項濤 陳彪 馬文擎 翁艷潔

人工流產(chǎn)是暫無生育要求但意外懷孕女性的唯一補救措施，近年來，其發(fā)生率一直呈增加趨勢[1]。臨床上人工終止妊娠方法有手術(shù)流產(chǎn)和藥物流產(chǎn)兩種，其中，藥物流產(chǎn)較手術(shù)流產(chǎn)使用方便、痛苦小，被廣大婦女接受[2]。然而，盡管臨床醫(yī)學(xué)技術(shù)在不斷進步，藥物流產(chǎn)的安全性與有效性也更有保障，但其弊端及不足仍存在。研究表明，藥物流產(chǎn)可能出現(xiàn)出血量大、出血時間長等副作用，進而可引發(fā)子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎等多種疾病，嚴(yán)重可導(dǎo)致不孕[3-4]。雌激素、孕激素、催乳素等是維持女性正常內(nèi)分泌的重要激素，分別通過與靶細(xì)胞上的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)、催乳素受體(prolactin receptor，PRLR)結(jié)合發(fā)揮作用，其分泌紊亂會引發(fā)子宮內(nèi)膜的一系列病理變化[5-7]。舒爾經(jīng)膠囊具有疏肝活血、調(diào)經(jīng)止痛的功效，常用于痛經(jīng)、月經(jīng)量少、后錯屬氣滯血瘀證者，近年來發(fā)現(xiàn)，其在流產(chǎn)術(shù)后子宮內(nèi)膜修復(fù)上具有一定療效[8]。本研究將通過研究舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織ER、PR、PRLR表達及內(nèi)膜病理形態(tài)的影響，以期為減少藥物流產(chǎn)副作用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠50只，雄性大鼠25只，健康性成熟且未生育，體質(zhì)量(200±5)g，許可證號：SYXK(魯)2017-0030，購于山東新創(chuàng)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

舒爾經(jīng)膠囊(國藥準(zhǔn)字Z20025985)購自海南博大制藥廠；宮血寧(國藥準(zhǔn)字Z20020087)購自云南白藥集團股份有限公司；實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)試劑盒(貨號：K1002S)購自美國Promega公司；ER、PR、PRLR、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH) mRNA引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；雌激素酶聯(lián)免疫(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(貨號：K3829-100)購自美國Biovision公司；孕激素ELISA試劑盒(貨號：CSB-E07282r)購自美國Cusabio公司；催乳素ELISA試劑盒、ER抗體、PR抗體、PRLR抗體、GAPDH抗體(貨號：ab100736、ab3575、ab63605、ab214303、ab181602)購自abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(貨號：0295G-HRP)購自美國santa公司；光學(xué)顯微鏡(型號：SZ51/SZ61)購自日本Olympus/奧林巴斯；熒光定量PCR儀(型號：ABI 7500)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(型號：ChemiDocXRS)購自美國Bio-Rad公司。

1.3 藥物流產(chǎn)大鼠模型制備、分組與給藥

將大鼠于下午5:00按雌雄2∶1合籠交配，次日上午8：00行雌鼠陰道涂片檢查，以檢出精子的當(dāng)天為妊娠第1天。未檢出精子的雌鼠于下午5:00繼續(xù)合籠交配，連續(xù)3天，共獲得妊娠大鼠40只。

將40只妊娠大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組和舒爾經(jīng)膠囊高劑量組，每組8只。模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組和舒爾經(jīng)膠囊高劑量組妊娠大鼠于妊娠第7天上午8：00給予米非司酮16.6 mg/kg灌胃1次，于下午18：00給予米索前列醇100 μg/kg灌胃1次，制作大鼠藥物流產(chǎn)模型。

造模成功后次日，空白對照組、模型組給予生理鹽水，陽性對照組給予宮血寧10 mg/kg，舒爾經(jīng)膠囊低、高劑量組分別給予舒爾經(jīng)膠囊190 mg/kg、330 mg/kg，每天給藥1次，給藥體積均為1.0 mL/100 g體重，連續(xù)7天。

1.4 標(biāo)本采集

各組大鼠給藥結(jié)束后24小時內(nèi)，給予7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，將大鼠處死，分離大鼠子宮。

1.5 蘇木素-伊紅(hematoxylin-Eosin，HE)染色觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化

子宮組織經(jīng)10%福爾馬林溶液固定、常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察子宮內(nèi)膜組織病理學(xué)變化。子宮所有形態(tài)改變根據(jù)以下評分標(biāo)準(zhǔn)進行評分：①0分：胚囊完整，絨毛與蛻膜殘留多；②1分：胚囊排出，無絨毛殘留，較多蛻膜組織殘留；③2分：胚囊排出，無絨毛殘留，少量蛻膜組織殘留或子宮內(nèi)膜修復(fù)不好；④3分：胚囊排出，無絨毛殘留，無蛻膜組織殘留，子宮內(nèi)膜未較好修復(fù)；⑤4分：胚囊排出，無絨毛殘留，無蛻膜組織殘留，子宮內(nèi)膜較好修復(fù)。

1.6 ELISA法檢測血清雌激素、孕激素、催乳素水平

將腹主動脈血4℃ 3000 r/min，離心10分鐘，取上層血清。ELISA法檢測血清雌激素、孕激素、催乳素水平，試驗方法均按照試劑盒說明書進行，酶標(biāo)儀測定波長450 nm處吸光度值，計算血清雌激素、孕激素、催乳素水平。

1.7 qRT-PCR法檢測子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平

使用TRIzol試劑提取各組子宮組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用qRT-PCR法檢測ER、PR、PRLR mRNA表達水平，內(nèi)參基因為GAPDH。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10分鐘；95℃變性10秒，55℃退火35秒，72℃延伸1分鐘，循環(huán)40次；72℃延伸10分鐘。ER上游引物：5′-CCACCAACCAGTGCACCATT-3′，下游引物：5′-GGTCTTTTCGTATCCCACCTTTC-3′；PR上游引物：5′-TCGTACAAGCATGTCAGTGGACAC-3′，下游引物：5′-CATGGTAAGGCACAGCGAGTACAA-3′；PRLR上游引物：5′-CCAGATGGAAGTGTACTGCTTGGTA-3′，下游引物：5′-GGTGGAATCCTGGGACAGATC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-CCACTTGAAGGGTGGAGC-3′，下游引物：5′-TGAAGTCGCAGGAGACAA-3′。Ct值為擴增產(chǎn)物的熒光信號達到臨界閾值時對應(yīng)的循環(huán)數(shù)，相對表達量以2-ΔΔCt法表示。

1.8 蛋白印跡(western blot，WB)法檢測子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平

使用蛋白提取試劑盒提取各組子宮組織中總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度并進行定量。電泳分離等量蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉1小時，分別加入ER抗體、PR抗體、PRLR抗體、GAPDH抗體(1∶500)，4℃孵育過夜，TBST洗滌后加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)，室溫孵育1小時，免疫反應(yīng)化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon 600圖像分析系統(tǒng)拍攝圖像并分析條帶灰度，目的蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮內(nèi)膜病理形態(tài)的影響

空白對照組子宮內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞排列緊密，血管和腺體清晰可見。模型組子宮內(nèi)膜嚴(yán)重受損，腺體和血管稀少，子宮內(nèi)膜變薄明顯。與模型組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組子宮內(nèi)膜的厚度及子宮內(nèi)膜腺體、血管數(shù)量明顯增加，大鼠子宮組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05)；與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組，大鼠子宮組織病理學(xué)評分顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織病理學(xué)評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1、表1。

注： A：空白對照組；B：模型組；C:陽性對照組；D:舒爾經(jīng)膠囊低劑量組；E:舒爾經(jīng)膠囊高劑量組。

表1 各組大鼠子宮組織病理學(xué)評分比較

2.2 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平的影響

與空白對照組相比，模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平顯著升高(P<0.05)；與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平的影響

與空白對照組相比，模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 舒爾經(jīng)膠囊對藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平的影響

與空白對照組相比，模型組、陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；與舒爾經(jīng)膠囊低劑量組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)；陽性對照組與舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖2、表4。

表2 各組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平比較

表3 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR mRNA表達水平比較

表4 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達水平比較

圖2 各組大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR蛋白表達情況

3 討論

數(shù)據(jù)顯示，中國每年人工流產(chǎn)約有1300萬人次，藥物流產(chǎn)約有1000萬人次，位居世界第一，盡管各種避孕方法正在不斷推廣，但人工流產(chǎn)的發(fā)生率仍在不斷增加[9]。手術(shù)流產(chǎn)為機械性操作，對機體損傷大，易導(dǎo)致盆腔炎、月經(jīng)紊亂等并發(fā)癥，恢復(fù)時間長，大多數(shù)女性難以完全接受，而藥物流產(chǎn)通常具有安全、有效、簡便等特點，更易被人接受[10]。然而，藥物流產(chǎn)后流產(chǎn)不全、絨毛蛻膜殘留、子宮收縮乏力及繼發(fā)宮內(nèi)感染會導(dǎo)致月經(jīng)紊亂、貧血、異常子宮出血、盆腔炎、不孕等危害，是藥物流產(chǎn)亟需進一步解決的問題[11]。

舒爾經(jīng)膠囊成分為當(dāng)歸、牡丹皮、赤芍、柴胡、桃仁、陳皮、香附、牛膝、益母草、延胡索、白芍，主要用來治療痛經(jīng)及月經(jīng)量少等癥狀[12]。近年來發(fā)現(xiàn)，舒爾經(jīng)膠囊在治療人工流產(chǎn)并發(fā)癥上具有較好的療效。杜就舊等[13]研究表明，舒爾經(jīng)顆粒聯(lián)合戊酸雌二醇預(yù)防人工流產(chǎn)術(shù)后宮腔粘連的療效優(yōu)于單用戊酸雌二醇。孫川等[8]研究表明，人流術(shù)后采用舒爾經(jīng)顆粒聯(lián)合補佳樂進行治療，可以縮短流產(chǎn)后出血時間及轉(zhuǎn)經(jīng)時間，改善臨床癥狀及體內(nèi)性激素水平，增加子宮內(nèi)膜厚度。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠子宮組織病理學(xué)評分顯著升高，子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜腺體、血管數(shù)量顯著增加，其中膠囊高劑量組大鼠相應(yīng)指標(biāo)與陽性對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明舒爾經(jīng)膠囊可促進胚囊排出，減少絨毛、蛻膜殘留，增加子宮內(nèi)膜厚度及子宮內(nèi)膜腺體，促進血管生成，使子宮內(nèi)膜得到較好地修復(fù)，效果與傳統(tǒng)藥物宮血寧相差不大。

雌激素、孕激素、催乳素是維持女性正常內(nèi)分泌、反映婦科內(nèi)分泌功能的重要激素，在妊娠過程中，正常的雌激素、孕激素、催乳素等激素水平與子宮內(nèi)膜中激素受體結(jié)合，在子宮內(nèi)膜變化中起重要作用[14-16]。Chlebowski等[17]研究表明，孕激素可減輕子宮內(nèi)膜癌風(fēng)險，在絕經(jīng)后婦女中，孕激素聯(lián)合雌激素連續(xù)使用可降低子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率。Mei等[18]研究表明，雌激素可以通過CXCL12/CXCR4生物軸上調(diào)介導(dǎo)的自噬抑制促進人分泌期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的存活。宋秀云等[19]研究表明，對于臨床上選擇藥物流產(chǎn)的患者，為了減輕流產(chǎn)后陰道出血量，可在治療中加用雌激素、孕激素，不僅能提高止血效果，還可減少并發(fā)癥。李福明等[20]研究表明，扶正消癌方聯(lián)合他莫昔芬調(diào)節(jié)血清催乳素、孕酮、雌二醇等性激素水平，可緩解他莫昔芬所致子宮內(nèi)膜增厚。本研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，模型組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宮組織中相應(yīng)受體ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表達水平均顯著降低，提示大鼠藥物流產(chǎn)后子宮內(nèi)膜嚴(yán)重受損，體內(nèi)性激素及相應(yīng)受體表達均受到影響。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，陽性對照組、舒爾經(jīng)膠囊低劑量組、舒爾經(jīng)膠囊高劑量組大鼠血清雌激素、孕激素、催乳素水平及子宮組織中相應(yīng)受體ER、PR、PRLR mRNA和蛋白表達水平均顯著升高，提示舒爾經(jīng)膠囊可提高藥物流產(chǎn)大鼠血清中性激素及子宮內(nèi)膜中相應(yīng)受體水平，進而使嚴(yán)重受損的子宮內(nèi)膜得到修復(fù)。

綜上所述，舒爾經(jīng)膠囊可以提高藥物流產(chǎn)后大鼠子宮組織中ER、PR、PRLR表達水平，促進子宮內(nèi)膜修復(fù)，改善子宮內(nèi)膜形態(tài)，值得進一步進行臨床研究。