李 姣， 任秋蓉， 古 蕾， 朱曉換， 王亞男

（四川師范大學 生命科學學院，四川 成都610101）

為了控制植物病毒引起的植物病害發(fā)生和防止植物病毒在國家和地區(qū)之間傳播，必須對植物進行病毒檢測.植物病毒檢測在無病毒植物組織培養(yǎng)的過程中（特別是在脫除病毒之后）是重要環(huán)節(jié)之一.長期以來，人們一直致力于開發(fā)簡單有效的植物病毒檢測方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）［1-4］、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT -PCR）［5-7］、real -time RT -PCR［8-9］、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增反應（RT - loop - mediated isothermal amplification，RT-LAMP）［10-11］、微陣列［12］和下一代測序［13］等.其中，靈敏度高且操作較簡便的方法是RT-PCR，已被廣泛應用于病毒檢測［14-18］.

在采用RT - PCR 技術(shù)檢測植物病毒的過程中，第一個步驟是通過分離和純化RNA 獲得RNA模板.RNA的分離是一項技術(shù)性強、耗時長的工作，需要一定量的植物材料和幾個離心步驟.RNA提取后，還必須對RNA提取液進行純化，以獲得高質(zhì)量的RNA模板.在提取和純化的步驟中，操作人員的技術(shù)錯誤可能會導致RNA 污染或降解等問題，從而使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性、假陽性等錯誤［14，18］.因此，目前RT -PCR 檢測植物病毒的方法存在RNA模板制備較困難的缺點.

簡化RNA模板的制備過程將有助于提高植物病毒檢測的效率，降低檢測成本，并能極大地促進RT-PCR在其他領(lǐng)域的應用.一種稱為微量組織直接RT -PCR 反應（Microtissue direct RT -PCR）的簡單快速的RNA模板制備方法最初由Hosokawa等［19］于2006 年提出，有效檢測了菊花植株中的2種類病毒，即菊花矮化類病毒（CSVd）和菊花褪綠斑駁類病毒（CChMVd）.他們的研究發(fā)現(xiàn)，無菌注射器針頭（25 G）比剃刀更適合于CChMVd的檢測，而且在高濃度和低濃度類病毒感染的菊花植株中均能檢測到類病毒.然而，此后未有微量組織直接RT-PCR反應檢測其他植物病毒的研究，由此人們對該方法產(chǎn)生了2 個疑問：該方法是否只局限于菊花類病毒檢測？該方法可以應用于更多種類的植物病毒檢測嗎？為了解決這2 個問題，讓微量組織直接RT-PCR反應方法應用到更多種類的植物病毒檢測中，本研究建立與優(yōu)化了該方法，可檢測4種不同屬植物病毒感染的4 種植物，即葡萄卷葉相關(guān)病毒3（Grapevine leafroll-associate virus-3，GLRaV-3）感染的葡萄、蘋果莖溝病毒（Apple stem grooving virus，ASGV）感染的蘋果、馬鈴薯卷葉病毒（Potato leafroll virus，PLRV）感染的馬鈴薯和百合花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）感染的百合.GLRaV-3、ASGV、PLRV和CMV分別是Ampelovirus屬［20］、Capillovirus屬［21］、Polerovirus屬［22］和Cucumovirus屬［23］病毒的成員.經(jīng)正反向引物擴增所產(chǎn)生的特異性DNA條帶的長度分別是：GLRaV -3為546 bp［24］，ASGV 為524 bp［5］，PLRV 約為600 bp［25］，CMV為657 bp［26］.本研究首先以GLRaV -3 感染的葡萄試管苗為實驗材料進行微量組織直接RT-PCR反應，以優(yōu)化RNA模板的制備工藝，然后應用于其他3 種植物病毒感染的3 種植物中，以檢測微量組織直接RT - PCR 反應的敏感性和廣譜性.

1 材料與方法

1.1 實驗材料本研究以GLRaV -3 感染的葡萄品種“Cabernet Sauvignon”、ASGV 感染的蘋果品種“Gala”、PLRV感染的馬鈴薯品種“紫花白”和CMV感染的百合品種“Siberia”為植物材料，在MS 培養(yǎng)基上進行離體組織培養(yǎng)，同時以相應的無病毒試管苗作為陰性對照.MS培養(yǎng)基添加了質(zhì)量濃度30 g/L的蔗糖和質(zhì)量濃度7 g/L的瓊脂，pH值為5.8，在121 ℃高壓滅菌20 min.離體組織培養(yǎng)的條件：光照由冷白色熒光管提供，光照周期為16 h 光照/8 h黑暗，光亮度為50 μmol·s /m2，溫度為（24 ±2）℃.離體培養(yǎng)物每4 周進行一次繼代培養(yǎng).

1.2 實驗方法

1.2.1 植物組織總RNA 提取 按照傳統(tǒng)的RNA模板的制備方法，將植物組織（鮮質(zhì)量0.5 g）放入事先盛有液氮的研缽中，充分研磨，然后按照北京莊盟國際生物基因科技有限公司提供的植物組織總RNA提取的說明書，用該公司提供的植物組織總RNA提取試劑盒進行操作.

根據(jù)修改過的Hosokawa 等［19］用微量組織直接制備RNA 模板的方法，用無菌注射器針（Terumo，日本）在立體顯微鏡下刺入GLRaV -3 感染的葡萄試管苗的莖中直到其到達莖的中間部分，具體步驟如下：

1）無菌注射器針頭分別在莖、葉柄和根取樣（如圖1A所示）；

2）無菌注射器針頭刺入取樣部位的中間部分，在那里停留2 ～3 s（如圖1B所示）；

3）在室溫中將沾有組織液的針頭直接浸入RT反應液中15 min.

圖1 微量組織直接RT-PCR反應檢測GLRaV-3 感染的葡萄赤霞珠試管苗時RNA模板直接制備的方法示意圖Fig. 1 Illustrations of microtissue direct preparation method of RNA template in in vitro grapevine“Cabernet Sauvignon”stock plantlets infected with GLRaV-3

本研究通過2 個實驗優(yōu)化了微量組織直接制備RNA模板的工藝.在第一個實驗中，用3 種不同尺寸的無菌注射器針頭刺入葡萄試管苗的莖中，以選擇一種最佳尺寸的針頭來獲取組織液，制備RNA模板.這3 種尺寸分別為26 G（0. 45 ×16 RW -LB）、25 G（0.5 ×16 RW - LB）和23 G（0. 6 ×25 TW-LB）.在第二個實驗中（如圖1A 所示），使用無菌注射器針頭（26 G）從葡萄試管苗的不同部位（包括莖、葉柄、葉和根）來獲取組織液，制備RNA模板，以確定哪些植物組織適合于用微量組織直接RT-PCR反應檢測.

1.2.2 RT -PCR 反應 RT -PCR 反應首先對傳統(tǒng)法提取的RNA模板或者微量組織汁液中含有的RNA進行RT反應，然后對RT 反應產(chǎn)物進行PCR擴增.

傳統(tǒng)的RT 反應體系的總體積為20 μL，其中各成分含量為：1 μg RNA 和4 μL 5 × TRUE RT MasterMix（該試劑包含M -MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶和一對隨機引物）.各成分配置完成后，以ddH2O 補齊至20 μL，于42 ℃恒溫反應20 min，獲得DNA 模板，隨后于85 ℃放置5 s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應.

微量組織直接RT 反應體系總體積為20 μL，其成分與傳統(tǒng)的RT 反應體系的成分相同，只是不加RNA，以ddH2O補齊至20 μL.將黏附了組織汁液的針尖浸在RT反應體系中，室溫反應15 min，獲得DNA模板，隨后于85 ℃放置5 s，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，終止反應.操作中，盡量使黏附了組織汁液的針尖完全浸在RT反應液中，并蓋嚴管蓋，否則會影響RT反應結(jié)果.

PCR反應體系總體積為25 μL，其中各成分含量為：12.5 μL 2 ×Utaq PCR MasterMix、10 μmol/mL正反向引物（表1）各1 μL、2 μL cDNA 模板.各成分配置完成后，以ddH2O補齊至25 μL，放入Bio-Rad PCR儀中進行PCR擴增.

用于檢測GLRaV-3 的PCR反應條件：1）預變性：94 ℃，3 min；2）35 個循環(huán)：94 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，60 s；3）末次延伸：72 ℃，7 min.

用于檢測ASGV 的PCR 反應條件：1）預變性：94 ℃，3 min；2）35 個循環(huán)：94 ℃，30 s；54 ℃，45 s；72 ℃，60 s；3）末次延伸：72 ℃，5 min.

用于檢測PLRV的PCR反應條件：1）預變性：94 ℃，3 min；2）35 個循環(huán)：94 ℃，30 s；50 ℃，30 s；72 ℃，30 s；3）末次延伸：72 ℃，10 min.

用于檢測CMV的PCR反應條件：1）預變性：94 ℃，3 min；2）30 個循環(huán)：94 ℃，15 s；54 ℃，30 s；72 ℃，30 s；3）末次延伸：72 ℃，5 min.

表1 用于微量組織直接RT-PCR反應和傳統(tǒng)RT-PCR反應檢測4 種植物病毒的引物序列及特異性條帶長度Tab. 1 Primer sequences and the specific band sizes used for detection of 4 plant viruses by micro-tissue RT-PCR and RT-PCR

1.2.3 2%瓊脂糖凝膠電泳成像 RT -PCR反應產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)2%瓊脂糖凝膠電泳法檢測.將0.6 g的瓊脂糖放入30 mL TAE緩沖液（40 mmol/mL Trisacetate，1 mmol/mL EDTA，pH8.0）中溶解，滴入1.5 μL Goldview 核酸染料（5 μL 核酸染料/100 mL TAE緩沖液），倒入膠模中，室溫靜置約30 min，使膠完全凝固.把膠放入裝有適量TAE緩沖液的Bio-Rad凝膠電泳儀的電泳槽內(nèi)，分別往孔道中加入6 μL DL2000 DNA相對分子質(zhì)量標準和6 μL RT -PCR反應產(chǎn)物的混合液（1 μL 反應產(chǎn)物/5 μL 上樣緩沖液）后，蓋上電泳槽，通電1 ～5 V/cm，使DNA向陽極移動.電泳完畢后，取出凝膠，在Bio -Rad 成像系統(tǒng)中檢查凝膠并拍照.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 本研究中所有實驗重復2 次，每次使用20 株同種植物的陰性對照（即無病毒感染）試管苗和20 株同種植物的陽性對照（即病毒感染）試管苗.所有數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013 軟件進行統(tǒng)計.

2 結(jié)果與分析

2.1 以GLRaV -3 感染的葡萄試管苗為實驗材料優(yōu)化微量組織直接RT-PCR反應的工藝

2.1.1 26 G 針頭最適用于微量組織直接RT -PCR反應 本研究首先以GLRaV -3 感染的葡萄試管苗為實驗材料，通過2 個實驗優(yōu)化了微量組織直接制備RNA 模板的工藝.第一個實驗結(jié)果如圖2、表2 顯示，圖2 中M為分子標記，N為陰性對照，P為陽性對照，泳道1—3 為感染樣本，泳道4 為健康樣本。雖然3 種不同尺寸的無菌注射器針頭刺入葡萄試管苗莖的中間部位時所采集的組織液都可以通過微量組織直接RT -PCR 反應檢測到GLRaV-3 的特異性DNA條帶（546 bp），但是能檢測到該條帶的樣本數(shù)量和百分比在三者中差別很大.通過25和23 G針頭制備的RNA模板直接RT-PCR反應分別檢測到50%和25%樣本中的GLRaV-3 條帶，而通過26 G 針頭制備的RNA 模板直接RT -PCR反應檢測到100%樣本中的GLRaV -3 條帶（表2），說明在3 種不同尺寸的針頭中，26 G 針頭最適用于獲取植物組織液，制備RNA模板.

圖2 3 種規(guī)格的針頭采集微量組織后直接RT-PCR反應檢測葡萄赤霞珠試管苗莖中的GLRaV-3Fig. 2 Microtissue direct RT-PCR for detection of GLRaV-3 in stems of in vitro infected stock plantlets of grapevine“Cabernet Sauvignon”using three sizes of sterile syringe needles

表2 微量組織直接RT-PCR反應檢測GLRaV-3，用3種不同尺寸的無菌注射器針頭采集GLRaV-3 感染葡萄試管苗莖的組織液直接制備RNA模板的所產(chǎn)生的特異性條帶（546 bp）的數(shù)量和百分比Tab. 2 Number and percentages of specific bands（546 bp）detected by RT-PCR in microtissue direct preparations of RNA templates of stems infected with GLRaV-3 using 3 sizes of sterile syringe needles

2.1.2 植物莖、葉柄或根是微量組織直接RT -PCR反應的適宜器官 第二個實驗結(jié)果如圖3 所示，M為分子標記，N 為陰性對照，P 為陽性對照，泳道1 為感染植株的莖，泳道2 為感染植株的葉柄，泳道3 為感染植株的根，泳道4 為健康莖.在葡萄試管苗莖、葉柄和根中都檢測到了GLRaV -3 的DNA條帶，說明植物任一部位都可以用于采集組織液，進行微量組織直接RT-PCR反應.

圖3 微量組織直接RT-PCR反應檢測GLRaV-3在葡萄赤霞珠試管苗不同組織中的表達Fig. 3 Detection of GLRaV-3 by microtissue direct RT-PCR in various tissues of in vitro infected stock plantlets of grapevine“Cabernet Sauvignon”

2.2 微量組織直接RT -PCR 反應與傳統(tǒng)RT -PCR反應檢測GLRaV-3 的敏感性比較本研究以傳統(tǒng)的RT -PCR 檢測植物病毒的方法為對照，將建立且優(yōu)化的微量組織直接RT -PCR 檢測方法的敏感性與之進行了比較.雖然微量組織直接RT -PCR反應產(chǎn)生的GLRaV-3 條帶相對較弱，但是病毒被檢測到的頻率在兩者之間沒有差異，如圖4 所示，M為分子標記，P 為陽性對照，N 為陰性對照，泳道1、2 為傳統(tǒng)RT -PCR 的檢測結(jié)果，泳道3、4為微量組織直接RT -PCR 的檢測結(jié)果.結(jié)果表明其足以用于檢測葡萄試管苗中的GLRaV-3.

圖4 微量組織直接RT-PCR反應與傳統(tǒng)的RT-PCR反應在葡萄赤霞珠試管苗莖中檢測GLRaV-3 的敏感性比較Fig. 4 Comparison in the sensitivity of detection of GLRaV-3 in stems of in vitro infected stock plantlets of grapevine“Cabernet Sauvignon”between the traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR

2.3 微量組織直接RT -PCR 反應與傳統(tǒng)RT -PCR反應檢測ASGV、PLRV和CMV 的敏感性比較本研究把在葡萄試管苗已建立并且優(yōu)化的微量組織直接RT-PCR檢測方法進一步應用于其他3 種病毒的檢測，獲得了可信度高的檢測結(jié)果.在檢測ASGV 時，雖然微量組織直接RT -PCR 檢測到的ASGV特異性DNA 條帶（524 bp）比傳統(tǒng)RT -PCR檢測到的條帶較弱，但是其檢測到所有感染該病毒樣本（樣本量為20，百分比為100%）中的病毒條帶（表3、圖5），說明病毒被檢測到的頻率在兩者之間沒有差異.圖中，M 為分子標記，P 為陽性對照，N 為陰性對照，泳道1、2 為RT -PCR 檢測感染樣本，泳道3、4為RT-PCR 檢測健康樣本，泳道5、6 為MD RT -PCR檢測感染樣本，泳道7、8 為MD RT-PCR檢測健康樣本.

圖6 中，M 為分子標記，P 為陽性對照，N 為陰性對照，泳道1、2 為RT-PCR檢測感染樣本，泳道3、4 為MD RT-PCR檢測感染樣本.

表3 微量組織直接RT-PCR反應和傳統(tǒng)RT-PCR反應檢測4 種植物病毒的敏感性的比較Tab. 3 Comparison in the sensitivity of virus detection by microtissue direct RT-PCR and the traditional RT-PCR

圖5 微量組織直接RT-PCR反應與傳統(tǒng)RT-PCR反應在蘋果“Gala”試管苗莖中檢測ASGV的敏感性比較Fig. 5 Comparison in the sensitivity of detection of ASGV by traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR in stems of in vitro infected stock plantlets of apple“Gala”

圖6 微量組織直接RT-PCR反應與傳統(tǒng)RT-PCR反應在馬鈴薯“紫花白”中檢測PLRV的敏感性比較Fig. 6 Comparison of the sensitivity in detection of PLRV by traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR in stems of in vitro infected stock plantlets of potato“Zihuabai”

圖7 中，M 為分子標記，N 為陰性對照，P 為陽性對照，泳道1、2 為RT -PCR 檢測感染樣本，3、4條帶為MD RT-PCR檢測感染樣本.

圖7 微量組織直接RT-PCR反應與傳統(tǒng)RT-PCR反應在百合“Siberia”試管苗莖中檢測CMV的敏感性比較Fig. 7 Comparison of the sensitivity in detection of CMV by traditional RT-PCR and microtissue direct RT-PCR in stems of in vitro infected stock plantlets of Lilium Oriental hybrid“Siberia”

在應用微量組織直接RT-PCR檢測PLRV（圖6）和CMV（圖7）時也獲得了類似的結(jié)果.

根據(jù)每種病毒檢測實驗使用20 個陽性對照樣本和20 個陰性對照樣本的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，與傳統(tǒng)RT-PCR相比，4 種植物病毒被微量組織直接RTPCR檢測到的頻率無明顯差異（表3），說明微量組織直接RT-PCR檢測方法的敏感性足夠用于檢測這4 種不同屬的植物病毒.

3 討論

Hosokawa等［19］在使用微量組織直接RT -PCR反應檢測CSVd 和CChMVd 時發(fā)現(xiàn)無菌注射器針頭（25 G）比剃刀更適合于CChMVd的檢測.本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)直徑較大（26 G）的針頭所制備的RNA模板通過RT-PCR反應檢測到病毒的頻率高于直徑較?。?5 和23 G）的針頭.植物的莖、葉柄和根都是微量組織直接RT-PCR反應檢測病毒的適宜器官.

本研究建立并優(yōu)化的微量組織直接RT -PCR反應檢測植物病毒的方法成功地應用于葡萄、蘋果、馬鈴薯和百合試管苗的病毒檢測，有效地檢測了GLRaV-3、ASGV、PLRV和CMV.雖然該方法檢測的病毒特異性DNA 條帶比傳統(tǒng)RT -PCR 檢測到的條帶較弱，但是病毒被檢測到的頻率在兩者之間無明顯差異，說明該方法的敏感性足以檢測植物病毒.

這是首次基于RT-PCR反應直接利用植物組織液制備RNA模板在4 種試管苗中有效和快速檢測4 個不同屬植物病毒的方法.該方法消除了RNA模板制備過程中最麻煩的環(huán)節(jié)（即RNA 提取和純化），節(jié)省了時間，降低了成本.因此，在海關(guān)等檢疫機構(gòu)檢測植物病毒和無病毒植物組織培養(yǎng)中具有潛在的應用前景.接下來，本研究還會將該方法推廣到大田等自然生長的植物的病毒檢測中.