(jié)果表明，復(fù)配菌對(duì)改善含蠟原油流動(dòng)性、提高管輸效率、保障含蠟原油管道輸送安全等方面具有較好的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 菌種來源、實(shí)驗(yàn)油樣、試劑及儀器

1.1.1 菌種來源 以石蠟為唯一碳源，從大慶油田受石油長(zhǎng)期污染的土壤中篩選出枯草芽孢桿菌6#（菌株6#）及銅綠假單胞菌3#（菌株3#）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)油樣 實(shí)驗(yàn)油樣采自大慶油田，37 ℃下原油的黏度為1 267 mPa·s，油樣中蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.45%。

1.1.3 試劑 K2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、NaCl、(NH4)2SO4、脲素、NaNO3、MnSO4、ZnSO4、CuSO4·5H2O、CoCl2、H3BO4、NaMoO4，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于等于99.0%；液體石蠟（分析純，其相對(duì)密度為0.830～0.860）、FeSO4·xH2O（Fe 質(zhì) 量 分 數(shù) 為21.0%～23.0%）、CaCl2·H2O（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于96.0%），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.4 儀器 LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；HZQ-C 空氣浴振蕩器，哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；BHC-1300IIA/B2 型生物潔凈安全柜，上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；UV-2550 紫外分光光度計(jì)，上?？坪銓?shí)業(yè)發(fā)展有限公司；H3-20K 臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南可成儀器設(shè)備有限公司；LORTEX-5 渦旋振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；JJ2000B 旋轉(zhuǎn)滴界面張力測(cè)量?jī)x，上海中晨數(shù)字設(shè)備有限公司；Q2000 DSC 差示量熱掃描儀，美國(guó)TA 公司；BX-51 偏光顯微鏡，日本奧林巴斯有限公司；HAKKE 流變儀，上海珩璟科技有限公司；JJ124BF 高精度電子分析天平，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；LGR201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，鄭州世聯(lián)良工儀器設(shè)備有限責(zé)任公司。

1.2 菌株復(fù)配條件的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

（1）研究菌株的最佳復(fù)配比。將產(chǎn)表面活性劑菌株——菌株6#與除蠟菌株——菌株3#按3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2、1∶3 的體積比復(fù)配，以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于100 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，通過紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為600 nm 的條件下測(cè)定菌液光密度（OD 值），并根據(jù)菌液光密度判定最佳混合比例。

（2）研究菌種最佳生長(zhǎng)溫度。將菌液以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，在31、34、37、40、43 ℃的條件下振蕩培養(yǎng)。

（3）研究菌種的pH 適應(yīng)范圍。用NaOH 和HCl調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基的pH（4～9）。

（4）測(cè)定礦化度適應(yīng)范圍。用NaCl 配置Na＋質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、1%、2%、3%、4%的5 個(gè)梯度的無機(jī)鹽培養(yǎng)基。

1.3 排油圈實(shí)驗(yàn)

取一個(gè)直徑為15 cm 的無菌潔凈平板，向平板中倒入80 mL 的無菌純水，再向平板中加入1 mL 經(jīng)油紅染色的液體石蠟，液體石蠟在水面上形成一層薄油膜[11]。將菌株發(fā)酵液用高速離心機(jī)離心去除菌體，取0.1 mL 無細(xì)胞上清液滴入油膜中心，觀察油紅的擴(kuò)散現(xiàn)象。

1.4 乳化實(shí)驗(yàn)

將2 mL 液體石蠟與等量的無細(xì)胞上清液加入到離心管中，高速渦旋2 min，并使其在室溫下靜置24 h。，測(cè)量乳化層高度及油層總高度，乳化層高度及油層總高度取3 組實(shí)驗(yàn)的平均值，根據(jù)式（1）計(jì)算乳化指數(shù)[12]。

式中，E24為乳化指數(shù)，%；Eh為乳化層高度，cm；Th為油層總高度，cm。

1.5 發(fā)酵液表面張力的測(cè)定

將發(fā)酵培養(yǎng)7 d 后的菌株發(fā)酵液用高速離心機(jī)離心去除菌體，得到無細(xì)胞上清液，通過界面張力儀測(cè)定不同菌株發(fā)酵液的表面張力。進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，表面張力取3 組實(shí)驗(yàn)的平均值。

1.6 菌株降解性能的測(cè)定

將體積分?jǐn)?shù)為5%的發(fā)酵液注入含12 g 蠟質(zhì)原油的200 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，同時(shí)增設(shè)無菌對(duì)照組，在37 ℃的溫度下震蕩培養(yǎng)7 d。7 d 后，添加50 mL 正己烷回收殘余原油。重復(fù)萃取3 次，混合萃取液?；旌弦河脽o水硫酸鈉脫水4 h[13]。然后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在40 ℃蒸發(fā)。殘余物質(zhì)量采用高精度電子分析天平稱重。通過式（2）計(jì)算生物降解率[14]。進(jìn)行3 組平行實(shí)驗(yàn)，原油的初始質(zhì)量、殘留原油的質(zhì)量及對(duì)照組原油的蒸發(fā)和自然降解質(zhì)量取平均值。

式中，Mx為原油的初始質(zhì)量，g；My為殘留原油的質(zhì)量，g；Me為對(duì)照組原油蒸發(fā)和自然降解質(zhì)量，g。

1.7 菌株對(duì)含蠟原油蠟晶形態(tài)的影響

在37 ℃、200 倍放大倍數(shù)下，使用偏光顯微鏡觀察經(jīng)菌株處理后的蠟晶結(jié)構(gòu)變化。

1.8 菌株對(duì)含蠟原油蠟組分的影響

經(jīng)復(fù)配菌處理前后原油中蠟組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、析蠟點(diǎn)和析蠟高峰點(diǎn)，使用DSC 進(jìn)行測(cè)定。根據(jù)式（3）計(jì)算原油蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)[15]。

式中，Tc為樣品DSC 曲線偏離基線溫度，℃；dQ 為在［－20，Tc］的時(shí)間段蠟晶放出的熱量，J/g；Q 為蠟晶平均釋放熱量，本文取210 J/g。

1.9 菌株對(duì)含蠟原油表觀黏度的影響

將12 g 大慶含蠟原油加入菌液體積分?jǐn)?shù)為5%的200 mL 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，同時(shí)增設(shè)無菌對(duì)照組，在37 ℃的溫度下震蕩培養(yǎng)。7 d 后，通過HAAKE流變儀分別測(cè)定經(jīng)菌株6#、菌株3#和復(fù)配菌株處理前后的原油黏度。

2 結(jié)果分析

2.1 菌株最佳生長(zhǎng)條件

單一菌株及復(fù)配菌株的生長(zhǎng)特性曲線如圖1 所示。由圖1 可知，菌株6#與菌株3#的復(fù)配體積比為3∶1、2∶1、3∶2、1∶1、2∶3 時(shí)，復(fù)配菌株活性隨著菌株3#在復(fù)配菌中所占份額的增加而升高，而且在菌株6#與菌株3#的復(fù)配體積比為2∶3 時(shí)，復(fù)配菌株活性最高；菌株6#與菌株3#的復(fù)配體積比為1∶2、1∶3 時(shí)，復(fù)配菌株活性隨著菌株3#在復(fù)配菌株中所占份額的增加而下降；在菌株6#與菌株3#的復(fù)配體積比為1∶3時(shí)，復(fù)配菌活性低于單一菌株6#和菌株3#。為保證得到最佳作用效果，菌株6#與菌株3#的最佳復(fù)配體積比為2∶3。

溫度通過細(xì)胞中生物酶的活性影響細(xì)菌的生長(zhǎng)，只有適合的溫度才能使菌種具有最佳的生長(zhǎng)活性[16]。不同溫度下復(fù)配菌株的生長(zhǎng)特性曲線如圖2 所示。由圖2 可知，當(dāng)溫度為31～37 ℃時(shí)，復(fù)配菌株的生長(zhǎng)速度和活性與溫度呈線性關(guān)系。但是，當(dāng)溫度過高時(shí)，菌株活性發(fā)生劇烈波動(dòng)，當(dāng)溫度為43 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)遭到嚴(yán)重抑制。對(duì)比分析該復(fù)配菌株在不同溫度下的生長(zhǎng)特性曲線發(fā)現(xiàn)，該混合菌株在37 ℃的溫度下活性最高，因此選擇37 ℃為最佳培養(yǎng)溫度。

pH 影響細(xì)胞膜通透性和蛋白活性，進(jìn)而影響菌株的生長(zhǎng)和代謝[17]。不同pH 下復(fù)配菌株的生長(zhǎng)特性曲線如圖3 所示。

由圖3 可知，在pH 為4～7 時(shí)，隨著pH 的增加，復(fù)配菌株的生長(zhǎng)速度加快，活性提高；當(dāng)pH 為7 時(shí)，該復(fù)配菌株活性達(dá)到最大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與S.Yan 等[18]的研究結(jié)果相同。繼續(xù)提高培養(yǎng)基的pH，菌株活性波動(dòng)劇烈，當(dāng)培養(yǎng)基的pH 為9 時(shí)，菌株生長(zhǎng)明顯遭到抑制。因此，培養(yǎng)基的最佳pH 為7。

礦化度即Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響細(xì)菌細(xì)胞的滲透壓，從而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)[19]。不同Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)下復(fù)配菌株生長(zhǎng)特性曲線見圖4。由圖4 可以看出，Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)菌株活性高，當(dāng)培養(yǎng)基Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%時(shí)，菌株活性明顯遭到抑制。對(duì)比分析該復(fù)配菌株在不同Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)下的生長(zhǎng)曲線發(fā)現(xiàn)，該復(fù)配菌株的最佳Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。

2.2 排油圈實(shí)驗(yàn)

微生物在利用烴類物質(zhì)生長(zhǎng)代謝時(shí)會(huì)產(chǎn)生生物表面活性劑，這種表面活性劑分子集親水基團(tuán)與親油基團(tuán)為一體，在具有親水性的同時(shí)也具有疏水性[20]。排油圈法可以對(duì)生物表面活性劑進(jìn)行定性分析[21]。菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的生物表面活性劑的濃度與排油圈直徑呈正相關(guān)[22]。排油圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可以看出，菌株6#的排油圈直徑明顯小于復(fù)配菌株的排油圈直徑。這是因?yàn)榫?#與菌株6#混合后，菌株3#可以將長(zhǎng)鏈烴有效地降解為短鏈烴，短鏈烴相較于長(zhǎng)鏈烴更容易被利用。因此，菌株6#可以更好地利用培養(yǎng)基中的短鏈烷烴產(chǎn)生生物表面活性劑。

2.3 乳化指數(shù)（E24）與表面張力（ST）的測(cè)定

乳化指數(shù)與菌株產(chǎn)生的生物表面活性劑的乳化特性密切相關(guān)，乳化指數(shù)越高，其乳化能力越強(qiáng)[23]。菌株乳化指數(shù)和表面張力的評(píng)價(jià)效果見表1。

表1 菌株乳化指數(shù)和表面張力的評(píng)價(jià)效果

由表1 可知，復(fù)配菌株對(duì)液體石蠟的乳化效果最明顯，乳化指數(shù)達(dá)到（55.39±0.13）%；菌株6#的乳化指數(shù)為（37.38±0.08）%，明顯低于復(fù)配菌株的乳化指數(shù)，菌株3#的乳化指數(shù)極低，只有（3.75±0.13）%。對(duì)比分析可以看出，菌株6#與菌株3#復(fù)配可以更好地乳化不溶性烴類底物。菌株3#將難以利用的長(zhǎng)鏈烴降解為短鏈，菌株6#進(jìn)一步利用短鏈烴，產(chǎn)生大量的生物表面活性劑。表面活性物質(zhì)可以乳化原油，提高烴類的溶解度，間接地提高了生物利用率，使菌株3#可以更好地利用烷烴[24]。

表面活性物質(zhì)不僅可以乳化原油，也可以降低原油的表面張力[25]。表面張力的降低有助于油水兩相的混合，提高微生物對(duì)石蠟的降解率。原油中含蠟量降低，使原油黏度降低，提高含蠟原油流動(dòng)性，進(jìn)而提高原油管輸效率。接種復(fù)配菌株的培養(yǎng)基表面張力的降低幅度明顯高于單菌，表面張力降低到（38.83±0.07）mN/m，降 低 了（41.06±0.18）mN/m。這一現(xiàn)象更加充分地證明了菌株6#和菌株3#之間具有協(xié)同促進(jìn)作用，印證了乳化活性和排油圈試驗(yàn)結(jié)果。

2.4 復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油的降解作用

菌株對(duì)含蠟原油的生物降解效果見表2。由表2 可以看出，菌株6#、菌株3#和復(fù)配菌株均能夠降解含蠟原油。其中，復(fù)配菌株降解7 d 后的殘余原油質(zhì)量明顯小于初始量，經(jīng)計(jì)算得到復(fù)配菌株的生物降解率為（52.66±0.13）%。該結(jié)果表明，復(fù)配菌株可以更好地利用含蠟原油中的烴類，將其降解為低分子化合物，并且部分烴類被完全降解為水和二氧化碳[26]，其結(jié)果可以顯著降低原油黏度。

表2 菌株對(duì)含蠟原油的生物降解效果

2.5 復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油除蠟作用分析

菌株對(duì)析蠟點(diǎn)、析蠟高峰點(diǎn)、蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)和除蠟率的影響見表3。由表3 可知，菌株3#和復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油的除蠟率分別為43.28%和51.64%；經(jīng)菌株3#處理后，含蠟原油的析蠟點(diǎn)為46.47 ℃，析蠟高峰點(diǎn)為24.34 ℃；經(jīng)復(fù)配菌株處理后，含蠟原油析蠟點(diǎn)為44.98 ℃，析蠟高峰點(diǎn)為22.47 ℃。這一結(jié)果說明，與菌株3#相比，復(fù)配菌株能更顯著地改變含蠟原油中蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)、析蠟點(diǎn)和析蠟高峰點(diǎn)。降低原油的蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)，可以減少蠟沉積，析蠟點(diǎn)及析蠟高峰點(diǎn)的降低有利于抑制蠟晶組分的析出，達(dá)到清防蠟的目的，進(jìn)而降低原油黏度，提高含蠟原油的流動(dòng)性。這一結(jié)果從宏觀上表明復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油的除蠟作用更為明顯。

表3 菌株對(duì)析蠟點(diǎn)、析蠟高峰點(diǎn)、蠟質(zhì)量分?jǐn)?shù)和除蠟率的影響

2.6 復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油蠟晶形態(tài)的影響

菌株處理前后的蠟晶結(jié)構(gòu)如圖6 所示。從圖6可以看出，未經(jīng)復(fù)配菌株處理的含蠟原油中蠟晶直徑大，且呈塊狀聚集，分布密集，同時(shí)小粒徑蠟晶有向大塊蠟晶聚集的趨勢(shì)；經(jīng)復(fù)配菌株處理后，含蠟原油中的蠟晶分布由密集變?yōu)橄∈瑁灳е睆矫黠@變小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與羅超等[27]的研究結(jié)果相同。含蠟原油中的蠟晶經(jīng)復(fù)配菌株降解后，其結(jié)構(gòu)形態(tài)以及分布均發(fā)生了變化，在一定程度上可抑制蠟沉積現(xiàn)象，有助于降低原油黏度，提高含蠟原油的流動(dòng)性。

2.7 復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油表觀黏度的影響

在含蠟原油的管輸過程中，黏度是決定原油輸送難易程度的一個(gè)重要指標(biāo)[28]。菌株處理前后含蠟原油的表觀黏度變化曲線如圖7 所示。

由圖7 可知，復(fù)配菌株對(duì)含蠟原油表觀黏度的影響明顯大于菌株6#和菌株3#。經(jīng)計(jì)算可知，在37 ℃的條件下，經(jīng)菌株6#和菌株3#處理的含蠟原油表觀黏度的降低率分別為42.20%和14.74%；經(jīng)復(fù)配菌株處理的含蠟原油表觀黏度的降低率為64.72%。該結(jié)果優(yōu)于王衛(wèi)強(qiáng)等[29]的纖維微菌屬與假單孢菌的復(fù)配菌株對(duì)原油的降黏效果。其原因是：①?gòu)?fù)配菌株將含蠟原油中的高分子量烷烴降解為更易被微生物利用的低分子量烷烴，使含蠟原油黏度降低[30-32]；②復(fù)配菌株降解烴類產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物可以增溶或乳化原油，降低油水界面張力，進(jìn)一步提高不溶性烴類的利用率，改善原油流動(dòng)性[33]；③微生物在降解過程中產(chǎn)生的大量的酸、醇等有機(jī)溶劑，也有助于降低原油黏度，進(jìn)一步改善原油流動(dòng)性。

3 結(jié) 論

對(duì)從大慶石油污土中篩選出的菌株6#（產(chǎn)表面活性劑菌種）和菌株3#（嗜蠟菌）進(jìn)行復(fù)配，優(yōu)化得出其最佳復(fù)配體積比為2∶3，最佳培養(yǎng)溫度為37 ℃，最佳培養(yǎng)pH=7，最佳培養(yǎng)Na+質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%；對(duì)液體石蠟的乳化效果高達(dá)55.39%，液體石蠟培養(yǎng)基的表面張力從（79.89±0.11）mN/m 降低至（38.83±0.07）mN/m；將復(fù)配菌株以體積分?jǐn)?shù)5%的接種量與含蠟原油作用7 d，7 d 后測(cè)得含蠟原油表觀黏度降低了64.72%，原油含蠟量降低了51.64%，原油的生物降解率為(52.66±0.13)%。與單一菌株相比，復(fù)配菌株在含蠟原油除蠟降黏和提高原油流動(dòng)性能方面更具優(yōu)勢(shì),因此未來應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注多菌種的復(fù)配問題，探尋更為有效的微生物復(fù)配菌株。