靳雙星，楊金佩，王 強(qiáng)，張桂枝

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046；2.河南省家禽疾病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046；3.廣州智龍生物科技有限公司，廣東 廣州 510032)

黃曲霉菌是一種常見腐生真菌，30%～60%的菌株能產(chǎn)生有致癌作用的黃曲霉毒素。近年來我國飼料和飼料原料中黃曲霉菌及其毒素的檢出率較高，超標(biāo)十分嚴(yán)重。郭志青[1]對山東省9個(gè)花生主產(chǎn)區(qū)的土壤、花生莢果及花生仁進(jìn)行采樣檢測，不同產(chǎn)區(qū)土壤、花生莢果中黃曲霉菌的檢出率為7%～18%，花生籽仁中黃曲霉毒素的含量為5.01～26.80 μg/kg。陳麗媛[2]對2018年的玉米、小麥、麩皮等飼料原料樣品進(jìn)行檢測，黃曲霉毒素B1的檢出率為100%，樣本含量平均值為10.01 μg/kg，最高值達(dá)79.55 μg/kg，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過國家規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)。

黃曲霉毒素主要攻擊動(dòng)物的肝臟，降低其免疫能力，使動(dòng)物對病原微生物的易感性增加。飼料防霉劑是一類能降低飼料中霉菌數(shù)量、抑制霉菌毒素產(chǎn)生、防止飼料霉變的飼料添加劑[3]。目前常用的防霉劑主要分為有機(jī)酸防霉劑、有機(jī)酸鹽防霉劑和復(fù)合防霉劑三類[4]。本試驗(yàn)研究雙乙酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀等四種有機(jī)酸鹽防霉劑及其復(fù)配制劑對黃曲霉菌生長的抑制效果，旨在為有機(jī)酸鹽防霉劑在飼料工業(yè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

ATCC28539型黃曲霉菌株購自上海北思生物公司。

1.1.2 藥品

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和RPMI1640培養(yǎng)基購自南京建成生物工程研究所。雙乙酸鈉(含量不低于99%)、丙酸鈣(含量不低于98%)、丁酸鈉(含量不低于98%)和山梨酸鉀(含量不低于98%)均購自河南省萬家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)中心有限公司。

1.1.3 主要儀器

FA2204N型分析天平、DH6000II型電熱恒溫培養(yǎng)箱、YXQ-LS-100型高壓滅菌鍋、SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)、WYS-03B型雙目生物顯微鏡等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

取黃曲霉菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，加活化液體培養(yǎng)基500 μL，搖晃溶解后用接種環(huán)挑取菌液，劃線接種于PDA平皿上，28 ℃ 培養(yǎng)3～4 d。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，在平板上劃線培養(yǎng)，2～3 d以后在培養(yǎng)基中加入適量RPMI1640培養(yǎng)液進(jìn)行沖洗，用移液槍吹打使黃曲霉菌的孢子懸浮于培養(yǎng)液中。

1.2.2 孢子計(jì)數(shù)和試驗(yàn)菌液的配制

收集黃曲霉菌孢子溶液，8 000 r/min離心5 min，用無菌紗布過濾3次除去菌絲，備用。吸取黃曲霉菌孢子菌液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，然后加入適量RPMI1640培養(yǎng)液，調(diào)整菌液濃度為1×103～5×103cfu/mL，置 4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 有機(jī)酸鹽防霉劑的配制

用電子天平稱取適量的雙乙酸鈉、丙酸鈣、山梨酸鉀和丁酸鈉，用滅菌的蒸餾水配制成質(zhì)量濃度均為128 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后分裝于滅菌小瓶中，置4 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration, MIC)的測定

參照美國臨床標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)提出的絲狀真菌藥物敏感試驗(yàn)方案[5]，采用二倍逐級稀釋法測定4種有機(jī)酸鹽防霉劑對黃曲霉菌的MIC，以無培養(yǎng)物生長的最低藥物質(zhì)量濃度為MIC，每種防霉劑試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)。

1.2.5 最小殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration, MBC)和殺菌率測定

從每個(gè)試驗(yàn)孔中取出培養(yǎng)液100 μL，加入PDA培養(yǎng)基中，采用滅菌的涂布棒涂布均勻。將平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察并記錄數(shù)據(jù)。以平板上沒有菌落生長的最小藥物質(zhì)量濃度為MBC，有菌落生長的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算殺菌率。殺菌率=(陽性對照組菌落數(shù)-試驗(yàn)組菌落數(shù))/陽性對照組菌落數(shù)×100%。

1.2.6 聯(lián)合抑菌試驗(yàn)

選取抑菌效果最好的一種防霉劑(雙乙酸鈉)，與其他3種防霉劑按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例復(fù)配，測定每種復(fù)配制劑的MIC，操作方法同1.2.4，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均數(shù)。計(jì)算聯(lián)合抑菌指數(shù)即分級抑菌指數(shù)(Fractional inhibitory concentration, FIC)。FIC= A藥聯(lián)合時(shí)MIC/A藥單獨(dú)用藥 MIC+B 藥聯(lián)合時(shí) MIC/B 藥單獨(dú)用藥 MIC。FIC≤0.5為協(xié)同作用，0.52 為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 MIC測定結(jié)果

4種有機(jī)酸鹽防霉劑對黃曲霉菌的體外生長均有抑制作用，雙乙酸鈉和丁酸鈉的MIC均為32.00 mg/mL，丙酸鈣和山梨酸鉀的MIC均為64.00 mg/mL。

2.2 MBC和殺菌率

四種有機(jī)酸鹽防霉劑對黃曲霉菌的殺菌率見表1。由表1可知，有機(jī)酸鹽防霉劑對黃曲霉菌的殺菌效果隨質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。四種有機(jī)酸鹽中以雙乙酸鈉對黃曲霉菌的殺菌效果最佳，其MBC為32 mg/mL，當(dāng)雙乙酸鈉的質(zhì)量濃度為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL和2 mg/mL時(shí)，其對黃曲霉菌的殺菌率分別為98.6%、95.0%、92.1%和80%。丁酸鈉對黃曲霉菌的殺菌效果次之，其MBC為32 mg/mL，當(dāng)丁酸鈉的質(zhì)量濃度為16 mg/mL、8 mg/mL、4 mg/mL和2 mg/mL時(shí)，其對黃曲霉菌的殺菌率分別為91.2%、84.4%、72.0%和54.1%。丙酸鈣的MBC為64 mg/mL，當(dāng)丙酸鈣的質(zhì)量濃度為32 mg/mL、16 mg/mL、8 mg/mL和4 mg/mL時(shí)，對黃曲霉菌的殺菌率分別為93.0%、90.0%、66.7%和42.6%。山梨酸鉀對黃曲霉菌的殺菌效果最差，其MBC為128 mg/mL，當(dāng)山利酸鉀的質(zhì)量濃度為64 mg/mL、32 mg/mL、16 mg/mL和8 mg/mL時(shí)，對黃曲霉菌的殺菌率分別為99.9%、90.0%、66.7%和42.0%。

表1 4種防霉劑對黃曲霉菌的殺菌率

2.3 雙乙酸鈉與丁酸鈉復(fù)配聯(lián)合抑菌效果

雙乙酸鈉與丁酸鈉按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例復(fù)配，混合液的MIC和FIC見表2。由表2可知，在雙乙酸鈉與丁酸鈉的9種配比混合液中，除1：4配比混合液的MIC為16 mg/mL外，其余8種配比混合液的MIC≤8 mg/mL，顯著低于雙乙酸鈉單用(32 mg/mL)和丁酸鈉單用(32 mg/mL)的MIC。FIC值均小于或等于0.5，說明兩種有機(jī)酸鹽復(fù)配對黃曲霉菌的抑制有協(xié)同作用。雙乙酸鈉與丁酸鈉配比為 3：1 和4：1時(shí)混合液的MIC均為4 mg/mL，F(xiàn)IC值為0.125，配比較佳。

表2 雙乙酸鈉與丁酸鈉聯(lián)合對黃曲霉菌的抑制效果

2.4 雙乙酸鈉與丙酸鈣復(fù)配聯(lián)合抑菌效果

雙乙酸鈉與丙酸鈣按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例復(fù)配，混合液MIC和FIC見表3。由表3可知，雙乙酸鈉與丙酸鈣的9種配比混合液的MIC≤32 mg/mL，其中雙乙酸鈉與丙酸鈣配比為3：1和4：1時(shí)，混合液的MIC為8 mg/mL，顯著低于雙乙酸鈉單用(32 mg/mL)和丙酸鈣單用(64 mg/mL)的MIC。雙乙酸鈉與丙酸鈣配比為3：1和4：1時(shí)，F(xiàn)IC值分別為 0.219 和0.225，均小于0.5，說明雙乙酸鈉與丙酸鈣復(fù)配對黃曲霉菌的抑制有協(xié)同作用，配比較佳。

表3 雙乙酸鈉與丙酸鈣聯(lián)合對黃曲霉菌的抑制效果

2.5 雙乙酸鈉與山梨酸鉀復(fù)配聯(lián)合抑菌效果

雙乙酸鈉與山梨酸鉀按照4：1、3：1、2：1、3：2、1：1、2：3、1：2、1：3和1：4的比例復(fù)配，混合液MIC和FIC見表4。由表4可知，雙乙酸鈉與山梨酸鉀的9種配比混合液的MIC均遠(yuǎn)小于雙乙酸鈉單用(32 mg/mL)和山梨酸鉀單用(64 mg/mL)的MIC。FIC值均小于0.5，說明雙乙酸鈉與山梨酸鉀復(fù)配對黃曲霉菌的抑制有協(xié)同作用。雙乙酸鈉與山梨酸鉀配比為2：1時(shí)，F(xiàn)IC值只有0.026，混合液MIC為1 mg/mL，配比最佳。

表5 雙乙酸鈉與山梨酸鉀聯(lián)合對黃曲霉菌的抑制效果

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，雙乙酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀等四種有機(jī)酸防霉劑對黃曲霉菌的生長均有抑制作用，抑菌效果隨著防霉劑質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，達(dá)到一定的質(zhì)量濃度后有完全的殺菌作用，其中以雙乙酸鈉的抑制效果最佳，其次是丁酸鈉。

楊曉麗等[6]報(bào)道雙乙酸鈉對黑曲霉、黑根霉、黃曲霉和黃青霉的抑制效果優(yōu)于山梨酸鉀，雙乙酸鈉對黑根霉的防霉效果比對黃青霉和黃曲霉的防霉效果好。葛明蘭等[7]報(bào)道雙乙酸鈉和苯甲酸均對黃曲霉菌有抑制作用，雙乙酸鈉的抑菌效果優(yōu)于苯甲酸。張錚等[8]比較了丙酸鈣、檸檬酸、雙乙酸鈉和山梨酸鉀對非密封狀態(tài)下乳酸菌發(fā)酵飼料的防霉效果，發(fā)現(xiàn)雙乙酸鈉和丙酸鈣的抑菌效果優(yōu)于山梨酸鉀和檸檬酸，2%丙酸鈣和0.3%雙乙酸鈉的防霉效果較佳。王子苑等[9]報(bào)道日糧中添加雙乙酸鈉能改善發(fā)酵全混合日糧的品質(zhì)，抑制霉菌的繁殖，減少干物質(zhì)的損失。上述研究證實(shí)，雙乙酸鈉是一種安全、高效的防霉添加劑。雙乙酸鈉作為飼料添加劑，除具有抑菌、防霉作用外，還有提高飼料的蛋白質(zhì)利用率、改善飼料報(bào)酬和促生長等功效。在家禽飼糧中添加雙乙酸鈉能提高雛雞的存活率和蛋雞的產(chǎn)蛋率[10]。在肉鴨飼糧中添加雙乙酸鈉能促進(jìn)肉鴨生長，提高飼料轉(zhuǎn)化率和經(jīng)濟(jì)效益[11]。在斷奶仔豬飼糧中添加雙乙酸鈉能促進(jìn)腸道健康，提高養(yǎng)分消化率、日增重和胴體瘦肉率[12]。

丁酸鈉的抑制效果僅次于雙乙酸鈉。王曼曼等[13]報(bào)道丁酸鈉不是通過改變菌體pH值來抑制細(xì)菌增長，而是通過自身的溶解發(fā)揮抑菌作用。丁酸鈉作為飼料添加劑，除具有抑菌、防霉作用外，還具有維持腸道平衡、改善小腸形態(tài)、促進(jìn)小腸吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等功能。丁酸鈉作為短鏈脂肪酸可以為腸道提供部分能量，當(dāng)畜禽因應(yīng)激發(fā)生腸道損傷時(shí)，丁酸鈉有助于恢復(fù)腸道的健康。在日糧中添加一定量的丁酸鈉可以增加腸道內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量，從而增強(qiáng)腸道免疫反應(yīng)[14]。

雙乙酸鈉與其他3種防霉劑按照不同比例復(fù)配，以雙乙酸鈉與山梨酸鉀復(fù)配效果最佳。雙乙酸鈉與山梨酸鉀配比為2：1時(shí)，混合液的MIC為1 mg/mL，F(xiàn)IC值為0.026；雙乙酸鈉與丁酸鈉配比為3：1和4：1時(shí)，混合液的MIC均為4 mg/mL，F(xiàn)IC值為0.125；雙乙酸鈉與丙酸鈣配比為3：1和4：1時(shí)，混合液的MIC均為8 mg/mL，F(xiàn)IC值為0.219和0.225。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，雙乙酸鈉與其他三種防霉劑復(fù)配對黃曲霉菌的抑制作用顯著增強(qiáng)。徐鎧煜等[15]采用抑菌圈法研究了復(fù)配型防霉劑對十種糧食霉菌的抑制效果，發(fā)現(xiàn)雙乙酸鈉與山梨酸鉀的復(fù)配效果明顯優(yōu)于雙乙酸納與丙酸鈣的復(fù)配效果，相比于雙乙酸鈉、山梨酸鉀和丙酸鈣單獨(dú)使用，雙乙酸鈉與山梨酸鉀復(fù)配也有明顯的增效作用，這與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。

4 結(jié)論

雙乙酸鈉、丁酸鈉、丙酸鈣和山梨酸鉀等四種防霉劑對黃曲霉菌的體外生長均有一定的抑制作用，以雙乙酸鈉對黃曲霉菌的抑菌效果最強(qiáng)，防霉劑對黃曲霉菌的抑制效果隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)。雙乙酸鈉與其他三種藥物復(fù)配后對黃曲霉菌的抑制均有顯著的協(xié)同作用，以雙乙酸鈉與山梨酸鉀按照2：1比例復(fù)配效果最佳。