陳柳，倪征，余斌，華炯鋼，葉偉成，云濤，劉可姝，朱寅初，張存

重組鴨瘟病毒載體中篩選高效表達鴨坦布蘇病毒E蛋白啟動子

陳柳，倪征，余斌，華炯鋼，葉偉成，云濤，劉可姝，朱寅初，張存

（浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，杭州 310021）

鴨瘟和鴨坦布蘇病毒是鴨的兩種重要傳染病，鴨瘟屬于皰疹病毒科，具有開發(fā)成病毒載體的優(yōu)勢。為了優(yōu)化鴨坦布蘇病毒E基因在重組鴨瘟病毒載體中的表達，之前探討了不同形式鴨坦布蘇病毒E蛋白在重組鴨瘟病毒載體中的表達，發(fā)現(xiàn)以鴨為宿主進行密碼子優(yōu)化的E基因C端截短形式（E451-dk，簡稱為Es）表達量最高?！尽刻接懖煌瑔幼訉s 在重組鴨瘟病毒載體中表達的影響，為鴨瘟病毒—坦布蘇病毒二聯(lián)苗的研制奠定基礎。將pCAG、 pSV40、pRSV、p1.8k(MDV)和pgB(MDV)啟動子通過常規(guī)基因克隆的方法替換轉(zhuǎn)移載體pEP-BGH-Es中的pCMV啟動子，構(gòu)建不同啟動子調(diào)控Es表達的重組表達框pro-Es-BGH-pA。在鴨瘟病毒（DEV）疫苗株細菌人工染色體克隆pDEV-EF1的基礎上，將5個重組表達框分別通過“Red E/T兩步重組”克隆至pDEV-EF1突變體的US7和US8基因之間，構(gòu)建了攜帶不同啟動子調(diào)控的Es突變體克隆pDEV-pro-Es。用磷酸鈣法轉(zhuǎn)染雞胚成纖維細胞（CEFs）拯救獲得相應重組病毒rDEV-pro-Es，并對重組病毒感染細胞蝕斑大小和Es蛋白表達情況進行測定。將重組突變體克隆轉(zhuǎn)染細胞拯救獲得了5株重組病毒rDEV-pro-Es。Western blotting分析表明外源蛋白Es在 pRSV調(diào)控下表達量最高，其表達量較rDEV-Es提高了169.12%。完成了Es在重組鴨瘟病毒載體中高效表達啟動子的篩選，獲得了一種調(diào)控Es高效表達的啟動子pRSV。同時也獲得了一株高效表達鴨坦布蘇病毒外源基因Es的重組鴨瘟病毒rDEV-pRSV-Es。

鴨瘟病毒；鴨坦布蘇病毒；E蛋白；細菌人工染色體；病毒載體；啟動子

0 引言

【研究意義】自從2010年發(fā)生以來，鴨坦布蘇病毒（DTMUV）給我國養(yǎng)鴨業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。因為其黃病毒屬性，鴨坦布蘇病毒及其他的水禽TMUV可能納入公共健康關注。因此，關于DTMUV疫苗的研制是非常迫切的。目前，已有商品化的DTMUV滅活疫苗（HB株）和減毒疫苗（WF100株）。這些疫苗各有優(yōu)缺點，滅活苗安全性高、但價格高，而減毒疫苗存在一定安全隱患。鴨瘟是鴨、鵝和其他雁形目禽類的一種急性、熱性、敗血性傳染病。該病流行廣泛，傳播迅速，發(fā)病率和死亡率都高，曾給禽類養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。鴨瘟的防控目前主要靠傳統(tǒng)鴨瘟雞胚化弱毒活疫苗，在水禽生產(chǎn)上廣泛應用，具有免疫效果好、安全性高的特點，還能突破母源抗體的干擾。但不能區(qū)分免疫鴨和自然感染鴨，影響該病的免疫檢測及監(jiān)控。這也是疫苗研究工作者急需解決的問題。分子生物學技術的發(fā)展，疫苗的研究出現(xiàn)了根本性的變化，目前研發(fā)的新型的疫苗主要有基因疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗和載體疫苗等。重組載體疫苗除具有弱毒疫苗的優(yōu)點外，還具有遺傳標記易區(qū)別于野毒、容易研發(fā)新型多聯(lián)多價疫苗的特點，深受研究者的青睞，成為新型獸用疫苗研究的熱點。【前人研究進展】目前，痘病毒、腺病毒、皰疹病毒、慢病毒、腺聯(lián)相關病毒已被廣泛用于疫苗載體的研發(fā)[1-11]。鴨瘟病毒（DEV）除了具有皰疹病毒特性之外，商品化的DEV弱化疫苗株已被廣泛用于DEV的防控。因此，DEV是極佳的用于研發(fā)水禽疫苗的病毒載體候選者。迄今為止，研究者已嘗試以DEV為載體，分別將傳染性法氏囊病病毒、鴨病毒性肝炎病毒I型和III型、新城疫病毒、H5N1亞型禽流感病毒（AIV）、H5N6亞型AIV、H5N8亞型AIV、H9N2亞型AIV、DTMUV、鵝細小病毒、鵝H5亞型禽流感病毒的抗原基因插入至DEV基因組中，用于研發(fā)相關的二聯(lián)疫苗[12-26]。CHEN等分別將前綴信號肽tPAS的DTMUV截短形式的E蛋白（TE）、和與prM串聯(lián)表達的E截短體（prM/TE）插入到DEV疫苗株基因組的US7/US8間，獲得了兩株重組鴨瘟病毒，該病毒感染雞胚成纖維細胞能表達外源蛋白，并能誘導鴨體產(chǎn)生E蛋白抗體，經(jīng)過兩次免疫，rDEV-PrM/TE能完全保護鴨免受DTMUV的攻擊，而rDEV-TE只能保護部分鴨子遭受DTMUV攻毒。該研究顯示，tTPA信號肽的加入增加了E蛋白的表達量及分泌型蛋白的產(chǎn)生[24]。ZOU等以DEV作為載體表達DTMUV全長E基因也取得了成功。重組病毒C-KCE-E能保護鴨免于DEV強毒攻擊，且能產(chǎn)生DTMUV E蛋白中和性抗體[25]。之后，ZOU等又同時將H5N1亞型禽流感病毒 HA和DTMUV prM-E克隆至DEV疫苗株基因組，獲得了重組病毒C-KCE-HA/ PrM-E，該病毒能誘導部分鴨產(chǎn)生針對H5N1亞型AIV和DTMUV的中和性抗體，但同時也能誘導機體產(chǎn)生體液免疫，接種重組病毒能保護鴨免于DEV、H5N1亞型AIV和DTMUV強毒的攻擊[15]。雖然這些研究取得了不錯的成績，但沒有系統(tǒng)性地研究影響外源E基因在重組DEV載體中的因素，前期我們摸索了DTMUV的抗原形式（包括前綴信號肽的E基因、去除跨膜區(qū)的截短的E基因），并對外源抗原密碼子進行優(yōu)化，選中了一種較為優(yōu)化的抗原形式E451-dk (簡稱為Es)?！颈狙芯壳腥朦c】雖然課題組已針對DTMUV E蛋白進行了多方面的優(yōu)化研究，但對于調(diào)控蛋白表達的關鍵因素——啟動子這部分工作還沒有開展。外源基因序列及調(diào)控表達的啟動子等對于調(diào)控外源基因的表達至關重要。LI等以馬立克氏病毒MDV作為活病毒載體表達了傳染性法氏囊病病毒IBDV的VP2蛋白，發(fā)現(xiàn)在Pec啟動子調(diào)控下的VP2表達量較pCMV調(diào)控下的高，且rDEV-Pec-VP2產(chǎn)生的免疫保護能力較rDEV-CMV-VP2更好，說明重組MDV疫苗對IBDV的保護效率與該病毒外源蛋白VP2的表達水平密切相關[27]?！緮M解決的關鍵問題】為了控制和預防鴨坦布蘇病毒感染，本研究擬在前期工作的基礎上，通過更換調(diào)控外源E451-dk（簡稱為Es）蛋白表達的啟動子，從而篩選出一株以鴨瘟病毒疫苗株作為載體Es基因更高效表達的重組鴨瘟病毒，期望獲得一株可以誘導鴨產(chǎn)生DEV和DTMUV兩種病毒中和抗體和對病毒產(chǎn)生免疫保護作用的重組鴨瘟病毒，為研究鴨瘟病毒和鴨坦布蘇病毒二聯(lián)活疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2016年6月至2017年10月在浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所完成。

1.1 菌株、質(zhì)粒和病毒

pCDNA3.1+、pCAGGS-NLS-Cre質(zhì)粒由浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存；pBS448 RSV-gfp-Cre質(zhì)粒購自Addgene公司；pDEV-EF1/GS1783菌株（為攜帶有鴨瘟病毒疫苗株感染性BAC克隆的菌株）和對應的rDEV-EF1病毒株由浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病組研究室構(gòu)建并保存[28-29]；攜帶以鴨為宿主進行密碼子優(yōu)化的DTMUV E451基因（簡稱為Es）的重組質(zhì)粒pEP-BGH-E451-dk（即pEP-BGH-Es）和重組鴨瘟病毒rDEV-Es（即rDEV-pCMV-Es）由浙江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所禽病組研究室構(gòu)建并保存[30]。MDV RISPEN疫苗株購自乾元浩生物股份有限公司。

1.2 主要試劑

KOD酶購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、凝膠純化試劑盒、快速連接試劑盒、Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate化學發(fā)光底物購自于寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；Trans-T1化學感受態(tài)細胞、蛋白分子量Marker（EasySee Western Marker）購自于北京全式金生物技術有限公司；胎牛血清為Gibco BRL公司產(chǎn)品；磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基購自于上海吉諾生物醫(yī)藥有限公司；酶標二抗（HRP標記的山羊抗小鼠IgG、HRP標記的山羊抗兔IgG）購于Santa Cruz公司；GFP單抗購于碧云天生物技術公司。蛋白濃縮超濾管（30k）購于millipore公司；小鼠抗雞beta-actin單克隆抗體購自Sigma。

1.3 細胞

取9—11日齡SPF雞胚采用胰蛋白酶消化法[31]制備雞胚成纖維細胞（CEFs）。SPF雞胚由浙江省農(nóng)業(yè)科學院良種家禽孵化基地提供。

1.4 TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體的制備

TUMV E蛋白DⅢ結(jié)構(gòu)域抗原由本課題組制備[32]，按常規(guī)方法免疫兔制備兔抗DIII多克隆抗體，以純化的DIII蛋白作為抗原包被酶標板，采用間接ELISA方法測定抗體效價。DEV UL44多克隆抗體制備方法同上，采用原核表達法制備抗原，所用引物為Dev UL44（BamHI+）和Dev UL44 （XhoI-）引物對（表1）。純化抗原免疫小鼠制備鼠抗UL44多克隆抗體，采用間接ELISA方法測定抗體效價。

1.5 引物設計及合成

本文所用引物見表1：pCAG（MluI+）/ PCAG （NheI-）引物對用于以pCAGGS-NLS-Cre為模板擴增pCAG基因；pRSV（BglII+）/pRSV（NheI-）用于以pBS448 RSV-gfp-Cre質(zhì)粒為模板擴增pRSV基因；pSV40（MluI+）/pSV40（（NheI-）用于以pCDNA3.1+為模板擴增pSV40基因；F（MDV p1.8k BglII+）/R（MDV p1.8k NheI-）用于以MDV RISPEN病毒DNA為模板擴增MDV 1.8k基因啟動子（p1.8k）；F（MDV gB BglII+）/ R（MDV gB NheI-）用于以MDV RISPEN病毒DNA為模板擴增MDV gB啟動子（pgB）。pDEV vac-in-s和pDEV vac-in-as用于分別將表達框pCAG- Es-BGH-pA、pRSV-Es-BGH-pA和pSV40-Es-BGH-pA插入到DEV基因組的US7和US8基因之間；pDEV vac-in-s（p1.8k，pgB）和pDEV vac-in-as用于分別將表達框p1.8k（MDV）-Es-BGH-pA、pgB（MDV）-Es-BGH- pA插入到DEV基因組的US7和US8基因之間。下劃線部分與pEP-pro-Es上序列同源，可以從pEP-pro-Es擴增出含有外源基因表達框及Kan篩選基因的片段，加粗序列分別與位于DEV US7和US8基因間插入位點上、下游序列同源，用于引入同源重組臂。DEV-tk-F/DEV-tk-R和JD-F/JD-R為鑒定引物對，前者用于擴增DEV基因、后者用于驗證外源基因是否正確插入到BAC基因組中。

1.6 pEP-pro-Es質(zhì)粒的構(gòu)建

采用表1引物進行PCR擴增獲得的pCAG、pSV40、pRSV、pgB（MDV）和p1.8k（MDV）基因，在5′和3′端分別引入了酶切位點，將片段用對應的酶進行雙酶切之后插入到pEP-BGH-Es相應的酶切位點中，從而分別用pCAG、pSV40、pRSV、pgB（MDV）和p1.8k（MDV）替換pEP-BGH-Es上的pCMV啟動子，構(gòu)建不同啟動子調(diào)控Es基因的質(zhì)粒。通過PCR和酶切鑒定篩選獲得陽性克隆，送上海博尚生物公司測序，獲得陽性克隆分別命名為pEP-pCAG-Es、pEP-pSV40-Es、pEP-pRSV-Es、pEP-pgB（MDV）-Es和pEP-p1.8k（MDV）- Es（總稱為pEP-pro-Es）。

表1 本文所用引物

加粗序列分別與位于DEV US7和US8基因間插入位點上、下游序列同源，用于引入同源重組臂；下劃線部分與pEP-pro-Es上序列同源；斜體部分為引入酶切位點

The bold sequences are homologous to the sequences located at the intergene insertion sites of DEV US7 and US8, which introduces homologous recominant arms; the underlined sequences are homologous to the sequence on pEP-pro-Es;and the restriction enzyme recognition sequences are italicized

1.7 重組鴨瘟病毒突變體BAC克隆的構(gòu)建

各重組鴨瘟突變體BAC克隆通過“Red E/T兩步重組”[33-34]獲得。以pEP-pro-E451-dk質(zhì)粒為模板，用引物對pDEV vac-in-s/pDEV vac-in-as或pDEV vac-in-s（p1.8k，pgB）/pDEV vac-in-as （序列見表1）擴增長度為3 191—4 493 bp不等的PCR片段，將PCR片段電轉(zhuǎn)化至pDEV-EF1/GS1783感受態(tài)細胞，PCR片段通過自身序列上的DEV基因組同源臂將pro-Es-BGH-pA表達框和篩選基因卡那霉素（Kan）插入到pDEV-EF1。獲得的重組BAC克隆用I酶切鑒定，篩選到含Kan標記的重組BAC克隆中間體pDEV-pro-kan.Es。之后通過pEP-BGH-Es質(zhì)粒載體上自身攜帶的同源序列將Kan基因去除，獲得只含有pro-Es-BGH-pA表達框的重組子。抽提重組子BAC DNA，通過I酶切，篩選出正確克隆（pDEV-pro- Es）。最后采用鑒定引物對DEV-tk-F/DEV-tk-R和JD-F /JD-R（序列見表1）進行PCR擴增，將擴出片段送出測序。

1.8 重組病毒的拯救

采用堿裂解法抽提各個pDEV-pro-Es，依照磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒操作說明轉(zhuǎn)染CEFs，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待出現(xiàn)70%—80%熒光斑之后收集細胞及上清，即為拯救的病毒液，分別命名為rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV-Es、rDEV-pgB（MDV）-Es、rDEV-p1.8k（MDV）-Es（總稱為rDEV-pro-Es）。

1.9 重組病毒蝕斑大小的測定

將rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV- Es、rDEV-pgB（MDV）-Es、rDEV-p1.8k（MDV）-Es、rDEV-Es及rDEV-EF1病毒液稀釋接種于單層CEFs上，90 min后用PBS（pH7.2）洗滌一次，鋪上1.5%的甲基纖維素，置于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，在熒光顯微鏡下將每種病毒熒光蝕斑各拍100張，用Image J軟件測量病毒的蝕斑面積，并計算出平均值，以rDEV-EF1病毒株蝕斑面積為參考，將其面積設定為100%，以之為標準將其他株病毒蝕斑面積換算成百分比。用SPSS11.5軟件對這些數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.10 TUMV E蛋白DIII和DEV UL44多克隆抗體效價測定

經(jīng)間接ELISA法測得兔抗TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體效價和小鼠抗DEV UL44多克隆抗體效價皆為1﹕64 000。

1.11 蛋白表達分析

分別接種rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV-Es、rDEV-pgB（MDV）-Es、rDEV-p1.8k （MDV）-Es和rDEV-Es及對照毒株rDEV-EF1[2]于CEFs細胞中，培養(yǎng)至細胞出現(xiàn)90%以上熒光，收集細胞培養(yǎng)液上清，同時用PBS（pH7.2）洗滌細胞，收獲細胞沉淀。收集的培養(yǎng)液上清采用millipore的蛋白超濾管（30k）進行100倍濃縮，將收集的細胞及上清樣品用上樣緩沖液處理后，進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素NC膜上，轉(zhuǎn)膜樣品制備3份。取出NC膜，放入含10%脫脂牛奶的封閉液中4 ℃過夜。一份以兔抗TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體（1﹕500稀釋）和鼠源GFP單抗（1﹕1 000稀釋）作為一抗，一份以小鼠抗DEV UL44多克隆抗體（1﹕500稀釋），另一份以小鼠抗beta-actin單克隆作為一抗（1﹕1 000稀釋）；二抗對應的采用HRP標記的山羊抗鼠IgG（1﹕5 000稀釋）和HRP標記的山羊抗兔（1﹕5 000稀釋）于37℃孵育1 h，最后用Western BLoT Chemiluminescence HRP Substrate化學發(fā)光底物進行顯色，并置于凝膠成像儀進行條帶曝光。

2 結(jié)果

2.1 重組鴨瘟病毒BAC突變體克隆的鑒定

分別提取各重組鴨瘟病毒BAC突變體克隆及Kan中間體，用I酶切，電泳鑒定（圖 1）。結(jié)果表明DNA電泳圖譜和以GenBank（登錄號KF487736.1）收錄的鴨瘟病毒參考序列進行預測的基本一致。電泳及測序結(jié)果也表明，以DEV-tk-F和DEV-tk-R、JD-F和JD-R引物對擴出的PCR片段（電泳圖見圖2）與預期一致，說明外源基因已按照預期插入鴨瘟病毒疫苗株基因組中。

1: pDEV-EF1; 2: pDEV-Es; 3: pDEV-kan. pRSV. Es; 4: pDEV-pRSV. Es; 5: pDEV-kan.pSV40. Es; 6: pDEV-pSV40. Es; 7: pDEV-kan.pCAG. Es; 8: pDEV-pCAG. Es; 9: pDEV-kan.p1.8k(MDV). Es; 10: pDEV-p1.8k (MDV). Es; 11: pDEV-kan.pgB(MDV). Es; 12: pDEV-pgB(MDV). Es

泳道1—6 是以DEV-tk-F和DEV-tk-R引物對擴增片段；7—12 是以JD-F和JD-R引物對擴增片段。M1：DL2000(2000，1000, 750, 500, 250, 100 bp); 1. pDEV-EF1 (553 bp); 2. pDEV-pSV40. Es (553 bp); 3. pDEV- pRSV. Es (553 bp); 4. pDEV-pCAG. Es(553 bp); 5. pDEV-p1.8k (MDV). Es (553 bp); 6. pDEV-pgB(MDV). Es (553 bp); M2: 250 bp marker(4500, 3000, 2250, 1500, 1000, 750, 500, 250 bp); 7. pDEV-EF1(641 bp); 8. pDEV-pSV40. Es(2747 bp); 9. pDEV-pRSV. Es(2745 bp); 10. pDEV- pCAG. Es(3989 bp); 11. pDEV-p1.8k(MDV). Es (2687 bp);12. pDEV-pgB (MDV). Es (3037 bp)

2.2 重組病毒的拯救

轉(zhuǎn)染細胞48 h后于熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染孔內(nèi)出現(xiàn)熒光蝕斑，繼續(xù)培養(yǎng)至70%—80%細胞出現(xiàn)熒光蝕斑之后收集細胞和上清，即為拯救重組病毒（圖3）。

2.3 病毒蝕斑面積測定

病毒蝕斑面積測定表明，與rDEV-EF1相比，rDEV- Es、rDEV-pCAG-Es、rDEV-pSV40-Es、rDEV-pRSV-Es蝕斑面積分別較rDEV-EF1減少了35.26%、15.61%、10.22%、11.41%，而rDEV-p1.8k（MDV）-Es 和rDEV- pgB（MDV）-Es蝕斑面積分別較rDEV-EF1增加了21%和35.66%（圖4）。

圖3 拯救重組病毒

圖4 各重組病毒在細胞上的蝕斑面積測定和比較

2.4 外源蛋白Es表達分析

將各重組毒株感染CEFs，分別收集細胞和50倍濃縮的細胞培養(yǎng)液上清，將細胞樣品進行SDS-PAGE電泳及轉(zhuǎn)膜，做3份重復，分別以兔抗TUMV E蛋白DIII結(jié)構(gòu)域多克隆抗體、小鼠抗GFP單克隆抗體和小鼠抗DEV UL44多克隆抗體、小鼠抗beta-actin單克隆抗體作為一抗，進行Western blotting檢測，結(jié)果表明以小鼠抗GFP單克隆抗體和小鼠抗DEV UL44多克隆抗體作為一抗檢測的膜在進rDEV-Es、rDEV- pRSV-Es、rDEV-pCAG-Es感染的細胞樣品在約49—52kD處顯出特異性目的蛋白條帶（圖5-A），在28 kD處顯示出內(nèi)參GFP條帶，與預測基本一致，說明蛋白獲得了表達。其他參考蛋白beta-actin、UL44皆在相應位置顯出了條帶。以beta-actin為內(nèi)參，用Image J軟件分析各樣品表達條帶灰度值比值（Es/beta-actin），結(jié)果表明含pCMV、pCAG、pRSV所表達的蛋白強度比值分別是1.367、0.698和3.679，說明pRSV啟動子活性最強，rDEV-pRSV- Es感染細胞中Es蛋白表達量較rDEV-Es提高了169.12%（圖5-A）。細胞培養(yǎng)上清樣品中明顯檢測到GFP的表達，但未檢測到目的蛋白和病毒蛋白UL44（圖5-B）。

1: rDEV-Es; 2: rDEV-pSV40-Es; 3: rDEV-pCAG-Es; 4: rDEV-pRSV-Es; 5: rDEV-p1.8(MDV) -Es; 6: rDEV-pgB(MDV)-Es; M: EasySee Western Marker (90, 75, 60,40, 25 kD); 7: rDEV-EF1

3 討論

感染性細菌染色體克?。˙ACs）是皰疹病毒基因組操作的最主要的平臺，基于該平臺，國內(nèi)外學者廣泛開展了皰疹病毒基因缺失疫苗和重組活載體疫苗的研究，目前馬立克氏病毒（MDV）和偽狂犬病毒（PRV）的基因缺失疫苗和重組活載體疫苗已經(jīng)獲得了成功，并廣泛用于實際生產(chǎn)中。課題組曾將鴨瘟病毒疫苗株基因組插入到BAC質(zhì)粒構(gòu)建了鴨瘟病毒全基因組的感染性克隆，獲得了DEV疫苗株的反向遺傳系統(tǒng)[24]，嘗試將以雞為宿主進行密碼子優(yōu)化的DTMUV E基因插入到DEV的反向遺傳系統(tǒng)，但外源基因E的表達水平不高[25]。之后又摸索了E基因的表達形式，包括是否前綴信號肽、是否去掉跨膜區(qū)、是否進行基因優(yōu)化和以哪個宿主密碼子為參考進行基因優(yōu)化效果最佳都進行了摸索，篩選到了一種E蛋白表達量較高的E基因的表達形式（即去掉跨膜區(qū)、以鴨為宿主進行密碼子優(yōu)化的E451基因）[30]。

本研究中選用了幾種常用的啟動子：巨細胞病毒CMV早期啟動子（pCMV）、猿猴病毒SV40的早期啟動子（pSV40）、Rous肉瘤病毒RSV啟動子（pRSV）、復合啟動子pCAG、雞源病毒MDV 1.8k基因（p1.8k（MDV））和gB基因啟動子（pgB（MDV）），其中，pCMV和pRSV調(diào)控E蛋白表達的效果最佳，究其原因，可能CMV與DEV同屬皰疹病毒科；RSV天然宿主為雞，因此更適合。本研究中幾株病毒的蝕斑面積較親本毒株或多或少都有些波動，說明啟動子影響了病毒在細胞間的傳播能力，但啟動子的替換不影響病毒在細胞上的增殖及在細胞間的傳播。

是否外源基因的表達水平與抗體生成水平有關，目前存在著一定的爭議。LI等[27]、TSUKAMOTO等[35]的研究表明強啟動子更有利于外源基因的表達，且外源基因的表達量與誘導機體產(chǎn)生的抗體水平成正相關性，高水平的抗體更利于機體對強毒株的免疫保護。但也有相反的研究結(jié)論，MA等的研究表明外源蛋白表達水平過高，會與母源抗體發(fā)生中和，從而使得外源蛋白抗體水平下降，反而導致免疫保護效果不佳[36]。綜上，以DEV作為載體表達外源蛋白需要維持外源蛋白表達量到一個度，太低不足以誘導機體產(chǎn)生抗體，太高要么會有毒性要么會和抗體相中和。此外，本研究選用的是去除跨膜區(qū)的E基因的截短形式，最新的研究表明截短形式的E蛋白依然能保護青年鴨免受DTMUV強毒的攻擊[37]。DEV和DTMUV共同的自然宿主是鴨和鵝，而本試驗是在雞源細胞上開展的，是否在其他宿主細胞或者宿主體內(nèi)蛋白表達量會有差異，需要進一步研究。至于重組病毒rDEV- pRSV-Es以及其他幾株病毒免疫效果如何最終需要通過后續(xù)的動物試驗進行綜合評價。

4 結(jié)論

本研究成功篩選獲得了一種調(diào)控鴨坦布蘇病毒Es在重組鴨瘟病毒載體中高效表達的啟動子pRSV。同時也獲得了一株高效表達鴨坦布蘇病毒外源基因Es的重組鴨瘟病毒rDEV-pRSV-Es。該研究為鴨瘟病毒—坦布蘇病毒二聯(lián)苗的研制奠定了基礎。

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Optimized Promoter Regulating of Duck Tembusu Virus E Protein Expression Delivered by a Vectored Duck Enteritis Virus

CHEN Liu, NI Zheng, YU Bin, HUA JiongGang, YE WeiCheng, YUN Tao, LIU KeShu, ZHU YinChu, ZHANG Cun

(Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021)

【】 Duck enteritis virus (DEV) and duck Tembusu virus (DTMUV) are considered to be two of the important viruses that infected ducks. DEV is classified into the familywhich has the characterization of live viral vector. 【】In our previous study, a recombinant DEV delivering optimized DTMUV E451 gene (E451-dk) referring to duck’s codon usage bias has been selected. In this study, the promoter regulating E451-dk (Es in short) in rDEV-EF1 was also evaluated for enhancing E451-dk expression level. 【】The transfer vector pEP-BGH-pro-Es were constructed by separately substituted pCMV (cytomegalovirus major immediate-early promoter) on the vector pEP-BGH-Es with pCAG (human cytomegalovirus enhancer and chicken-actin promoter), pSV40 (the simian virus 40 promotor), pRSV(Rous sarcoma virus (RSV) promoter), pgB（MDV）(marek's disease virus (MDV) gB gene promoter) and p1.8k（MDV）(MDV 1.8k gene promoter). The recombinant DEV BAC clone pDEV-pro-Es carrying pro-Es genes were generated by two-step Red E/T recombination in. pDEV-pro-Es were constructed by inserting pro-Es expression cassette between DEV US7 and US8 genes on the infectious clone of DEV (pDEV-EF1). The recombinant virus rDEV-pro-Es (rDEV-pCAG-Es, rDEV-pSV40-Es, rDEV-pRSV-Es, rDEV-pgB(MDV)-Es and rDEV-p1.8k(MDV)-Es) were rescued from chicken embryo fibroblasts (CEFs) by calcium phosphate precipitation. The plaque size and expression of DTMUV Es in recombinant virus-infected CEFs were analyzed. 【】 All viruses were successfully rescued from CEFs. Western blot analysis showed that the expression level of Es in rDEV-pRSV-Es -infected cells was increased 169.12% compared to that of rDEV-Es -infected cells. 【】pRSV was the highest effective promoter chosen in this study which regulating Es expression on recombinant DEV genome backbone. These studies laid a foundation for developing bivalent vaccine controlling DEV and DTMUV infection.

duck enteritis virus; duck Tembusu virus; E protein; bacterial artificial chromosome; viral vector; promoter

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.015

2020-01-17；

2020-07-29

國家自然科學基金面上項目（31670150）、國家重點研發(fā)計劃（2016YFD0500107）、浙江省公益技術應用研究項目（2016C32070）

陳柳，Tel：0571-86404257；E-mail：haoliuzi@126.com。通信作者張存，Tel：0571-86404182；E-mail：zhangcun@aliyun.com

（責任編輯 林鑒非）