邸 娜 鄭 娜 韓海軍 王 靖 崔 超 鄭喜清

（1河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，015000，內(nèi)蒙古巴彥淖爾；2內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院，010018，內(nèi)蒙古呼和浩特；3巴彥淖爾市農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心，015000，內(nèi)蒙古巴彥淖爾）

向日葵列當(dāng)（Orobanche cumanaWallr.）是列當(dāng)科列當(dāng)屬的一年生全寄生草本植物[1]，其莖直立，單生，肉質(zhì)，黃褐色至褐色，無葉綠素，沒有真正的根，以短須狀的假根侵入寄主植物根部，完全依靠吸收寄主的養(yǎng)分和水分生存生長[2-3]。向日葵列當(dāng)寄主范圍廣泛，可寄生于向日葵、番茄、煙草和瓜類等農(nóng)作物，其中向日葵是其主要的寄主植物[4-5]。

向日葵是我國主要的油料作物，內(nèi)蒙古是我國最大的向日葵生產(chǎn)區(qū)。調(diào)查顯示，向日葵列當(dāng)在內(nèi)蒙古各地發(fā)生面積逐年擴(kuò)大，危害程度日益加重，僅2012年巴彥淖爾市向日葵列當(dāng)發(fā)生面積就超過1.33萬hm2，部分向日葵列當(dāng)平均寄生率達(dá)72%以上，導(dǎo)致向日葵減產(chǎn)30%～45%，嚴(yán)重地塊列當(dāng)寄生率達(dá)90%以上[6]，單株向日葵列當(dāng)寄生量最多達(dá)345株[7]。向日葵列當(dāng)已成為制約巴彥淖爾市向日葵產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的最大瓶頸。

目前，關(guān)于向日葵列當(dāng)?shù)姆乐畏椒ㄖ饕性诨瘜W(xué)防治、物理防治、生物防治、誘殺和誘捕作物的應(yīng)用、抗性品種選育等方面，其中抗性品種選育被認(rèn)為是最簡(jiǎn)便易行、經(jīng)濟(jì)有效的方法[8]。利用向日葵列當(dāng)萌發(fā)必須依靠寄主萌發(fā)刺激物誘導(dǎo)的特性，研究不同列當(dāng)抗性的向日葵品種根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)誘導(dǎo)的差異，探究不同向日葵品種對(duì)列當(dāng)抗性差異響應(yīng)的機(jī)制，以期為向日葵列當(dāng)抗性品種的選育和應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

抗列當(dāng)向日葵品種選用TP-3313（來自北京綠冠草業(yè)股份有限責(zé)任公司），耐列當(dāng)向日葵品種選用SH363-M（來自三瑞農(nóng)業(yè)科技股份有限公司），感列當(dāng)向日葵品種選用3638C（來自烏拉特前旗新世種業(yè)有限責(zé)任公司）。向日葵種子均采購于內(nèi)蒙古巴彥淖爾市臨河區(qū)農(nóng)資市場(chǎng)；向日葵列當(dāng)種子于2018年采集于臨河黃河大橋河灘地。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 根系分泌物的收集與提取 采用土培法收集根系分泌物。在塑料花盆中放入田園土，為加固、保護(hù)和方便移動(dòng)，將裝有田園土的塑料花盆置于老式泥瓦花盆中。每個(gè)花盆保留1株向日葵幼苗，置于室外培養(yǎng)，模擬自然生長條件，培養(yǎng)至現(xiàn)蕾期。設(shè)3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20盆。

選取現(xiàn)蕾期長勢(shì)一致的10株向日葵，剪開塑料花盆，小心取出向日葵植株，注意保護(hù)根系，以免根系因受傷發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)而影響根系分泌物的組分和含量；用自來水沖掉泥沙，再采用根系淋溶法用蒸餾水充分淋洗根部，吸干水分，將其浸泡于裝有2L 0.5mmol/L CaCl2溶液的燒杯中，在燒杯基部及杯口用黑色卡紙進(jìn)行遮光處理，置于光照充足的條件下培養(yǎng)4h[9]，即得到向日葵根系分泌物粗提液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將根系分泌物粗提液濃縮至約1L，用二氯甲烷萃取，過濾后的萃取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，定容至25mL，即為向日葵根系分泌物原液。

1.2.2 向日葵列當(dāng)種子的表面消毒 過篩處理向日葵列當(dāng)種子，去掉灰塵和雜質(zhì)，然后裝入茶袋，置于70%乙醇中浸泡30～60s，在2% Tween-20和2%NaClO（1∶1）混合液中浸泡10min，期間用玻璃棒不斷攪拌，用無菌水沖洗6～8次，用無菌濾紙吸干水分，置于超凈工作臺(tái)晾干備用。

1.2.3 向日葵列當(dāng)種子的預(yù)培養(yǎng) 取經(jīng)滅菌的直徑5cm的培養(yǎng)皿，放入2層無菌濾紙，加入25mg/L赤霉素溶液1.5mL，均勻放置8～10個(gè)直徑5mm的無菌玻璃纖維濾紙小圓片，用接種針蘸取少量向日葵列當(dāng)種子，均勻涂在玻璃纖維濾紙小圓片上，每片60～90粒種子，加蓋并用Para film封口膜封口，置于25℃培養(yǎng)箱中，黑暗條件下倒置培養(yǎng)7d。

1.2.4 向日葵列當(dāng)種子的培養(yǎng) 將預(yù)培養(yǎng)后的向日葵列當(dāng)種子（小圓片）置于無菌濾紙上，吸掉多余的預(yù)培養(yǎng)液。取直徑為5cm的無菌培養(yǎng)皿，放入2層無菌濾紙，將上述小圓片均勻放入其中，加入20μL萌發(fā)刺激物，待二氯甲烷揮發(fā)后，加入1.5mL蒸餾水，用Para film封口膜封口，將其置于25℃培養(yǎng)箱黑暗條件下倒置培養(yǎng)10d。以蒸餾水為陰性對(duì)照（CK1），以脫氫木香內(nèi)酯（1×10-4mg/mL）為陽性對(duì)照（CK2），每個(gè)處理重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)向日葵列當(dāng)種子的萌發(fā)率。

1.2.5 根系分泌物處理 以蒸餾水為陰性對(duì)照（CK1），以1×10-4mg/mL脫氫木香內(nèi)酯為陽性對(duì)照（CK2），以根系分泌物原液（T0）和根系分泌物原液稀釋 20（T20）、50（T50）、75（T75）、100（T100）、150（T150）和200倍（T200）液作為萌發(fā)刺激物。分別選擇列當(dāng)萌發(fā)率最高的3種向日葵根系分泌物稀釋液作為萌發(fā)刺激物。

1.2.6 根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯共同作用 以向日葵根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯混合液作為萌發(fā)刺激物，使培養(yǎng)皿中脫氫木香內(nèi)酯的濃度為1×10-4mg/mL，根系分泌物的濃度為刺激向日葵列當(dāng)萌發(fā)的最有效濃度（以“1.2.5”試驗(yàn)結(jié)果為判斷依據(jù)）。

1.2.7 向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)率的統(tǒng)計(jì) 使用連續(xù)變倍體顯微鏡統(tǒng)計(jì)每個(gè)玻璃纖維濾紙上向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)種子數(shù)及種子總數(shù)，計(jì)算萌發(fā)率，取平均值作為該處理的向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)率。萌發(fā)率（%）=（視野中列當(dāng)萌發(fā)種子數(shù)/視野中列當(dāng)種子總數(shù)）×100。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0進(jìn)行方差分析，Microsoft Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 向日葵根系分泌物稀釋倍數(shù)對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)的影響

分別以TP-3313、SH363-M和3638C的根系分泌物原液及系列稀釋液處理向日葵列當(dāng)種子，其種子萌發(fā)率見表1。陰性對(duì)照CK1向日葵列當(dāng)種子的萌發(fā)率平均僅為4.92%，陽性對(duì)照CK2，即脫氫木香內(nèi)酯處理平均為63.89%，說明向日葵列當(dāng)需在萌發(fā)刺激物的作用下才能萌發(fā)。3個(gè)向日葵品種根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)的影響均表現(xiàn)為隨根系分泌物稀釋倍數(shù)的增加，種子萌發(fā)率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但在各處理?xiàng)l件下，向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)率均小于CK2、大于CK1，說明3個(gè)向日葵品種根系分泌物中均具有促進(jìn)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)，只是促進(jìn)效果不及脫氫木香內(nèi)酯。

表1 不同稀釋倍數(shù)向日葵根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)率的影響Table 1 Effects of dilution multiples of sun flower root exudates on germination rate of sun flower broomrape seeds %

當(dāng)TP-3313和SH363-M根系分泌物稀釋50倍時(shí)，萌發(fā)率均達(dá)到最大，分別為23.00%和27.99%，而3638C根系分泌物稀釋75倍時(shí)，萌發(fā)率達(dá)到最大，為34.59%，均顯著高于根系分泌物原液處理下的萌發(fā)率，說明高濃度的根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)具有一定的抑制作用，且感列當(dāng)向日葵品種根系分泌物中促進(jìn)萌發(fā)的物質(zhì)含量可能相對(duì)較高，因此需要較高的稀釋倍數(shù)才能達(dá)到最大萌發(fā)率。其后，隨根系分泌物稀釋倍數(shù)的增加，各處理向日葵列當(dāng)萌發(fā)率顯著下降，尤其是稀釋200倍時(shí)，萌發(fā)率接近CK1萌發(fā)率，說明隨著稀釋倍數(shù)的增加，根系分泌物中促進(jìn)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)含量顯著降低，其中TP-3313和SH363-M T200處理的萌發(fā)率與CK1無顯著差異，說明稀釋200倍時(shí)，對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)不具有誘導(dǎo)作用；而3638C根系分泌物在稀釋200倍時(shí)，萌發(fā)率雖然也顯著下降，但仍顯著高于CK1，說明感列當(dāng)向日葵根系分泌物稀釋200倍時(shí)仍具有促進(jìn)列當(dāng)萌發(fā)的作用。

2.2 不同列當(dāng)抗性向日葵品種根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)的影響

圖1 不同列當(dāng)抗性向日葵品種根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)的影響Fig.1 Effects of different resistant sun flower root exudates on the germination of sun flower broomrape seeds

分別選擇萌發(fā)率最高的TP-3313和SH363-M根系分泌物50倍液、3638C根系分泌物75倍液作為萌發(fā)刺激物處理向日葵列當(dāng)，以無菌水為陰性對(duì)照CK1，以脫氫木香內(nèi)酯為陽性對(duì)照CK2，比較不同列當(dāng)抗性向日葵根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)刺激效果的差異性。結(jié)果（圖1）顯示，TP-3313、SH363-M和3638C根系分泌物處理的向日葵列當(dāng)萌發(fā)率均小于CK2，大于CK1，說明3個(gè)抗性向日葵品種根系分泌物均具有促進(jìn)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的作用，只是促進(jìn)效果不同。其中，TP-3313處理的萌發(fā)率最低（24.43%），3638C處理的萌發(fā)率最高（36.75%），SH363-M處理的萌發(fā)率居中（29.22%），說明抗列當(dāng)向日葵根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)刺激效果較差，感列當(dāng)向日葵根系分泌物的刺激效果較好，而耐列當(dāng)向日葵根系分泌物的刺激效果居中，這可能是由于不同列當(dāng)抗性向日葵根系分泌物中能夠刺激向日葵列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)含量或種類不同，從而使得向日葵對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)目剐员憩F(xiàn)上存在一定差異。

2.3 不同向日葵品種根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯共同作用對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)的影響

3種不同向日葵根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯共同作用處理向日葵列當(dāng)，進(jìn)一步研究向日葵對(duì)向日葵列當(dāng)抗性差異的機(jī)制，結(jié)果見圖2。脫氫木香內(nèi)酯與TP-3313共同作用時(shí)，萌發(fā)率為52.95%，比TP-3313單獨(dú)作用時(shí)的萌發(fā)率高29.57%，但比CK2萌發(fā)率低12.2%；脫氫木香內(nèi)酯與SH363-M共同作用時(shí)，萌發(fā)率為56.13%，比SH363-M單獨(dú)作用時(shí)的萌發(fā)率高27.38%，比CK2萌發(fā)率低9.02%，說明抗列當(dāng)和耐列當(dāng)向日葵品種根系分泌物中可能含有抑制向日葵列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)；耐列當(dāng)向日葵品種根系分泌物作用下，無論是與脫氫木香內(nèi)酯共同作用還是單獨(dú)作用，其萌發(fā)率都顯著高于抗列當(dāng)向日葵品種根系分泌物，可能是由于耐列當(dāng)向日葵品種根系分泌物中含有能夠抑制向日葵列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)含量低于抗列當(dāng)向日葵品種根系分泌物，或與抗列當(dāng)向日葵品種根系分泌物中抑制列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)組分不同，從而使2個(gè)向日葵品種對(duì)列當(dāng)?shù)目剐员憩F(xiàn)有所差異。3638C根系分泌物單獨(dú)作用及其與脫氫木香內(nèi)酯共同作用處理的萌發(fā)率均顯著高于TP-3313和SH363-M，并且共同作用處理比脫氫木香內(nèi)酯單獨(dú)作用的萌發(fā)率還高5.2%，進(jìn)一步說明感列當(dāng)向日葵的根系分泌物中存在促進(jìn)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)。

圖2 不同向日葵品種根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯共同作用對(duì)向日葵列當(dāng)種子萌發(fā)率的影響Fig.2 The combined effects of the different resistant sun flower root exudates and dehydroxylolactone on germination rate of sun flower broomrape seeds

3 討論

上述試驗(yàn)結(jié)果表明，根系分泌物的稀釋倍數(shù)對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)具有顯著影響，其中TP-3313和SH363-M根系分泌物均在稀釋50倍時(shí)達(dá)到最大萌發(fā)率，而3638C根系分泌物需稀釋75倍時(shí)才能達(dá)到最大萌發(fā)率；不同列當(dāng)抗性的向日葵根系分泌物誘導(dǎo)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的效果不同，向日葵列當(dāng)萌發(fā)率表現(xiàn)為TP-3313＜SH363-M＜3638C；不同列當(dāng)抗性向日葵根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯共同作用時(shí)，TP-3313和SH363-M根系分泌物降低脫氫木香內(nèi)酯對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的促進(jìn)作用，而3638C根系分泌物則增強(qiáng)了脫氫木香內(nèi)酯對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的促進(jìn)作用。

植物根系分泌物的化學(xué)成分復(fù)雜，其中多種成分屬于化感物質(zhì)。寄生植物與寄主間的化感作用與寄主的根系分泌物成分和濃度密切相關(guān)。研究表明，不同植物根系分泌物的成分不同，其化感效應(yīng)不同，且即使是同一植物的根系分泌物，濃度不同化感效應(yīng)也不相同，甚至表現(xiàn)出相反的作用效果[10-11]。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)向日葵品種根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的刺激效果不同，其中TP-3313的刺激效果最差，SH363-M的刺激效果居中，3638C的刺激效果最好，說明3個(gè)向日葵品種對(duì)列當(dāng)?shù)目剐员憩F(xiàn)不同是由于根系分泌物成分或刺激列當(dāng)萌發(fā)的物質(zhì)含量不同造成的；利用根系分泌物原液及系列稀釋液刺激向日葵列當(dāng)萌發(fā)，隨著根系分泌物稀釋倍數(shù)增加，TP-3313、SH363-M和3638C處理下的列當(dāng)萌發(fā)率均表現(xiàn)為先升高后降低的趨勢(shì)，說明根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的刺激效果表現(xiàn)為高抑低促，但濃度過低則不足以刺激向日葵列當(dāng)萌發(fā)，任祥祥[12]和君睿紅等[13]也得到了類似結(jié)論。

向日葵列當(dāng)必須在有萌發(fā)刺激物的作用下才能萌發(fā)，否則即使環(huán)境條件適宜也不會(huì)萌發(fā)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，抗列當(dāng)、耐列當(dāng)和感列當(dāng)向日葵根系分泌物均具有誘導(dǎo)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的作用，其中抗列當(dāng)向日葵的誘導(dǎo)效果最差，感列當(dāng)向日葵的誘導(dǎo)效果最好，耐列當(dāng)向日葵的誘導(dǎo)效果居中，這與三者對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)目剐员憩F(xiàn)一致，說明3種向日葵根系分泌物中均含有向日葵列當(dāng)萌發(fā)的刺激物，但含量有所差異，表現(xiàn)為抗列當(dāng)向日葵最少，感列當(dāng)向日葵最多，耐列當(dāng)向日葵居中，這與任祥祥等[8，12]的研究結(jié)果一致。通過田間抗列當(dāng)品種篩選，TP-3313為向日葵列當(dāng)免疫品種[15-17]，萌發(fā)試驗(yàn)中TP-3313誘導(dǎo)向日葵列當(dāng)萌發(fā)率最高達(dá)24.43%，說明其雖然能夠誘導(dǎo)向日葵列當(dāng)萌發(fā)，但萌發(fā)后的列當(dāng)不能與其建立寄生關(guān)系，推測(cè)可能是由于向日葵列當(dāng)誘導(dǎo)TP-3313根部組織結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使其對(duì)列當(dāng)產(chǎn)生了結(jié)構(gòu)抗性，從而使其在田間栽培過程中表現(xiàn)出對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拿庖咛匦?。Dorr等[18]研究發(fā)現(xiàn)，抗列當(dāng)向日葵可通過根部皮層薄壁細(xì)胞細(xì)胞壁發(fā)生木栓化和木質(zhì)化加厚來阻止列當(dāng)?shù)那秩?；Eizenberg等[19]將列當(dāng)種子分別接種于抗列當(dāng)和感列當(dāng)向日葵品種，發(fā)現(xiàn)列當(dāng)種子都能萌發(fā)，但抗列當(dāng)品種根系形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，列當(dāng)芽管雖接觸到根系，但并不能與之建立寄生關(guān)系。

TP-3313、SH363-M和3638C分別與向日葵列當(dāng)萌發(fā)刺激物脫氫木香內(nèi)酯共同作用于向日葵列當(dāng)，TP-3313和SH363-M的根系分泌物均顯著降低了脫氫木香內(nèi)酯對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)刺激作用，而3638C的根系分泌物卻顯著增強(qiáng)了脫氫木香內(nèi)酯的刺激作用，推測(cè)TP-3313和SH363-M根系分泌物中可能含有某些物質(zhì)，抑制了脫氫木香內(nèi)酯對(duì)列當(dāng)萌發(fā)的刺激作用，或干擾了列當(dāng)種子與脫氫木香內(nèi)酯的相互識(shí)別作用，從而使得列當(dāng)萌發(fā)率下降；而3638C根系分泌物成分可能與脫氫木香內(nèi)酯協(xié)同作用促進(jìn)向日葵列當(dāng)萌發(fā)。

本研究結(jié)果證實(shí)了向日葵對(duì)列當(dāng)?shù)目剐耘c根系分泌物的濃度和成分有關(guān)，但不同列當(dāng)抗性向日葵根系分泌物的成分及含量仍需進(jìn)一步研究；同時(shí)明確了抗列當(dāng)向日葵根系分泌物也含有列當(dāng)萌發(fā)的刺激物，但其田間表現(xiàn)出的列當(dāng)免疫性機(jī)理仍有待于后續(xù)研究。

4 結(jié)論

不同的向日葵根系分泌物稀釋倍數(shù)對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)拿劝l(fā)影響顯著，整體表現(xiàn)為低濃度下促進(jìn)萌發(fā)，高濃度下抑制萌發(fā)，具體表現(xiàn)為TP-3313和SH363-M根系分泌物稀釋50倍時(shí)向日葵列當(dāng)萌發(fā)率達(dá)到最大，而3638C根系分泌物稀釋75倍時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最大?？埂⒏?、耐列當(dāng)?shù)南蛉湛贩N根系分泌物對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的誘導(dǎo)效果不同，向日葵列當(dāng)萌發(fā)率表現(xiàn)為TP-3313＜SH363-M＜3638C；不同列當(dāng)抗性向日葵根系分泌物與脫氫木香內(nèi)酯共同作用于向日葵列當(dāng)，TP-3313和SH363-M根系分泌物降低了脫氫木香內(nèi)酯對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的促進(jìn)作用，而3638C根系分泌物增強(qiáng)了脫氫木香內(nèi)酯對(duì)向日葵列當(dāng)萌發(fā)的促進(jìn)作用。