王娟娟 闕天洋 胡珈瑋 趙雨涵 錢曉晴 張振華

摘要：鐵、錳氧化物可以富集、鈍化重金屬，在一定程度上阻止其進入水稻根系，對于土壤污染修復，降低水稻污染風險有重要的生態(tài)意義。采用改良纖毛菌培養(yǎng)基，單菌落稀釋轉(zhuǎn)接法分離純化鐵錳氧化菌，分析相關菌株的形態(tài)特征，對菌株的16S rRNA基因序列進行測定分析，對其及產(chǎn)物進行電鏡掃描與能譜分析，并分析產(chǎn)物對重金屬鎘的吸附效率。結(jié)果分離得到具有鐵錳氧化功能的菌株5株，形狀為橢球至短桿狀，均為不動桿菌屬（Acinetobacter）。能譜分析表明，除MOB4之外菌株樣品均有明顯Fe和Mn波峰，以及O波峰，推斷有大量鐵錳氧化物存在。液體培養(yǎng)表明，接種菌株可使培養(yǎng)液中的鎘含量下降35.25%，下降率遠高于對照。綜上所述，通過篩選獲得菌株為不動桿菌屬，具有氧化鐵、錳的功能，并可能促進介質(zhì)中氧化鐵的生成，進而提高對介質(zhì)中溶解態(tài)重金屬鎘的吸附。

關鍵詞：水稻田;鐵錳氧化細菌;篩選;鎘吸附;不動桿菌屬

中圖分類號：S182?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）23-0243-06

收稿日期：2021-07-05

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：41701093）;中國博士后基金（編號：2017M611928）;國家重點研發(fā)計劃課題（編號：2017YFD0200107）。

作者簡介：王娟娟（1979—），女，江蘇泗洪人，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物學研究。E-mail：wangjuanjuan@yzu.edu.cn。

通信作者：張振華，博士，研究員，主要從事農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學研究。E-mail：zhenhuaz70@hotmail.com。

鐵（iron，F(xiàn)e）和錳（manganese，Mn）是地殼中占比較大的2種過渡金屬元素。兩者生物、化學性質(zhì)均比較活躍，在自然環(huán)境中極易生成活性表面積較大的氧化物。鐵錳氧化物以及鐵錳氫氧化物，具有較大的比表面和大量的—OH基團，參與土壤中多種離子的吸附與解吸過程，并表現(xiàn)出一定的氧化還原作用。除了對鈣、磷等離子具有較強的吸附作用外，對鎘、鉛、砷等重金屬（或類重金屬）元素以及有機物也具有一定的吸附作用[1-2]。含鐵礦物在酸堿度和氧化還原條件發(fā)生改變時易發(fā)生氧化或還原作用以及沉淀或溶解作用，決定著含鐵礦物中鐵和其他有關金屬元素在土壤中的存在形態(tài)、轉(zhuǎn)化特征和生物活性[3]，充當土壤重金屬元素的固定鈍化劑或改良劑，成為一種重金屬生物污染的地球化學屏障。

鐵是高等生物必需的微量營養(yǎng)元素，同時在特定條件下成為細菌的潛在能源物質(zhì)[4]。微生物參與鐵氧化過程有主動與被動作用。前者通過酶反應將Fe（Ⅱ）氧化成Fe（Ⅲ），從而獲得能量;后者則作為結(jié)合和成核表面而促進氧化鐵在細胞壁和胞外聚合物上的沉淀。此外，由微生物代謝引起的pH值變化和某些細菌滲出物的產(chǎn)生也可能有利于鐵氧化物形成[5]。在對二十余種濕地植物進行調(diào)查時發(fā)現(xiàn)，根際有鐵細菌的存在概率達到92%[6]，其中，由微生物活動形成的鐵氧化物占到鐵氧化物總量的50%～90% [7-8]。微生物介導產(chǎn)生的鐵氧化物可以進一步催化鐵氧化過程。

錳的價態(tài)同樣較多，經(jīng)常參與土壤中一系列的生物和地球化學過程，尤其是與鐵等其他金屬的氧化過程有著密切的聯(lián)系。錳氧化菌在海洋和陸地均有分布，它可以通過酶直接將錳氧化，也可以通過生理活動改變環(huán)境的pH值和氧化還原電位（Eh），促進錳的化學氧化[9]。微生物在錳的氧化過程中的作用要遠大于非生物氧化作用[10]，甚至常被認為是推動自然界中錳氧化物形成的主要貢獻者[11]。據(jù)報道，典型的錳氧化細菌為異養(yǎng)微生物，并不從錳氧化過程中獲取能量，介導錳氧化過程可能是為了減輕重金屬及紫外線脅迫等危害因子。

鐵錳氧化菌是指可以同時氧化鐵錳并從過程中獲得能量的微生物，這一過程伴隨著能量代謝及呼吸電子傳遞等。近些年來，由于對水體金屬污染處理的關注，不少學者對鐵錳氧化菌進行了相關研究[12-13]。蛋白胨酵母膏完全培養(yǎng)基（PYCM）因?qū)﹀i氧化菌具有較強選擇性而常被用來篩選錳細菌[14]。在自然界中，鐵、錳氧化菌往往伴生存在，因此另加入檸檬酸鐵銨，可同時檢測細菌對鐵的氧化能力。

水稻是我國最重要的糧食作物，水稻產(chǎn)量占我國糧食總產(chǎn)量的40%以上。水稻長期生長在淹水環(huán)境，根系通氣組織發(fā)達，可以向根際土壤泌氧，造成土壤微域氧化還原電位差和鐵氧濃度梯度，從而為鐵氧化菌提供良好生境[15]，微生物介導形成的氧化鐵可吸附于植物根際周圍，形成鐵膜[2]。鐵膜的成分除了鐵氧化物外，還含有一定比例的錳氧化物，鐵膜對多種重金屬具有吸附作用[16]。如常見于稻田的周叢生物即為鐵錳氧化物、微生物以及微生物分泌的有機物和其他有機物所組成，在稻田重金屬固定方面具有積極意義[17]。鐵膜的存在不僅影響到水稻對污染元素的吸收與累積，也在一定程度上影響著營養(yǎng)元素的吸收與累積[18-20]，進而影響糧食的營養(yǎng)和安全問題，因此關于鐵膜的研究被廣泛關注[21]。

研究發(fā)現(xiàn)，細菌可能在調(diào)控水稻田鐵膜產(chǎn)生過程中起著關鍵作用，但目前對于水稻土鐵錳氧化菌的研究還有待深入。本試驗采用改良的纖毛菌培養(yǎng)基對富鐵水稻田土壤鐵錳氧化菌進行富集、純化，從系統(tǒng)分類學上對菌種進行鑒定，并對其形態(tài)學及氧化產(chǎn)物以及其對重金屬的吸附進行進一步分析，明確了其氧化鐵錳的效果，結(jié)果可為研究稻田重金屬污染治理提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試稻田土壤樣品采自江蘇省鎮(zhèn)江市丹徒區(qū)榮炳鎮(zhèn)南莊村。土壤有機質(zhì)含量范圍25%～35%，土壤pH值 6.0左右，耕作層生物可利用還原態(tài)鐵含量為2.0 mg/g（干土）。采集水稻分蘗期根際土壤用于培養(yǎng)鐵錳氧化細菌。

1.2 培養(yǎng)基準備

改良纖毛菌培養(yǎng)基（modified Leptothrix medium，簡稱培養(yǎng)基A）：2 g/L MnCO3·H2O2、0.3 g/L NH4Cl、1 g/L酵母提取物、1 mL/L微量元素（TES）溶液、1 mL/L維生素（Vit）溶液（ATCC配方）、2 mL/L 檸檬酸鐵溶液（將2.83 g硫酸亞鐵和3 g檸檬酸三鈉分別溶解后混勻，定容至20 mL，以 0.22 μm 無菌濾膜過濾后冷凍保存）、20 g/L瓊脂。

缺鐵的改良纖毛菌培養(yǎng)基（以下簡稱培養(yǎng)基B）的配方為A培養(yǎng)基去掉檸檬酸鐵溶液。缺錳的改良纖毛菌培養(yǎng)基（以下簡稱培養(yǎng)基C）的配方為培養(yǎng)基A去掉MnCO3·H2O。

1.3 菌種分離與篩選

將土壤樣品以等同于生理鹽水的礦物營養(yǎng)液在10-8～10-1進行梯度稀釋，并各取100 μL均勻涂布在A培養(yǎng)基上。在25? ℃條件下培養(yǎng)3 d后挑取單菌落轉(zhuǎn)接至新的平板上，經(jīng)4～5次轉(zhuǎn)接，可得到單菌落。將分離得到的細菌接種到事先準備好的培養(yǎng)基A、B、C上，在25 ℃條件下培養(yǎng)1周，對其生長狀況進行觀察記載。采用亮柏蘭（LBB）染料對可能生成的錳氧化物進行檢測。

1.4菌種系統(tǒng)分類鑒定

挑選生長較好的菌落，采用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（生工，SK8255），按供應商步驟提取細菌DNA。采用通用細菌引物擴增16s rDNA，所用試劑盒為BigDye Terminator v1.1 試劑盒。引物為27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）與1492R（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）。通過1%瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR產(chǎn)物生成情況，并進行純化回收（SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒SK8131）。純化的PCR產(chǎn)物用于Sanger測序，測序平臺為ABI測序儀（3730xl DNA Analyzer）。采用DNAMAN將測定序列拼接后，使用NCBI在線Blast數(shù)據(jù)庫進行比對（Blastn），比較所獲序列與已知核酸序列的同源性。下載近緣序列，并采用軟件系統(tǒng)進化數(shù)構(gòu)建軟件MEGA（https：//www.megasoftware.net/）對序列進一步分析，并采用Neighbor joining方法建立菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 掃描電鏡（SEM）與EDS能譜分析

將生長3 d左右的完好菌落從培養(yǎng)基上切取下來，參照掃描電鏡樣品處理常規(guī)方法先進行固定（2.5% 1，5-戊二醛電鏡專用固定液），洗滌后脫水（分別采用30%、50%、70%、80%、90%梯度濃度乙醇）、經(jīng)過CO2臨界點干燥后，進行噴金處理。最終所得樣品采用環(huán)境掃描電子顯微鏡（PHILIPS，XL30ESEM）進行分析觀察。選取合適區(qū)域進行EDS能譜分析（加速電壓為0.5～20.0 keV，放大倍數(shù)為35 000倍）。上述測定于揚州大學理化測試中心進行。

1.6 菌株對鎘的耐性及吸附的影響

選取菌種MOB8，采用不加瓊脂的改良纖毛菌培養(yǎng)基C，分別加入終濃度為0、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/L 的Cd2+（CdCl2），接種后于25 ℃搖床（120 r/min）培養(yǎng)1周，觀察記錄菌種生長情況。最后添加最終濃度為5.0 mg/L的Cd2+，分別于1、3、5、7、9 d取樣，離心過濾，用原子吸收法測定溶液中Cd2+濃度，以評估菌株及其產(chǎn)物對鎘的吸附能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵錳氧化菌的篩選

在接種土壤稀釋濃度平板上選取12株有鐵銹色的菌落，采用劃線稀釋法轉(zhuǎn)接進行。在繼續(xù)培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)有的菌落顏色加深，推測可能是由于所產(chǎn)生的色素積累所致，舍棄該類菌，繼續(xù)其他菌種的轉(zhuǎn)接與純化。最終獲得4株具有潛在鐵錳氧化功能的菌株，分別編號為MOB4、MOB8、MOB9和MOB11（圖1）。

幾株菌的菌落相對較小，生長速度慢，表面光滑黏稠，呈赭黃色或棕褐色，菌落中心顏色深且顏色不隨培養(yǎng)時間變化。在菌株生長過程中，發(fā)現(xiàn)有一些菌株的菌落四周產(chǎn)生赭色暈圈，如菌株MOB4與MOB11在3種培養(yǎng)基上均出現(xiàn)紅棕色暈圈。LBB染色鑒定也發(fā)現(xiàn)有氧化錳產(chǎn)物的生成。

相對而言，菌株MOB8在含鐵和錳的培養(yǎng)基（A）上生長得較快，而在缺錳的培養(yǎng)基（C）上所形成的菌落最大。在缺錳的C培養(yǎng)基上前4 d未見生長，1周后開始出現(xiàn)明顯菌落，后期逐漸增加。同樣，菌株MOB9在含鐵錳的培養(yǎng)基（A）上生長狀況最佳，培養(yǎng)的前4 d在C上也未見生長，8 d后開始出現(xiàn)菌落（圖1）?？梢娙卞i對這2株菌影響要大于缺鐵。

2.2 菌落掃描電鏡（SEM）與能譜分析結(jié)果

幾株菌的掃描電鏡結(jié)果（圖2）表明，其細胞形態(tài)均為球形至短桿形，大小為0.4～0.8 μm。在細胞表面包裹著大量的絮狀物和顆粒物，這可能是細胞生長所產(chǎn)生的胞外聚合物，以及一些鐵、錳的氧化產(chǎn)物。隨機選擇各株菌的電鏡樣品的一些區(qū)域進行X射線能譜分析，通過分析測定細胞表面的主要元素組成。從分析結(jié)果可以看出，除菌株MOB4外，各菌株表面均有一定量的鐵錳元素。菌株MOB8與MOB11的能譜圖中的Fe和Mn波峰要高于MOB9，表明所含鐵、錳相對較高。各菌株能譜測定結(jié)果中氧（O）的峰值也較高，結(jié)合平板培養(yǎng)與氧化物染色結(jié)果可以推測，這些菌株表面可能含有較大比例的鐵錳氧化物，其產(chǎn)物的具體結(jié)構(gòu)與組成有待進一步分析。

2.3 菌株的16S rRNA基因序列分析

對菌株的16S rRNA 基因的測序分析，采用鄰接法所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹（圖3）。菌株MOB4、MOB8、MOB9和MOB11在系統(tǒng)分類上比較接近，可以確定為同一屬。經(jīng)過BLAST比對，其序列與不動桿菌Acinetobacter guillouiae相似度為99%，為近緣物種?？梢詫⒃囼灪Y選所得的4株菌鑒定為不動桿菌屬（Acinetobacter）。有關該菌氧化金屬鐵錳的報道尚未多見。

2.4 菌株對重金屬鎘吸附的影響

選取分離得到的鐵氧化菌MOB8進行液體培養(yǎng)試驗，發(fā)現(xiàn)其對鎘的耐受臨界濃度為0.75 mg/L，高于此濃度生長嚴重受影響。因此，選擇在培養(yǎng)基中加入最終濃度為5.0 mg/L的Cd2+，以檢測菌株及其產(chǎn)物對鎘的吸附能力。在培養(yǎng)的4～5 d，接種組瓶中變渾濁、開始出現(xiàn)鐵銹色的氧化物，空白組無明顯變化。培養(yǎng)9 d后，接種組樣品中的鎘含量下降了35.25%，空白組樣品中的鎘含量則下降了5.98%。鎘濃度的變化趨勢和菌株液體培養(yǎng)中Fe2+的濃度變化趨勢大致相同，表明氧化鐵的生成吸附了溶液中游離態(tài)的Cd2+。

3 討論與結(jié)論

自然界中鐵與錳元素的氧化在很大程度上取決于微生物活動，微生物氧化作用要遠高于非生物氧化過程[21-22]。微生物參與形成的鐵錳氧化物一般聚集于細胞表面，與胞外聚合物一起，形成較大的比表面[21]。因而，相對于化學氧化產(chǎn)物而言，生物鐵氧化物具有更高的吸附容量，對于環(huán)境中有害的重金屬離子及一些有機污染物有較大的吸附能力[23]。生物鐵錳氧化物對地球化學循環(huán)的貢獻已得到相關關注，來自不同環(huán)境的鐵錳氧化細菌也有報道[21]，而來自于水稻田的純菌種研究較少。水稻田以淹水條件為主，以微生物驅(qū)動鐵、錳氧化過程在水稻土中十分普遍，且常常居于主導地位[24]。鑒于當前我國稻田重金屬污染現(xiàn)狀嚴峻，鐵錳氧化菌在環(huán)境生態(tài)效應及生產(chǎn)上應用潛力巨大。

前人研究表明，改良纖毛菌培養(yǎng)基（modified Leptothrix medium）是一種選擇性培養(yǎng)基，適合用于鐵錳氧化菌的篩選。通過采用該方法所獲得的鐵錳氧化菌包括弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacter freundii）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和芽孢桿菌屬（Bacillus sp.）等[25-27]。本試驗通過選用改良纖毛菌培養(yǎng)基，成功培養(yǎng)出4株具有氧化鐵、錳功能的細菌MOB4、MOB8、MOB9、MOB11。根據(jù)16S rRNA 基因序列測定結(jié)果，結(jié)合菌種生長形態(tài)特征，將其鑒定為Acinetobacter sp.。Acinetobacter常見于土壤，為革蘭氏陰性菌，嚴格好氧，屬不動細菌屬。前人從活性污泥中分離得到該種菌[28]，發(fā)現(xiàn)其具有降解苯酚的特性。此外，該種菌被證明耐高鹽與耐重金屬離子，具有耐抗生素性[29]。但該類菌對于金屬鐵、錳的氧化能并尚未多見報道。根據(jù)鐵、錳氧化菌的生長特征與元素分析結(jié)果，可以初步判斷本試驗分離出的菌株對鐵和錳均具有一定的氧化能力，其產(chǎn)物的組成與結(jié)構(gòu)特征需進一步研究。本試驗初步表明，該類細菌的生長有利于促進二價鐵的氧化，并提高對溶液中重金屬鎘的吸附。

綜上所述，本研究從富鐵的水稻田土壤中分離篩選得到 4 株具有鐵錳氧化功能的菌株，經(jīng)過形態(tài)學及分子生物學鑒定為不動桿菌（Acinetobacter sp.）。菌株的生長可吸附并降低溶液中鎘的含量。

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