田康永，楊呂清，胡慧慧，張海德*

（海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 海口 570228）

木瓜蛋白酶（EC 3.4.22.2）存在于番木瓜乳膠中，是由212 個(gè)氨基酸殘基組成的含巰基的肽鏈內(nèi)切酶。木瓜蛋白酶的肽鏈之間形成3 個(gè)二硫鍵，肽鏈折疊成兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，一個(gè)結(jié)構(gòu)域主要由α-螺旋結(jié)構(gòu)在空間內(nèi)卷曲折疊而成，另一個(gè)則由β-折疊和部分α-螺旋構(gòu)成。木瓜蛋白酶的活性中心位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域間的第25位半胱氨酸殘基和第158位組氨酸殘基所在的凹槽內(nèi)[1]，分子質(zhì)量為21 kDa，具有凝結(jié)牛奶、水解脂肪、溶解細(xì)菌，以及其他作用[2]。因此，木瓜蛋白酶可用于許多領(lǐng)域，例如食品、醫(yī)藥、皮革、飼料、化妝品、紡織和制藥工業(yè)[3-5]。離子液體作為非常規(guī)溶劑已廣泛用于各種液相萃取模式中，因其固有的離子特性和顯著的性質(zhì)（例如可忽略不計(jì)的蒸氣壓、無效可燃性、高離子傳導(dǎo)性、以及高熱和電化學(xué)穩(wěn)定性），所以成為“綠色溶劑”的重要一類[6-7]。

雙水相體系指一些具有親水性質(zhì)的高分子聚合物與聚合物，或聚合物與無機(jī)鹽溶解在水中，當(dāng)濃度超過一定界限時(shí)，能自然地分成互不相溶的兩相或多相體系，其原理主要是聚合物的不相容性，雙水相體系主要是在水環(huán)境中產(chǎn)生的[8]。離子液體雙水相基于離子液體的各種優(yōu)點(diǎn)，將離子液體應(yīng)用到體系的某一水相中，運(yùn)用離子液體與無機(jī)鹽競爭水分子使目標(biāo)物質(zhì)有選擇性地富集在離子液體相或鹽相[9]。離子液體雙水相溶液酸度范圍較寬、不易乳化、界面更清晰、黏度小、不需要揮發(fā)性有機(jī)溶劑、生物相容性好、離子液體經(jīng)簡單處理可重復(fù)再利用[10]，因此該技術(shù)在木瓜蛋白酶的制備中占有一席之地。

本課題組長期致力于離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的研究。曾穎等[11]運(yùn)用1-辛基-3-甲基咪唑醋酸鹽（[C8mim]Ac）與磷酸氫二鉀（K2HPO4）雙水相體系萃取木瓜蛋白酶，得到酶分配系數(shù)高達(dá)11.52，酶活力回收率為86.81%。蔡濤等[12]運(yùn)用1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽（[C4mim]BF4）與磷酸氫鈉（NaH2PO4）雙水相萃取木瓜蛋白酶，得到酶分配系數(shù)為4.77，酶活力回收率達(dá)97.45%。Zhu Xinyun等[13]運(yùn)用1-丁基氯化吡啶（[C4Py]Cl）與磷酸氫二鉀（K2HPO4）雙水相萃取木瓜蛋白酶，酶活力回收率達(dá)96.03%，分配系數(shù)為4.57。離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶取得了較好的成果，但相關(guān)的理論研究較少，本研究利用熒光光譜與分子對接分析[C4mim]BF4、[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶之間的相互作用，以期為離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木瓜蛋白酶、牛血清白蛋白（均為生物純） 生工生物工程（上海）股份有限公司；K2HPO4（分析純）西隴科學(xué)（廣東）股份有限公司；[C4Py]Cl、[C4mim]BF4（均為分析純） 美國ALFA試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1901紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；F-7000分子熒光光譜儀 日本日立公司；DK-98-1型恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；FA2104電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 熒光光譜法分析相互作用

根據(jù)Li Xiangrong[14]和Xiao Huizhi[15]等探究分子間相互作用的方法，于一系列10 mL比色管中添加1 mL 6×10-5mol/L的木瓜蛋白酶儲備液，分別加入0.08、0.4、0.8、1.6、2、4 mL 5×10-4mol/L [C4Py]Cl和[C4mim]BF4儲備液，用水定容至10 mL，分別在25、30、35 ℃下恒溫水浴10 min后放入1.0 cm石英池中。

發(fā)射熒光光譜條件：激發(fā)波長280 nm、掃描波長范圍280～450 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度2.5 nm。

1.3.2 熒光猝滅計(jì)算

采用Stern-Volmer方程（公式（1））計(jì)算猝滅常數(shù)（Kq），判斷熒光猝滅類型；使用雙對數(shù)方程（公式（2））計(jì)算相互作用過程的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n）；使用Van’t Hoff方程（公式（3））計(jì)算反應(yīng)的焓變（ΔH）和熵變（ΔS）；使用吉布斯自由能方程（公式（4））計(jì)算各溫度下反應(yīng)的吉布斯自由能（ΔG）[16]。

式中：F0為無猝滅劑時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度/au；F為有猝滅劑時(shí)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度/au；τ0為無猝滅劑時(shí)熒光分子壽命/s：Kq為猝滅常數(shù)/（mol·s）；[Q]為猝滅劑濃度/（mol/L）。n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；Ka為反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；ΔH為反應(yīng)的焓變/（kJ/mol）；ΔS為反應(yīng)的熵變/（J/（mol·K））；R為氣體摩爾常數(shù)（8.314 J/（mol·K））；ΔG為反應(yīng)的吉布斯自由能/（kJ/mol）；T為熱力學(xué)溫度/K。

1.3.3 分子對接探究對接結(jié)構(gòu)

運(yùn)用AutoDock軟件研究離子液體與木瓜蛋白酶的結(jié)合模式。離子液體的mol文件預(yù)先下載自Chemical Book數(shù)據(jù)庫（www.chemicalbook.com，CAS號為1124-64-7，174501-65-6）用Discovery Studio 軟件轉(zhuǎn)變?yōu)镻DB格式，并只保留陽離子部分。木瓜蛋白酶的晶體結(jié)構(gòu)下載自RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/，PDB編號1PPD），刪除水分子和非必需子結(jié)構(gòu)，通過末端處理、加氫、加電荷等步驟完成受體結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備，采用半柔性對接法，其余參數(shù)默認(rèn)。對接后，選取打分函數(shù)最高的結(jié)果作為研究對象[17]。

1.3.4 相同條件下不同離子液體雙水相體系分配系數(shù)的測定

構(gòu)建[C4mim]BF4-K2HPO4、[C4Py]Cl-K2HPO4雙水相體系：固定K2HPO4添加量為0.35 g/mL、酶添加量為2.17 mg/mL、溫度30 ℃，離子液體質(zhì)量濃度分別為0.20、0.24、0.28、0.32、0.36 g/mL，用水定容至10 mL。振蕩混勻后以5 000 r/min離心10 min，讀取上下相的體積，測定上下相的蛋白酶質(zhì)量濃度，分配系數(shù)（K）的計(jì)算公式如（5）所示。

式中：ρT和ρB分別為雙水相體系中上、下相的蛋白酶的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 木瓜蛋白酶蛋白質(zhì)量濃度的測定

用Bradford法來測定蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度[18]。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品配制系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL，取考馬斯亮藍(lán)G-250染色液5.0 mL，反應(yīng)10 min左右，在595 nm波長處測定吸光度。以蛋白質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝0.013 6＋0.004 5x，R2＝0.998 1。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

對每個(gè)添加不同體積離子液體溶液的樣本測定3 次，使用SPSS軟件的Duncan’s法對結(jié)果的方差顯著性進(jìn)行分析[19]，采用不同小寫英文字母表示不同數(shù)據(jù)之間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析結(jié)果

熒光光譜法是在接近實(shí)際萃取環(huán)境下研究活性小分子與酶間相互作用應(yīng)用最廣泛的方法，其基于小分子引起的酶蛋白內(nèi)源熒光光譜變化來獲得二者的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)等信息[20-21]。由圖1可知，隨著離子液體溶液添加量的增加，木瓜蛋白酶的熒光強(qiáng)度呈規(guī)律性降低，表明二者發(fā)生了相互作用。采用Stern-Volmer方程（公式（1））分析不同溫度下的熒光光譜最大吸收波長（表1），獲得相應(yīng)的猝滅常數(shù)（表2）。不同溫度下的猝滅常數(shù)（Kq）均大于生物大分子動(dòng)態(tài)熒光猝滅的最大常數(shù)2×1010L/（mol·s），表明離子液體通過與木瓜蛋白酶結(jié)合成復(fù)合物，引發(fā)了酶蛋白的靜態(tài)熒光猝滅[22]。

圖1 離子液體在不同溫度下對木瓜蛋白酶熒光光譜的影響Fig.1 Effect of ionic liquids on the fluorescence spectra of papain at different temperatures

表1 離子液體在不同溫度下木瓜蛋白酶熒光光譜最大吸收波長處熒光強(qiáng)度Table 1 Fluorescence intensity at maximum absorption wavelength of papain fluorescence spectrum of ionic liquid at different temperatures

表2 離子液體與木瓜蛋白酶間的熒光猝滅常數(shù)Table 2 Fluorescence quenching constants between ionic liquids and papain

對于靜態(tài)熒光猝滅過程，可以使用雙對數(shù)方程（公式（2））計(jì)算離子液體與木瓜蛋白酶相互作用過程的結(jié)合常數(shù)（Ka）和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（n），相關(guān)結(jié)果見表3。

表3 離子液體與木瓜蛋白酶間的結(jié)合參數(shù)Table 3 Binding parameters between ionic liquids and papain

由表3可知，隨著溫度的升高，離子液體與木瓜蛋白酶的結(jié)合常數(shù)明顯上升，而其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)則略有增加，都趨近于1附近，因?yàn)閮煞N離子液體的猝滅常數(shù)并未遠(yuǎn)大于動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，所以推測猝滅過程含有部分動(dòng)態(tài)猝滅的特性，適當(dāng)升溫不僅可以加速二者在溶液中的運(yùn)動(dòng)速率，提高結(jié)合效果，還可令木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)更加伸展，暴露更多的結(jié)合位點(diǎn)[19]。為了理解離子液體與木瓜蛋白酶的結(jié)合過程，利用van’t Hoff方程（公式（3））和吉布斯自由能方程（公式（4））獲得了二者互作的熱力學(xué)參數(shù)（表4）。

表4 離子液體與木瓜蛋白酶間的熱力學(xué)參數(shù)Table 4 Thermodynamic parameters for interaction between ionic liquids and papain

離子液體與木瓜蛋白酶相互作用的ΔG為負(fù)值，表明離子液體與木瓜蛋白酶的結(jié)合是一個(gè)自發(fā)的過程，而ΔH和ΔS為正值，根據(jù)Ross等總結(jié)的藥物小分子與蛋白質(zhì)大分子之間結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)參數(shù)數(shù)值正負(fù)性與作用力類型的關(guān)系[23]，二者的結(jié)合過程是一個(gè)以熵驅(qū)動(dòng)為主的自發(fā)進(jìn)行的過程，受疏水作用力驅(qū)動(dòng)，這可能由于[C4mim]BF4和[C4Py]Cl在結(jié)構(gòu)上具有一個(gè)疏水性的五元環(huán)和六元環(huán)[24]，因而在與酶的疏水口袋結(jié)合過程中，疏水力發(fā)揮了主要作用。

2.2 木瓜蛋白酶與離子液體的分子對接分析結(jié)果

離子液體與酶的互作涉及復(fù)雜的結(jié)構(gòu)改變，目前多種實(shí)驗(yàn)手段可用于此類研究，如光譜法（包括紫外光譜、熒光光譜、紅外光譜、拉曼光譜、圓二色光譜等）、平衡透析、電泳及色譜等方法，還有新出現(xiàn)的等溫滴定量熱、核磁共振、表面等離子共振等方法[25]。但上述方法復(fù)雜的條件參數(shù)給研究帶來了極大困難，近年來，分子模擬方法成為互作研究的重要工具。分子對接已被用于研究多種小分子與酶蛋白的結(jié)合機(jī)制[26]。由于離子液體本身極化程度非常高，能被很清晰地分成陽離子部分和陰離子部分，因此無法在AutoDock軟件中將其設(shè)置為單一小分子進(jìn)行對接[27]?？紤]到離子液體與蛋白酶結(jié)合主要為陽離子在蛋白質(zhì)表面聚集來影響蛋白酶的結(jié)構(gòu)與活性的[28]，所以在對接過程中使用離子液體的陽離子部分進(jìn)行對接研究。

表5 離子液體與木瓜蛋白酶分子對接的對接參數(shù)Table 5 Molecular docking parameters for interaction between ionic liquid and papain

圖2 離子液體與木瓜蛋白酶分子對接結(jié)果Fig.2 Molecular docking results of ionic liquid and papain

離子液體與木瓜蛋白酶的分子對接，選取結(jié)合能最低的對接構(gòu)像為最優(yōu)構(gòu)像，從軟件AutoDock Tools中獲取離子液體與酶作用的模擬對接參數(shù)（表5）。由表5可知，離子液體的陽離子與木瓜蛋白酶的結(jié)合ΔG均小于0，且[C4Py]Cl的ΔG小于[C4mim]BF4，由此說明離子液體小分子與木瓜蛋白酶的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的，[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶的結(jié)合優(yōu)于[C4mim]BF4。通過軟件分析可知，離子液體與木瓜蛋白酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)如圖2所示，只存在一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，其位于木瓜蛋白酶結(jié)構(gòu)域中間活性部位的凹槽內(nèi)，通過對木瓜蛋白酶表面作疏水性分析，離子液體完全處于木瓜蛋白酶的疏水性凹槽內(nèi)，由此可以得出離子液體與木瓜蛋白酶之間存在較強(qiáng)的疏水相互作用，同時(shí)通過軟件分析發(fā)現(xiàn)還存在范德華力和π-π相互作用。分子對接的結(jié)果與熒光光譜的結(jié)果相一致，同時(shí)也證明熒光光譜結(jié)果的正確性。

2.3 相同條件下不同離子液體雙水相體系分配系數(shù)的測定分析結(jié)果

圖3 不同離子液體雙水相萃取木瓜蛋白酶的分配系數(shù)Fig.3 Partition coefficients of papain in aqueous two-phase extraction systems with different ionic liquids

為了驗(yàn)證熒光光譜與分子對接結(jié)果在實(shí)際提取中的正確性，分別用兩種離子液體構(gòu)建雙水相萃取體系，兩個(gè)體系均在相同的條件下進(jìn)行且構(gòu)成體系的其他成分均相同，離子液體相均在雙水相的上相，所以離子液體與木瓜蛋白酶的相互作用強(qiáng)度不同是木瓜蛋白酶分配系數(shù)不同的主要因素。如圖3所示，所有的分配系數(shù)均為正值，表明木瓜蛋白酶主要富集于離子液體相，隨著離子液體濃度的增加，兩個(gè)體系的分配系數(shù)K均呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，原因是適當(dāng)加大離子液體質(zhì)量濃度可以使相比例增大，因此K增大；繼續(xù)增大離子液體質(zhì)量濃度，使得體系黏度增加，阻止了兩相分子間的轉(zhuǎn)移，在兩相之間形成乳化層，使下相的酶滯留在兩相之間，酶的分配系數(shù)反而降低[29]。另一方面離子液體質(zhì)量濃度過高使離子液體產(chǎn)生擁擠，對蛋白質(zhì)的折疊和穩(wěn)定性有很大影響，擁擠會(huì)使不穩(wěn)定的蛋白構(gòu)象更不穩(wěn)定，并有助于形成致密結(jié)構(gòu)使蛋白的活性降低甚至失活[28]，所以離子液體質(zhì)量濃度過高時(shí)分配系數(shù)K反而會(huì)降低。但是在相同離子液體質(zhì)量濃度下，[C4mim]BF4-K2HPO4體系的分配系數(shù)K均小于[C4Py]Cl-K2HPO4體系，從結(jié)果可以直接得出[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶的結(jié)合能力優(yōu)于[C4mim]BF4，由此證明熒光光譜和分子對接的結(jié)果是可以預(yù)測離子液體實(shí)際的萃取效果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過熒光光譜法得到兩種離子液體的猝滅機(jī)制均為靜態(tài)熒光猝滅且都有輕微動(dòng)態(tài)熒光猝滅的特性，與木瓜蛋白酶結(jié)合生成復(fù)合物，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，通過ΔG的計(jì)算得出[C4Py]Cl的ΔG低于[C4mim]BF4，說明[C4Py]Cl與木瓜蛋白酶的結(jié)合能力優(yōu)于[C4mim]BF4。分子對接分析結(jié)果表明，離子液體位于木瓜蛋白酶中間活性區(qū)域的疏水口袋中，只有1 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并與周圍眾多的氨基酸殘基存在疏水作用、范德華力和π-π相互作用等非共價(jià)鍵力，從模擬的角度驗(yàn)證了熒光光譜結(jié)果的正確性。離子液體雙水相體系分配系數(shù)測定結(jié)果表明，離子液體與木瓜蛋白酶結(jié)合力的強(qiáng)弱會(huì)影響離子液體雙水相實(shí)際萃取木瓜蛋白酶的效果，且與熒光猝滅所得的結(jié)果相同。本研究補(bǔ)充了[C4Py]Cl和[C4mim]BF4離子液體雙水相體系萃取木瓜蛋白酶的理論依據(jù)，為構(gòu)建新離子液體萃取體系提供了參考。