楊迎亞，周雯靜，王海英

(1.遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學 麻醉與器官保護基礎研究重點實驗室，貴州 遵義 563099)

炎癥是機體對組織損傷的反應，并且在組織修復過程中必不可少。輕、中度的炎癥有助于控制組織損傷程度，但過度激活或不受控制的炎癥反應卻會造成組織結(jié)構(gòu)和功能的嚴重損害。因具有致細胞損傷并誘導級聯(lián)炎癥反應的作用，細胞焦亡被認為是T2DM及其心血管并發(fā)癥發(fā)生和發(fā)展的驅(qū)動力。因此，深入了解細胞焦亡在T2DM發(fā)生發(fā)展中的作用機制，可以進一步通過靶向細胞焦亡通路，防治其心血管損害，為臨床尋求心肌保護的靶點提供新策略。

1 細胞焦亡概述

細胞焦亡是一種主要依賴消化道皮膚素D(GSDMD)N端殘基片段(GSDMD-NT)的成孔活性介導細胞損傷的細胞死亡方式，又稱為GSDM家族介導的細胞炎性壞死。而GSDMD的激活主要依賴于炎性小體形成并觸發(fā)炎性caspase(-1/-4/-5/-11)活化。首先，當模式識別受體(PRRs)如：NLRP3，AIM2等被激活，與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)和caspase-1前體蛋白酶(pro-caspase-1)相互銜接構(gòu)成炎性小體，該過程促使caspase-1成熟并切割GSDMD釋放GSDMD-NT，最終向質(zhì)膜移位，導致細胞膜穿孔，細胞裂解死亡。以NLRP3/caspase-1/GSDMD通路為例，當細胞受到線粒體活性氧(ROS)、尿酸、細胞外ATP等物質(zhì)異常增加，線粒體、溶酶體破壞，細胞內(nèi)外離子濃度改變以及形態(tài)改變等刺激時，NLRP3被激活[1-2]。同時，由于核因子-κB(NF-κB)[3]、硫氧還蛋白結(jié)合蛋白(TXNIP)、NIMA相關(guān)激酶-7(NEK7)等[4-5]信號因子的活化，推動了NLRP3炎性小體成熟的進程。成熟的caspase-1，一方面，剪切GSDMD，使之釋放出有活性的GSDMD-NT，可以直接導致質(zhì)膜穿孔[6]；另一方面，促進炎性因子前體(pro-IL-1β、pro-IL-18)和趨化因子活化，多種細胞內(nèi)容物經(jīng)膜孔釋放，不僅促進細胞裂解和級聯(lián)炎癥反應的發(fā)生，細胞內(nèi)ATP等物質(zhì)的釋放還可以誘導進一步細胞焦亡，可能成為臨床多種疾病預防和治療的潛在靶點[7-8]。與caspase-1介導的焦亡通路不同，caspase-4、-5、-11/GSDMD通路由脂多糖 (LPS)直接激活，導致膜孔形成并促發(fā)細胞裂解和炎癥反應，被稱為細胞焦亡的非經(jīng)典途徑，多見于膿毒血癥[9]。

細胞焦亡具有其獨特的形態(tài)學改變，首先，GSDMD-NT向質(zhì)膜移位是膜孔形成所必需的，通過透射電鏡可以觀察到細胞膜出泡并產(chǎn)生突起，細胞輕度腫脹。質(zhì)膜上隨即形成非選擇性離子通道，導致細胞質(zhì)經(jīng)膜孔滲出，細胞形態(tài)破壞呈扁平狀。雖然細胞焦亡和壞死性凋亡(necroptosis)都表現(xiàn)出質(zhì)膜破裂，但是，壞死性凋亡過程中產(chǎn)生的執(zhí)行蛋白MLKL向質(zhì)膜移位，形成選擇性離子通道，細胞因過度膨脹而破裂。因此，二者的形態(tài)學特征具有顯著的差異[10]。此外，細胞焦亡和壞死性凋亡都表現(xiàn)出與細胞凋亡(apoptosis)不同的質(zhì)膜破壞，細胞膜完整性的喪失使不能透過質(zhì)膜的染料(如：EthD-Ⅲ、YO-Pro-1)進入細胞內(nèi)，可使焦亡和壞死性凋亡的細胞染色，而不能使凋亡細胞染色，成為區(qū)別不同細胞死亡方式的輔助方法。

不斷深入的研究發(fā)現(xiàn)，凋亡的啟動者caspase-8在介導焦亡、凋亡和壞死性凋亡3種PCD模式中均可以發(fā)揮作用，被喻為3種細胞死亡方式的“分子開關(guān)”[11]。細胞凋亡過程中的效應蛋白caspase-3也可以在細胞焦亡途徑中發(fā)揮作用。當細胞內(nèi)GSDME高表達時，caspase-3可以剪切GSDME蛋白，使其釋放出與GSDMD-NT功能相似的N端殘基片段，導致細胞焦亡，反之，則導致細胞凋亡，從而決定了腫瘤細胞的死亡方式[12-13]。在細胞焦亡過程中，GSDMD的缺失導致caspase-1激活caspase-3，從而介導細胞凋亡，而當GSDMD正常表達時，該通路則受到抑制，細胞則發(fā)生焦亡[14]。這充分地說明了細胞死亡信號通路之間復雜的相互作用關(guān)系，可以認為，多種PCD模式在多個層面上可能是融匯貫通的，在同一細胞內(nèi)同時或連續(xù)地被激活。它們相互關(guān)聯(lián)，相互影響，又靈活地相互補償。即使通過藥物抑制或基因敲除關(guān)閉了細胞焦亡的通道，這些細胞死亡的方式也可能在某種特定條件下相互切換。

2 細胞焦亡與2型糖尿病

T2DM帶來的危害遍及全球，其本質(zhì)上是一種無菌性炎癥反應，不僅會導致葡萄糖、游離脂肪酸代謝障礙和胰島淀粉樣多肽(IAPP)水平升高等病理變化，還伴隨多種心血管損害。大量研究表明，NLRP3/caspase-1/GSDMD通路參與其中并推動病程演進，該通路不僅與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，還直接介導糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)和冠心病(Coronary heart disease，CHD)等，增加了心肌缺血/再灌注損傷(Myocardial ischemia/reperfusion injury，MI/RI)和心力衰竭(Heart failure，HF)的發(fā)病率，是導致T2DM高患病率和高死亡率的主要原因。同時，已經(jīng)有研究表明，T2DM大鼠在經(jīng)歷體外循環(huán)下MI/RI后，由于線粒體功能嚴重受損，心肌細胞大量ROS堆積，血清中炎性因子IL-1β、TNF-α等的含量較正常大鼠明顯增高，心肌梗死面積增大，心功能受損嚴重[15]。細胞焦亡在T2DM中的作用機制可歸納如下：

首先，肥胖患者常常伴有脂肪細胞功能紊亂和慢性炎癥，是T2DM發(fā)病的主要因素[16]。研究發(fā)現(xiàn)，肥胖大鼠皮下和內(nèi)臟脂肪細胞常常因肥大和缺氧，導致線粒體功能障礙，ROS大量產(chǎn)生，同時，隨著脂肪細胞內(nèi)多種抗氧化酶活性降低，氧化應激不斷增強[17]，該過程促使細胞焦亡相關(guān)分子活化，導致脂肪細胞裂解死亡，同時，脂肪組織內(nèi)炎性細胞浸潤，釋放單核細胞趨化蛋白/趨化因子配體-2(MCP-1/CCL-2)、TNF-α、IL-1/-6等細胞因子，誘發(fā)全身炎癥反應，進一步促進了糖、脂代謝異常和胰島素抵抗的發(fā)生，從而加重了T2DM[18]。在關(guān)于肥胖患者的臨床研究中指出，脂肪組織產(chǎn)生大量IL-1家族細胞因子，并且NLRP3的激活與超重成正相關(guān)[19]。通過抑制細胞焦亡通路相關(guān)蛋白的表達，可以使脂肪細胞大小和形態(tài)變化得到明顯的改善，同時，胰島素敏感性相關(guān)基因的表達增高，胰島素增敏激素分泌增加，標志著胰島素抵抗得到緩解[20-21]。

其次，慢性高血糖通過晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGE)途徑、蛋白激酶C(PKC)途徑等多條途徑增加了線粒體代謝，過多ROS的產(chǎn)生誘導細胞焦亡，導致胰島β細胞和血管內(nèi)皮細胞(VECs)裂解及炎癥反應，是胰島β細胞功能受損、胰島素抵抗和血管內(nèi)皮功能障礙的主要原因[22]。同時，胰島β細胞中TXNIP的活化進一步促進細胞裂解死亡，并推動炎癥級聯(lián)擴大[23]。研究顯示，血糖控制不良的慢性高血糖患者線粒體ROS增加更為明顯，細胞焦亡通路被激活，炎癥反應也更加突出[24]。

另外，T2DM期間胰島淀粉樣多肽(IAPP)在胰島β細胞和毛細血管內(nèi)的異常沉積促進間質(zhì)纖維化，并對胰島β細胞具有明顯殺傷作用。有研究者在該沉積物中同樣發(fā)現(xiàn)了焦亡相關(guān)蛋白活化和巨噬細胞聚集，IL-1β和趨化因子的釋放明顯增加，最終導致胰島β細胞裂解死亡和級聯(lián)炎癥反應，成為T2DM藥物治療的一個關(guān)鍵靶點[25]。

最后，腸道菌群失調(diào)也是促進T2DM及相關(guān)心血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。研究顯示，腸道菌群失調(diào)導致腸道細菌的代謝產(chǎn)物三甲胺氧化物(TMAO)、短鏈脂肪酸(SCFAs)及膽汁酸等異常增多可以誘導巨噬細胞焦亡，NLRP3炎性小體活化并趨化巨噬細胞聚集，促進炎癥反應。腸道菌群失調(diào)的患者表現(xiàn)出BMI增高，脂肪量增加，胰島素敏感性降低，同時血漿中炎性因子增加，糖、脂代謝異常。因此，腸道菌群失調(diào)激活細胞焦亡，不僅導致T2DM的發(fā)生，還促進動脈粥樣硬化和心肌纖維化的發(fā)展[26-27]。此外，有研究者發(fā)現(xiàn)在腸道手術(shù)中進行NLRP3-/-的巨噬細胞重建，大鼠糖耐量得到快速持續(xù)改善，T2DM也得到持續(xù)緩解[28]。腸道益生菌因其抑制NF-kB激活、NLRP3表達及TNF-α、IL-1β等因子活化的作用，可能成為防治T2MD及相關(guān)心血管并發(fā)癥的潛在靶點[29]。

3 細胞焦亡與心血管疾病

免疫調(diào)節(jié)異常和代謝紊亂是多種心血管疾病形成的主要因素，NLRP3炎性小體作為機體代謝應激的傳感器，將二者與靶細胞裂解死亡、組織、器官功能障礙及炎癥反應聯(lián)系在一起。因此，T2DM相關(guān)代謝綜合征介導細胞焦亡和炎癥反應，成為心血管疾病病程的驅(qū)動者。

3.1 糖尿病心肌病 DCM是與T2DM關(guān)系最密切的疾病。在T2DM早期，線粒體代謝變化先于心臟病理結(jié)構(gòu)改變，氧化應激導致細胞焦亡的激活使機體長期處于慢性炎癥狀態(tài)，NF-kB激活和TXNIP的表達，促使NLRP3炎性小體的過度激活，成為促進心肌纖維化，驅(qū)動心臟結(jié)構(gòu)和功能改變的關(guān)鍵因素，隨后caspase-1/GSDMD直接導致了心肌細胞裂解死亡。因此，在T2DM大鼠模型中可以觀察到細胞超微結(jié)構(gòu)破壞，包括：線粒體嵴紊亂和水腫、脂質(zhì)積累、肌原纖維破壞以及間質(zhì)纖維化等，隨后發(fā)生心肌重構(gòu)、心肌順應性下降，并出現(xiàn)收縮、舒張功能障礙甚至心力衰竭[30]。

3.2 動脈粥樣硬化及冠心病 在T2DM發(fā)展過程中，慢性高血糖以及膽固醇結(jié)晶、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、TMAO等物質(zhì)的過度產(chǎn)生促使線粒體功能障礙，強烈的氧化應激觸發(fā)細胞焦亡，成為誘導VECs、巨噬細胞及平滑肌細胞(SMC)裂解死亡及慢性炎癥的關(guān)鍵因素，因此，T2DM患者較非DM患者更易發(fā)生VECs功能障礙、內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積以及泡沫細胞形成，最終出現(xiàn)大、中動脈內(nèi)膜下脂質(zhì)粥樣斑塊形成，導致動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)的發(fā)生[31-32]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3/caspase-1/GSDMD通路蛋白在粥樣斑塊中高表達，并且與斑塊脆性和AS進展程度呈正相關(guān)。首先，VECs裂解及內(nèi)皮下巨噬細胞聚集并釋放炎性因子是血管內(nèi)皮功能障礙的關(guān)鍵因素[33]。其次，趨化因子、黏附分子等釋放進一步促使SMC和巨噬細胞增殖和遷移，進入動脈壁形成溶酶體中脂質(zhì)沉積和泡沫細胞，導致纖維斑塊的形成，隨著泡沫細胞的焦亡，炎癥反應進一步擴大，焦亡相關(guān)蛋白表達的上調(diào)與斑塊破裂和血栓形成密切相關(guān)[34-35]。此外，SMC產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)參與了纖維帽的形成，SMC的焦亡引起纖維帽脆弱而不穩(wěn)定，直接導致急性冠脈綜合征的發(fā)生。反之，阻斷NLRP3/caspase-1/GSDMD通路，控制各種炎性因子的成熟與釋放，不僅降低了CHD大鼠VECs功能損害，而且在臨床研究中發(fā)現(xiàn)對CHD患者的VECs起到一定的保護作用[36-37]。

研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者常常伴隨低脂聯(lián)素血癥，通過誘導NLRP3炎性小體激活，介導血管內(nèi)皮細胞焦亡，導致血管內(nèi)皮功能障礙，并影響血管舒縮功能，是導致AS及CHD的重要危險因素。運用脂聯(lián)素(APN)受體激動劑抑制細胞焦亡通路的激活和IL-1β、IL-18的釋放，減輕了T2DM相關(guān)心肌細胞損傷，也為AS提供了新的治療方法[38]。

3.3 心肌梗死和心肌缺血/再灌注損傷 盡管再灌注作為目前臨床治療急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)的主要方法，大大提高了T2DM合并AMI患者的預后，但是研究者發(fā)現(xiàn)，T2DM作為AMI的獨立危險因素，仍然使AMI病死率加倍[39]。AMI促使心肌細胞、成纖維細胞及VECs中NLRP3炎性小體持續(xù)激活，單核細胞、巨噬細胞及中性粒細胞聚集，釋放IL-1β和IL-18，并介導細胞損傷和心功能障礙。心肌供血供氧恢復后，氧化應激促使線粒體功能障礙進一步加重[40]，心肌細胞焦亡和炎癥反應使缺血性損害在梗死的基礎上更加嚴重，導致MI/RI。在此過程中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ERS)作為細胞早期應激反應，是ROS堆積、線粒體和溶酶體損傷、細胞內(nèi)外K+和Ca2+濃度改變以及ATP、mtDNA釋放等重要病理生理現(xiàn)象的基礎。線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(MAMs)作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上與線粒體相互接觸的特殊結(jié)構(gòu)域，參與NLRP3活化，募集ASC和caspase-1，并觸發(fā)炎性小體成熟，成為ERS過程中連接細胞焦亡和MI/RI的重要橋梁[41]。因此，在經(jīng)歷MI/RI的大鼠心肌組織中可以觀察到細胞焦亡相關(guān)蛋白明顯激活、炎性細胞浸潤，最終誘導級聯(lián)炎癥反應造成結(jié)構(gòu)和功能的進行性損害[42]。而NLRP3/caspase-1/GSDMD通路的抑制有效降低了AMI和MI/RI后心肌梗死面積，使心功能得以維持，也降低了患者早期死亡率和心室重構(gòu)，改善預后[43-44]。由此可見，T2DM由于代謝綜合征介導心肌細胞焦亡和長期慢性炎癥，在經(jīng)歷AMI和MI/RI后，進一步激活的心肌細胞焦亡和級聯(lián)擴大的炎癥反應使T2DM患者缺血性損害較非DM患者更加嚴重。細胞焦亡因其致炎致?lián)p傷作用在T2DM患者AMI和MI/RI過程中扮演了關(guān)鍵角色，可能成為臨床預防和治療的重要靶點。

3.4 心力衰竭 HF是T2DM相關(guān)心血管并發(fā)癥發(fā)展的終末階段。細胞焦亡、慢性炎癥及神經(jīng)內(nèi)分泌的過度激活誘導心肌病理性重構(gòu)，心肌細胞和成纖維細胞裂解死亡，表現(xiàn)為心肌纖維化、心肌肥厚并出現(xiàn)心功能降低，是HF發(fā)病的主要原因。cAMP作為評估心肌收縮功能的間接指標，其增加程度與心臟正性肌力作用呈正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在HF過程中，NLRP3炎性小體的形成可以使cAMP的生成減少，導致心肌收縮力明顯降低[45]，抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD通路能有效地減輕心肌細胞死亡和HF相關(guān)室性心律失常，維持心功能[46]。此外，心肌特異性鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶轉(zhuǎn)基因(CNTg)的過表達使小鼠出現(xiàn)慢性炎癥、心肌肥厚、心室擴張及收縮、舒張功能損害，最終導致HF的發(fā)生，而NLRP3基因缺失使這一類小鼠心肌細胞焦亡受阻和血清IL-1β的水平明顯降低，減少了心肌細胞炎癥和病理性重構(gòu)，使心肌收縮力得以改善[47]。

4 細胞焦亡的調(diào)控

目前，靶向NLRP3/caspase-1/GSDMD通路的治療，無論是藥物抑制，還是基因敲除均發(fā)揮了重要作用，并且在多個動物模型中得以證實。微小RNA(miRNAs)、長鏈非編碼RNA( lncRNAs)、環(huán)形RNA(circRNA)等多種非編碼RNA(ncRNA)通過影響細胞焦亡通路相關(guān)蛋白mRNA的表達，起到一定的調(diào)控細胞焦亡和炎癥反應的作用。其中，miRNA是影響增殖、分化、衰老、死亡等細胞病理生理過程的關(guān)鍵分子，通過與mRNA的相應位點結(jié)合并介導其降解，是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達的重要介質(zhì)。多項研究表明，miRNA與T2DM相關(guān)代謝綜合征及心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[48]，不僅可以直接作用于NLRP3 / caspase-1 /GSDMD通路，減少焦亡相關(guān)蛋白的表達和pro-IL-1β、pro-IL-18的激活，在細胞焦亡和炎癥反應過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[49]，而且可以作用于TLR4/MyD88/NF-kB、TXNIP及SIRT-1蛋白[50-51]，對NLRP3炎性小體的形成起著一定的調(diào)控作用。因此，miRNA可能成為防治T2DM及相關(guān)心血管并發(fā)癥的新工具。

部分臨床常用的治療T2DM及相關(guān)并發(fā)癥的藥物也被證明通過抑制細胞焦亡從而發(fā)揮一定的保護作用，比如二甲雙胍不僅可以降低肥胖患者巨噬細胞向脂肪組織的浸潤和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，降低NF-kB、TXNIP/NLRP3/IL-1β、IL-18的激活，減輕胰島素抵抗，控制T2DM發(fā)展[52]。而且通過減少細胞焦亡通路相關(guān)蛋白的表達，改善了T2DM小鼠的DCM和MI/RI[53-54]，同時也起到減輕AS等心血管保護作用[55]，因此，成為臨床患者控制血糖，延緩病程演進，降低并發(fā)癥發(fā)病率的最佳選擇。此外，格列苯脲、西格列汀及利拉魯肽等也通過控制脂肪細胞、胰島β細胞焦亡，保護心血管系統(tǒng)免受慢性炎癥損傷。瑞舒伐他汀通過抑制細胞焦亡通路的激活，改善了DCM的發(fā)病環(huán)境，并且在CHD的治療中發(fā)揮了一定的潛在作用[56]。格列酮、格列美脲等通過改善血漿脂聯(lián)素濃度，抑制細胞焦亡的激活，也為臨床CHD的治療作出重大貢獻。

5 展望

綜上所述，細胞焦亡作為一種促炎性PCD模式，通過誘導宿主細胞在炎癥反應中裂解死亡，有助于清除病原體并控制感染，然而，過度激活的細胞焦亡通路則會導致組織器官功能障礙和級聯(lián)炎癥反應的發(fā)生。細胞焦亡的過程貫穿了T2DM及相關(guān)心血管并發(fā)癥的發(fā)展全過程，無論是從RNA水平還是蛋白質(zhì)水平調(diào)控細胞焦亡信號通路中各信號元件的作用，可以有效的抑制細胞焦亡發(fā)生和炎癥反應的擴大，因此，細胞焦亡相關(guān)基因和蛋白是目前預防和治療T2DM及相關(guān)心血管并發(fā)癥的重要靶點，只有深入研究整個細胞焦亡信號網(wǎng)絡的具體作用和調(diào)控機制，才能為疾病的研究打下基礎，也為其臨床防治提供新的思路和方法。