范致星，黃從新

1武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢 430060;2武漢大學(xué)心血管病研究所;3心血管病湖北省重點實驗室

竇房結(jié)(SAN)作為心臟的生理起搏點，可參與調(diào)控不同生理狀態(tài)下的心臟節(jié)律。隨著人口老齡化，竇房結(jié)退行性變的發(fā)生率逐漸上升，其功能改變所引起的頭暈、黑朦、乏力、甚至猝死，被稱為病態(tài)竇房結(jié)綜合征(SSS)[1]。心臟電子起搏器在世界范圍內(nèi)已經(jīng)得到了廣泛的使用，可明顯改善SSS患者的生活質(zhì)量。然而，電子起搏器仍有較多的缺陷和局限，如需永久性植入導(dǎo)管、電池壽命較短、不受神經(jīng)體液因素調(diào)控等[2]。于是構(gòu)建一種“生物起搏器”顯得至關(guān)重要。生物起搏是指運用各種方法(如基因工程)構(gòu)建一個與竇房結(jié)功能類似的起搏點，在機體正常起搏系統(tǒng)出現(xiàn)異常時發(fā)揮替代作用[3]。近年來，生物起搏器構(gòu)建相關(guān)研究多集中在誘導(dǎo)干細(xì)胞的定向分化或調(diào)控下游的離子通道，雖然取得一定的效果，但仍存在許多不足[4]。轉(zhuǎn)錄因子胰島素基因增強子結(jié)合蛋白1(ISL-1)是SAN發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子，其在SAN的形成和發(fā)育中起著重要的作用，過表達(dá)ISL-1有助于起搏樣細(xì)胞的形成[5]?，F(xiàn)就ISL-1的生物學(xué)特性及其在竇房結(jié)發(fā)育、生物起搏中的作用研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 ISL-1的生物學(xué)特性

ISL-1于1990年由Karlsson教授等[6]首次報道。人類ISL-1基因全長約11 kb，定位在5號染色體的長臂，含6個外顯子。ISL-1蛋白屬于LIM同源框蛋白家族，總共含349個氨基酸。ISL-1轉(zhuǎn)錄因子由三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，包括一個同源結(jié)構(gòu)域和兩個相互串聯(lián)的LIM結(jié)構(gòu)域。LIM結(jié)構(gòu)域高度保守，主要含有組氨酸及半胱氨酸，這種結(jié)構(gòu)域可通過形成鋅指結(jié)構(gòu)而介導(dǎo)蛋白與蛋白間的作用[7]。ISL-1的同源結(jié)構(gòu)域為螺旋結(jié)構(gòu)，該種結(jié)構(gòu)有利于其與靶基因的ATTA或TAAT元件偶聯(lián)，從而介導(dǎo)蛋白與基因間的作用[6,7]。

目前已有研究證實，ISL-1可作為第二生心區(qū)(SHF)心臟前體細(xì)胞的分子標(biāo)志[8]。Pandur等[9]發(fā)現(xiàn)，ISL-1基因敲除小鼠在鼠胚第9.5天停止心臟發(fā)育或心臟出現(xiàn)嚴(yán)重畸形，不能成袢；進(jìn)一步采用原位雜交法發(fā)現(xiàn)，ISL-1基因敲除小鼠左室雖然不受影響，但表現(xiàn)為單個心房或心室，同時伴右室及流出道缺如。Mommersteeg等[10]通過譜系示蹤分析法研究ISL-1在小鼠胚胎發(fā)育第7.25～10天時的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ISL-1在新月形生心區(qū)的腹側(cè)和背側(cè)處表達(dá)較高，當(dāng)線性心管形成后，臟壁中胚層和前腸內(nèi)胚層中逐漸出現(xiàn)ISL-1陽性細(xì)胞，在小鼠胚胎發(fā)育到第10天時，依然能在臟壁及腹側(cè)中胚層檢測到ISL-1，然而在心肌成熟后卻不能檢測到ISL-1的表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，在小鼠胚胎發(fā)育到第8.5天時，ISL-1陽性前體細(xì)胞遷移到心臟，在右室流出道及右心房、右心室表達(dá)，但在其他部位未檢測到；隨著心臟逐漸發(fā)育，右房ISL-1表達(dá)明顯升高，最后僅局限于右房的起搏區(qū)域；在胚胎發(fā)育到第14.5天時，ISL-1在心臟神經(jīng)節(jié)區(qū)域、SAN和房室結(jié)(AVN)區(qū)域、房間隔、部分流出道、右室、主動脈、肺動脈、靜脈瓣等部位持續(xù)表達(dá)；在小鼠出生后第3天，ISL-1仍可在主動脈/肺動脈基部、竇房結(jié)及房室結(jié)區(qū)域表達(dá)，但I(xiàn)SL-1表達(dá)區(qū)域明顯縮小[10]。ISL-1持續(xù)在SAN及AVN區(qū)域表達(dá)提示起搏細(xì)胞有可能來源于SHF。同時研究還發(fā)現(xiàn)，ISL-1與起搏細(xì)胞標(biāo)志超極化激活環(huán)核苷酸門控通道4(HCN4)在部分區(qū)域可同時表達(dá)，這說明ISL-1與HCN4的表達(dá)可能密切相關(guān)[10]。另一研究中研究人員將ISL-1與不同細(xì)胞系的細(xì)胞表面分子標(biāo)志物進(jìn)行共染色，發(fā)現(xiàn)SAN及AVN區(qū)域有一群ISL-1陽性前體細(xì)胞并無特定細(xì)胞系相關(guān)的分子標(biāo)志物，且隨著胚胎發(fā)育，其細(xì)胞數(shù)量明顯減少[11]。這提示ISL-1陽性前體細(xì)胞具備分化為其他不同細(xì)胞系的潛能。Weinberger等[12]發(fā)現(xiàn)，人類胚胎期的ISL-1也高表達(dá)于右房及流出道等SHF結(jié)構(gòu)區(qū)，這與小鼠相似，還發(fā)現(xiàn)ISL-1也可表達(dá)于正常成年小鼠心臟中，但主要在上腔靜脈與右房交匯處、肺靜脈及房間隔周圍、大血管壁內(nèi)。更有趣的是，上腔靜脈與右房交匯處的ISL-1陽性前體細(xì)胞高表達(dá)HCN4，這說明ISL-1同樣是成熟SAN的標(biāo)志。

2 ISL-1在SAN發(fā)育中的作用

SAN是一個高度專業(yè)化的結(jié)構(gòu)，位于上腔靜脈與右心房交界處的界溝上1/3的心外膜深面[13]。SAN起搏細(xì)胞通過細(xì)胞膜上的多種離子電流(膜時鐘)和細(xì)胞內(nèi)的鈣循環(huán)(鈣時鐘)相互影響導(dǎo)致起搏活動的產(chǎn)生[14～16]。調(diào)控SAN發(fā)育的分子信號網(wǎng)絡(luò)十分復(fù)雜，涉及多種轉(zhuǎn)錄因子的多重調(diào)控和相互作用，不同的轉(zhuǎn)錄因子在SAN及周圍心房工作心肌中呈現(xiàn)出特定的表達(dá)模式，在細(xì)胞的特異性和分化過程中起著關(guān)鍵的作用[17,18]。近年相關(guān)研究證實，ISL-1可作為SAN起搏細(xì)胞的標(biāo)志，參與SAN的發(fā)育及功能調(diào)控。Tessadori等[19]首先證實了ISL-1可調(diào)控斑馬魚SAN的發(fā)育及功能。Vedantham等[20]同樣證實，ISL-1作為與發(fā)育相關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，可從上游調(diào)控多種轉(zhuǎn)錄因子及離子通道的表達(dá)而參與小鼠SAN的發(fā)育。后續(xù)的研究進(jìn)一步證實，ISL-1在哺乳動物SAN胚胎期發(fā)育過程中也發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，ISL-1可作為SAN起搏細(xì)胞的標(biāo)志[20]。研究者采用激光捕獲顯微切割技術(shù)分離純化得到了小鼠SAN中的起搏細(xì)胞并完成測序，發(fā)現(xiàn)基因敲除ISL-1后，在SAN中表達(dá)豐富的T-box轉(zhuǎn)錄因子家族3(Tbx3)、HCN4等基因的表達(dá)明顯降低，而右房心肌表達(dá)豐富相關(guān)的基因出現(xiàn)了顯著的上調(diào)[20]。這提示ISL-1作為轉(zhuǎn)錄因子，參與對SAN相關(guān)基因的直接調(diào)控。Liang等[5]通過ISL-1基因敲除小鼠實驗，證實了ISL-1作為轉(zhuǎn)錄因子，參與了SAN的胚胎發(fā)育，對SAN起搏細(xì)胞的存活及功能至關(guān)重要。染色質(zhì)免疫沉淀反應(yīng)證實，L型鈣通道、ANK2及Tbx3等多種竇房結(jié)起搏功能必需的基因中存在ISL-1的結(jié)合位點，受到ISL-1調(diào)控的SAN特異表達(dá)的基因達(dá)到40%[5]。SAN是哺乳動物自發(fā)電活動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，ISL-1是SAN起搏細(xì)胞的標(biāo)志，對其發(fā)育和功能起到重要作用。因此，在生物起搏領(lǐng)域，轉(zhuǎn)錄因子ISL-1受到越來越多的重視，成為研究熱點。

3 ISL-1在生物起搏中的作用

生物起搏是運用分子生物學(xué)及其相關(guān)技術(shù)，對受損的自律性節(jié)律點或特殊傳導(dǎo)系統(tǒng)的組織進(jìn)行修復(fù)和替代，使心臟的傳導(dǎo)或起搏功能得以恢復(fù)。因此，獲得有效的起搏樣細(xì)胞是最終實現(xiàn)生物起搏的前提。近年研究證實，ISL-1陽性前體細(xì)胞可能具有多向分化潛能，過表達(dá)ISL-1有助于起搏樣細(xì)胞的形成。Laugwitz等[21]發(fā)現(xiàn)，將ISL-1陽性前體細(xì)胞與心臟間充質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)一段時間后，ISL-1陽性細(xì)胞不僅可以維持未分化狀態(tài)而且能實現(xiàn)自我更新；將ISL-1陽性細(xì)胞與已經(jīng)分化成熟的心肌細(xì)胞共培養(yǎng)，這些ISL-1陽性細(xì)胞能夠分化為心肌樣細(xì)胞。Moretti等[22]及Bu等[23]同樣發(fā)現(xiàn)，在不同的誘導(dǎo)條件下，ISL-1陽性細(xì)胞可分化形成不同的心臟細(xì)胞系。隨后，F(xiàn)onoudi等[24]在胚胎干細(xì)胞中過表達(dá)ISL-1，證實過表達(dá)ISL-1可促進(jìn)人胚胎干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化。這些研究均提示ISL-1可作為將特定類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為心肌樣細(xì)胞或者起搏樣細(xì)胞的有效轉(zhuǎn)錄因子，可能是研發(fā)緩慢性心律失常生物起搏器的關(guān)鍵靶點。Zhang等[25]通過基因轉(zhuǎn)染方式在脂肪干細(xì)胞(ADSCs)中過表達(dá)ISL-1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISL-1在ADSCs中高表達(dá)后，HCN4、Cx45 和 Tbx3等竇房結(jié)特異性基因在ADSCs中的表達(dá)明顯上調(diào)，而Nkx2.5等工作心肌特異性基因表達(dá)顯著下調(diào)，且可記錄到超極化激活的起搏電流(If)。這項研究結(jié)果表明經(jīng)ISL-1基因修飾的ADSCs產(chǎn)生了一定的高表達(dá)竇房結(jié)標(biāo)志性基因并具有細(xì)胞內(nèi)典型超極化電活動的起搏樣細(xì)胞。與此同時，Zhang等[26]通過基因轉(zhuǎn)染的方式將ISL-1和Tbx18兩者一并整合至乳鼠心室肌細(xì)胞(NRVM)的基因組中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ISL-1組、Tbx18組和ISL-1+Tbx18組NRVM搏動頻率均有明顯提升，各組均可檢測到HCN4的表達(dá)，但I(xiàn)SL-1+Tbx18組HCN4表達(dá)水平最高，搏動頻率提升最為明顯，且ISL-1+Tbx18聯(lián)合表達(dá)的大多數(shù)NRVM能記錄到If電流。此項實驗表明，ISL-1+Tbx18共表達(dá)能更明顯的提高HCN4的表達(dá)水平，促進(jìn)NRVM向竇房結(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，實現(xiàn)起搏樣細(xì)胞的重編程。綜合上述兩項最新研究結(jié)果我們可以看到，轉(zhuǎn)錄因子ISL-1能在特定條件下，將脂肪干細(xì)胞或已經(jīng)成熟的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)為起搏樣細(xì)胞。但一種轉(zhuǎn)錄因子作用往往有限，同時聯(lián)合多種轉(zhuǎn)錄因子可能更有利于實現(xiàn)起搏樣細(xì)胞的重編程，多種轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合作用將是后續(xù)研究生物起搏新的突破點。

與此同時，我們還需認(rèn)識到ISL-1構(gòu)建生物起搏器可能存在的不足。ISL-1作為胚胎性基因，在人類發(fā)育過程中，ISL-1只在特定的組織或器官中表達(dá)，例如胰腺和大腦。在成年后的組織或器官中高表達(dá)ISL-1，將抑制抑癌基因p14ARF等細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的自我更新，最終導(dǎo)致淋巴瘤、胃癌和膀胱癌等多種腫瘤的發(fā)生[27,28]。此外，ISL-1通過調(diào)節(jié)心臟的起搏及傳導(dǎo)，相關(guān)基因還可導(dǎo)致新的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)疾病及心律失常[29]?？傊琁SL-1的生物安全性還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，ISL-1作為一種與發(fā)育調(diào)控有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子，其在促進(jìn)竇房結(jié)發(fā)育及維持竇房結(jié)起搏功能中扮演了重要的角色。ADSCs等種子細(xì)胞過表達(dá)ISL-1后可通過上調(diào)Tbx3、HCN4等SAN特異性基因，同時下調(diào)Nkx2.5等工作心肌特異性基因而使細(xì)胞形成If，最終分化為起搏樣細(xì)胞。鑒于ISL-1可參與對SAN特異性相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控，未來可將ISL-1作為生物起搏研究的重要誘導(dǎo)因子并深入探討其相應(yīng)機制。但截止目前，由于生物起搏涉及的調(diào)控機制極其精確且復(fù)雜，該領(lǐng)域的研究還僅僅是在實驗的初期，ISL-1構(gòu)建生物起搏器的穩(wěn)定性、持久性及生物安全性問題仍需更進(jìn)一步研究。