許從峰，趙鐸，王海鵬，申貴男，袁媛，高亞梅，魏丹，晏磊，王偉東

（1.黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，大慶 163319；2.北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所）

牛糞中經(jīng)過(guò)瘤胃未消化的粗纖維占總固形物含量的50%以上，難于被厭氧微生物直接利用，致使牛糞厭氧發(fā)酵速度差異明顯，整體發(fā)酵效率低，不利于生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-2]。用螺旋機(jī)對(duì)糞污進(jìn)行固液分離預(yù)處理，能有效減少分離液中粗纖維和COD含量，降低黏度，使其成為厭氧發(fā)酵的優(yōu)勢(shì)原料，是規(guī)?；膛?chǎng)糞便預(yù)處理的普遍措施[3-4]。

混合厭氧發(fā)酵是一種將兩種或兩種以上的發(fā)酵物料放入同一厭氧發(fā)酵裝置內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵的方式，不同性質(zhì)的物料混合可以為微生物提供均衡的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、微量元素[5-7]，克服單一發(fā)酵原料產(chǎn)氣慢、發(fā)酵效率低等缺點(diǎn)[8-9]，是農(nóng)業(yè)廢棄物資源化的研究熱點(diǎn)之一。厭氧發(fā)酵主要包括：水解酸化階段、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸階段和產(chǎn)甲烷階段，其中水解酸化階段是厭氧發(fā)酵的主要限速步驟[10-11]，混合物料能調(diào)節(jié)發(fā)酵起始階段底物的酸堿度，增強(qiáng)緩沖能力，使產(chǎn)氣高峰提前[12-13]。一般認(rèn)為，發(fā)酵原料的C/N 在25 左右最適宜微生物的生長(zhǎng)[14-16]，秸稈的C/N 偏高，牛糞分離液偏低，將不同物料混合能顯著改善C/N，促進(jìn)木質(zhì)纖維素的降解，提高發(fā)酵潛力[17]。雖然發(fā)酵原料中的碳素最終轉(zhuǎn)化為CO2和CH4，但是微生物是整個(gè)過(guò)程中主要的執(zhí)行者，它的功能和活性與甲烷產(chǎn)量密不可分，混合發(fā)酵有助于揮發(fā)性脂肪酸的積累[18]，增加微生物多樣性，有利于厭氧發(fā)酵的進(jìn)行[19]。試驗(yàn)選取牛糞分離液和玉米秸稈作為原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵批次試驗(yàn)，探討牛糞分離液不同添加量對(duì)分離液與玉米秸稈混合發(fā)酵產(chǎn)沼氣能力及纖維素、半纖維素和木質(zhì)素降解效果的影響，為牛糞分離液和玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵的研究提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)所用牛糞分離液取自黑龍江省安達(dá)市某牧場(chǎng)；玉米秸稈取自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗(yàn)基地，秸稈自然風(fēng)干，粉碎至約5 mm 后置于干燥處備用；接種物取自黑龍江省寒區(qū)環(huán)境微生物與農(nóng)業(yè)廢棄物資源化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期運(yùn)行的常溫厭氧發(fā)酵罐。原料的性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵原料的性質(zhì)Table 1 The properties of fermentation materials

1.2 批次厭氧發(fā)酵體系建立

試驗(yàn)裝置采用1 L 自制厭氧發(fā)酵瓶，瓶口處用硅膠塞密封，硅膠塞處出氣口與3 L 集氣袋相連，用于沼氣的收集。試驗(yàn)采用批次厭氧發(fā)酵，設(shè)置發(fā)酵總體積為700 mL，其中接種物占總體積的50%，牛糞分離液添加量設(shè)置0、50、150、250 mL 共4 個(gè)處理（記為A 組、B 組、C 組、D 組），分別添加玉米秸稈調(diào)整總TS 為8%，發(fā)酵體積不夠用蒸餾水補(bǔ)齊，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，共12 個(gè)處理，在（37±1 ℃）恒溫室內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，每隔24 h 手動(dòng)搖瓶5 min，沼氣和甲烷產(chǎn)量利用GA2000 沼氣分析儀（Geotech Biogas Check）測(cè)定。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 總固體含量和揮發(fā)性固體含量測(cè)定

總固體含量（Total Solids，TS）和揮發(fā)性固體含量（Volatile solids，VS）：采用烘干法和灼燒法進(jìn)行測(cè)定[20]，首先將待測(cè)材樣品放入電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE）中，105 ℃烘8 h 至恒重，冷卻稱重，記錄數(shù)據(jù)，然后將烘干后的樣品放入馬弗爐（KSY-6-16A）中，500 ℃灼燒3 h 至恒重，冷卻稱重，記錄數(shù)據(jù)。TS 和VS 的計(jì)算公式如下：

注：m0為坩堝重量；m1為烘干前樣品與坩堝總重；m2為烘干后樣品與坩堝總重；m3為灼燒后殘留物與坩堝總重。

1.3.2 木質(zhì)纖維素含量測(cè)定

利用FIWE3/6 纖維素測(cè)定儀（北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司）采用范式法（Van Soest）測(cè)定木質(zhì)纖維素含量[21]。首先將發(fā)酵后的樣品置于電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干，用植物粉碎機(jī)（FZ102）粉碎至40 目，稱取1 g 樣品（精度為1 mg），置于烘干的坩堝內(nèi)，根據(jù)纖維素測(cè)定儀操作手冊(cè)可測(cè)定酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）、中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗滌木質(zhì)素（Acid detergent lignin，ADL）測(cè)定。計(jì)算方法為：纖維素含量=ADF-ADL，半纖維素含量=NDF-ADF，ADL 即為木質(zhì)素含量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、Origin 8.1 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和繪圖。利用SPSS.20 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One way ANOVA，Turkey 法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)日產(chǎn)沼氣量和累積產(chǎn)沼氣量的影響

如圖1 所示，所有處理組均在第1 d 達(dá)到產(chǎn)氣高峰，其中B 組日產(chǎn)沼氣量最高，為1 785 mL，D 組日產(chǎn)沼氣量最低，為1 410 mL，第2 d 顯著下降，第3 d開(kāi)始上升，A 組、B 組、C 組、D 組分別在第5、5、4、3 d達(dá)到第二產(chǎn)氣高峰，高峰期日產(chǎn)沼氣量分別為733、783、827、793 mL，隨后一直呈下降趨勢(shì)。從圖2 所知，各處理組累積產(chǎn)沼氣量呈先上升后下降的趨勢(shì)，其中C 組累積產(chǎn)沼氣量最高，為6 283 mL，A 組累積產(chǎn)沼氣量最低，為5 893 mL，比C 組降低6.21%，各處理組之間累積產(chǎn)沼氣量差異不顯著。根據(jù)以上結(jié)果可知，牛糞分離液與玉米秸稈混合處理組相較于未添加分離液處理組能有效提前產(chǎn)沼氣高峰期，提高日產(chǎn)沼氣量，提升累積產(chǎn)沼氣量，隨著分離液添加量的上升，最高日產(chǎn)沼氣量和累積產(chǎn)沼氣量有所下降。

圖1 不同處理日產(chǎn)沼氣量Fig.1 Daily biogas yield in different treatment

圖2 不同處理累積產(chǎn)沼氣量Fig.2 Cumulative biogas production in different treatment

2.2 不同處理對(duì)單日甲烷含量和日產(chǎn)甲烷量的影響

由表2 所示，所有處理組的單日甲烷含量均呈先上升后趨于穩(wěn)定，隨后下降的趨勢(shì)，A 組、B 組、C組、D 組分別在第5、6、5、4 d 達(dá)到含量最高值，依次為59.60%、60.77%、62.40%和62.30%，其中B 組單日甲烷含量?jī)H在第9 d 顯著高于A 組，C 組單日甲烷含量分別在第2、3、4、7、8、9 d 顯著高于A 組，D 組單日甲烷含量分別在第1、2、3、4、7 d 顯著高于A 組，單日甲烷含量均值從大到小依次為C 組＞D 組＞B組＞A 組，分別為48.27%、47.55%、43.93%和42.91%，C組和D 組顯著高于A 組和B 組。牛糞分離液與秸稈混合后對(duì)單日甲烷含量最高值影響不顯著，對(duì)單日甲烷含量影響顯著。日產(chǎn)甲烷量的趨勢(shì)為先上升后下降（如圖3 所示），其中A 組和B 組在第5 d 達(dá)到產(chǎn)甲烷高峰，分別為446 mL 和484 mL，C 組和D 組在第4 d 達(dá)到產(chǎn)甲烷高峰，分別為481 mL 和451 mL。根據(jù)以上結(jié)果可知，牛糞分離液與玉米秸稈混合厭氧發(fā)酵能有效提前產(chǎn)甲烷高峰，提高日產(chǎn)甲烷量。

2.3 不同處理對(duì)累積產(chǎn)甲烷量和TS 產(chǎn)甲烷率的影響

從圖4 可知，各處理組累積產(chǎn)甲烷量趨勢(shì)呈先上升后下降，跟累積產(chǎn)沼氣量趨勢(shì)相同，其中C 組累積產(chǎn)甲烷量最高，為2 806 mL，A 組累積產(chǎn)甲烷量最低，為2 113 mL，比C 組降低24.69%，不同處理組累積產(chǎn)甲烷量大小順序?yàn)镃 組＞D 組＞B 組＞A 組。如圖5 所示，各處理TS 產(chǎn)甲烷率的趨勢(shì)呈先上升后下降，其中A 組TS 產(chǎn)甲烷率最低，為106 mL·g-1，C 組TS產(chǎn)甲烷率最高，為134 mL·g-1，比A 組提高20.89%。牛糞分離液中含有足夠的氮源，與玉米秸稈混合后可有效調(diào)節(jié)C/N，顯著提升厭氧發(fā)酵的產(chǎn)甲烷效率，提高發(fā)酵潛力。

表2 不同處理單日甲烷含量Table 2 The methane content daily in different treatment

圖3 不同處理日產(chǎn)甲烷量Fig.3 Daily methane yield in different treatment

圖4 不同處理累積產(chǎn)甲烷量Fig.4 Cumulative methane production in different treatment

圖5 不同處理TS 產(chǎn)甲烷率Fig.5 The methane production rate of TS in different treatment

2.4 不同處理對(duì)木質(zhì)纖維素降解率的影響

對(duì)不同處理木質(zhì)纖維素降解率進(jìn)行測(cè)定，由圖6可知，隨著牛糞分離液添加量的增加，纖維素降解率為先上升后下降趨勢(shì)，其中C 組纖維素降解率最高，達(dá)到77.39%，表明牛糞分離液與玉米秸稈適當(dāng)混合有利于纖維素的降解，分離液添加量過(guò)多會(huì)抑制纖維素的降解。半纖維素降解率整體呈上升趨勢(shì)，A 組降解率最低為69.38%，D 組降解率最高，為78.85%，牛糞分離液的添加有利于半纖維素的降解，各處理組半纖維素降解率差異不顯著。木質(zhì)素降解率呈先下降后上升的趨勢(shì)，其中D 降解率最高，為31.07%，C 組纖維素最低，為7.64%。木質(zhì)素降解趨勢(shì)與纖維素的降解趨勢(shì)相反，可能是由于隨著分離液添加量的增加，發(fā)酵體系的C/N 不同，導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中各處理組纖維素降解菌和木質(zhì)素降解菌的比例發(fā)生變化，進(jìn)而引起纖維素和木質(zhì)素降解趨勢(shì)產(chǎn)生差異。

圖6 不同處理木質(zhì)纖維素降解率Fig.6 The degradation rate of lignocellulose in different treatment

3 討論

試驗(yàn)中，對(duì)發(fā)酵原料進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄嚢栌欣诹弦悍植季鶆?，使微生物與發(fā)酵原料充分接觸，為甲烷菌提供充足的代謝底物[22]，提升甲烷產(chǎn)量，在實(shí)際發(fā)酵工程中，攪拌速率和攪拌時(shí)間對(duì)沼氣提升的具體影響還需進(jìn)一步研究。在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，隨著牛糞分離液添加量的增加，日產(chǎn)沼氣高峰提前，添加量達(dá)到150 mL 時(shí)累積產(chǎn)沼氣量和累積產(chǎn)甲烷量達(dá)到最大值，當(dāng)添加量增加至250 mL 時(shí)兩者均出現(xiàn)下降，玉米秸稈中含有豐富的木質(zhì)纖維素，其碳素含量偏高，經(jīng)過(guò)固液分離預(yù)處理的牛糞分離液中含有大量的氮素，將牛糞分離液與玉米秸稈混合發(fā)酵能顯著改善C/N，促進(jìn)秸稈中木質(zhì)纖維素的降解和分離液中氮素的轉(zhuǎn)化，有利于提高沼氣產(chǎn)量，促進(jìn)厭氧發(fā)酵的進(jìn)行，同時(shí)分離液添加量過(guò)多可能會(huì)造成發(fā)酵體系中氮素過(guò)剩，C/N 失衡，底物中可利用營(yíng)養(yǎng)成分不足，抑制厭氧微生物的代謝能力[23]，導(dǎo)致甲烷累積產(chǎn)量下降。試驗(yàn)中各處理組累積產(chǎn)沼氣量差異不顯著，而累積產(chǎn)甲烷量差異顯著，表明添加分離液的處理通過(guò)影響甲烷含量提升了產(chǎn)甲烷效果。由于固液分離的工藝不同，分離液的TS 相差較大[24]，試驗(yàn)牛糞分離液取自規(guī)?；膛?chǎng)，與在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的手動(dòng)固液分離相比更接近實(shí)際生產(chǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中分離液的具體添加量還需考慮溫度、原料種類、分離液TS 和經(jīng)濟(jì)成本等多方面因素[25]。

余少杰等[26]研究外部添加氮源對(duì)玉米秸稈厭氧發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)適量的氮源能有效促進(jìn)木質(zhì)纖維素的降解，同時(shí)氮源過(guò)多會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵體系易酸化，抑制相關(guān)微生物的生長(zhǎng)，纖維素類物質(zhì)降解率下降，這與試驗(yàn)研究結(jié)果相似。秸稈厭氧發(fā)酵中木質(zhì)纖維素是主要的有機(jī)質(zhì)來(lái)源，適當(dāng)?shù)奶砑拥茨艽龠M(jìn)發(fā)酵體系的營(yíng)養(yǎng)平衡，提升細(xì)菌的豐度與多樣性，尤其是與纖維素類物質(zhì)降解有關(guān)的菌株[27]，能有效加速木質(zhì)纖維素的分解轉(zhuǎn)化，為甲烷菌提供足夠的代謝所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[28]。木質(zhì)纖維素的降解效果是評(píng)價(jià)發(fā)酵效果的一個(gè)單純指標(biāo)，我們認(rèn)為厭氧發(fā)酵中涉及多種纖維素降解微生物與復(fù)雜的代謝過(guò)程，或者僅涉及少量的功能微生物參與代謝，不同發(fā)酵條件下木質(zhì)纖維素降解與發(fā)酵效果的聯(lián)系還需進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

（1）在溫度為37 ℃，發(fā)酵總體積為700 mL，接種物占總體積的50%，TS 為8%為發(fā)酵條件下，牛糞分離液添加量為150 mL 處理組累積產(chǎn)沼氣量和累積產(chǎn)甲烷量最高。

（2）牛糞分離液和秸稈混合厭氧發(fā)酵能有效促進(jìn)纖維素類物質(zhì)的降解，提高甲烷含量和產(chǎn)甲烷潛力。