宋佳露 程星凱 劉鵬飛 劉西莉

摘要 ：近年來，隨著殺菌劑在農(nóng)作物病害田間防治中的大量使用，植物病原菌的多藥抗性（multidrug resistance，MDR）現(xiàn)象發(fā)生越來越普遍。本文綜述了在草坪幣斑病、灰霉病、小麥葉枯病和蘋果青霉病等病害防治中，病原菌對殺菌劑多藥抗性發(fā)生的情況。以及在紫外誘導和殺菌劑離體馴化下，致病疫霉Phytophthora infestans、立枯絲核菌Rhizoctonia solani、指狀青霉Penicillium digitatum的多藥抗性發(fā)生情況。分析了導致植物病原菌多藥抗性產(chǎn)生的外排轉(zhuǎn)運蛋白過表達、解毒酶代謝和靶標位點變化等相關機制，并在此基礎上提出了多藥抗性預防和治理的策略，以期為田間殺菌劑的高效利用，延緩藥劑的抗性風險提供科學參考。

關鍵詞 ：植物病原菌; 多藥抗性; 抗性機制; 抗性治理

中圖分類號：

S 481.4

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020413

Current situation of multidrug resistance of plant pathogens to fungicides

SONG Jialu1，2， CHENG Xingkai1， LIU Pengfei1*， LIU Xili1

（1. Key Lab of Pest Monitoring and Green Management， Ministry of Agriculture and Rural Affairs，

College of Plant Protection， China Agricultural University， Beijing 100193， China; 2. College

of Agriculture and Biotechnology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China）

Abstract

In recent years， the phenomenon of multidrug resistance （MDR） in plant pathogens has become more and more common due to the heavy use of fungicides.In this article， the occurrence of multidrug resistance of pathogens to fungicides in the control of dollar spot， gray mold， wheat leaf blotch and blue mold were reviewed.MDR also occurred in Phytophthora infestans， Rhizoctonia solani and Penicillium digitatum under in vitro induction with UV and fungicides.The relevant mechanisms such as efflux transporter over-expression， detoxification enzyme metabolism and target site changes caused by MDR of plant pathogens were analyzed.Based on the above， the strategies for prevention and management of MDR were proposed in order to offer a scientific reference for efficient use of fungicides and reduce the risk of fungicides resistance.

Key words

plant pathogens; multidrug resistance; resistance mechanism; resistance management

在有害生物綜合治理的各項措施中，對植物病害的防治仍以化學殺菌劑作用最迅速、高效而穩(wěn)定。但在實際生產(chǎn)中，也存在殺菌劑使用不當?shù)那闆r，如頻繁而大量地使用殺菌劑導致植物病原菌產(chǎn)生嚴重抗藥性。當病原菌對某一殺菌劑產(chǎn)生抗性時，對其他未接觸過的殺菌劑也表現(xiàn)出抗性的現(xiàn)象，稱為交互抗性（cross-resistance）。通常情況下，病原菌對同類殺菌劑可能具有相同的抗性機制，因而易表現(xiàn)為交互抗性，也可能對兩種或兩種以上不同作用機制的殺菌劑同時表現(xiàn)為抗性，即發(fā)生了多藥抗性（multidrug resistance）[1]。目前已報道有多種植物病原真菌和卵菌在田間或?qū)嶒炇医?jīng)馴化、誘導表現(xiàn)出了多藥抗性，給病害防治帶來了困難。病原菌主要是通過外排蛋白過表達、解毒酶代謝和多靶標位點突變等機制產(chǎn)生多藥抗性[2]。本文整理綜述了已經(jīng)表現(xiàn)出多藥抗性的植物病原菌、抗性發(fā)生情況以及目前的田間抗性治理措施，并且針對多藥抗性發(fā)生原因，探究了可能的抗性治理策略。

1 多藥抗性發(fā)生情況

1.1 草坪幣斑病菌的多藥抗性發(fā)生情況

幣斑?。╠ollar spot）又稱錢斑病或圓斑病，是最常見的草坪病害之一[3]。該病在南方各省份及北方大部分地區(qū)普遍發(fā)生，在潮濕多雨條件下發(fā)生較嚴重，危害多種草坪草[46]。經(jīng)研究，該病的病原菌為Sclerotinia homoeocarpa F.T.Bennett，為一種絲狀子囊菌[7]。目前我國高爾夫球場種植的草種主要為草地早熟禾Poa pratensis Linn.、狗牙根Cynodon dactylon （L.）Pers.、海雀稗Paspalum vaginatum Sw.和西伯利亞翦股穎Agrostis stolonifera Linn.等，這些草種都可受到幣斑病菌的侵染。除此之外，幣斑病菌還能侵染黑麥草Lolium perenne Linn.、野牛草Buchloe dactyloides （Nutt.） Engelm.、結(jié)縷草Zoysia japonica Steud.等多種禾本科草坪草以及莎草科Cyperaceae、豆科Fabaceae和石竹科Caryophyllaceae等500多種植物[8]。該病原菌對有機汞和無機汞藥劑敏感，故早期多使用這兩種藥劑進行防治，后又相繼使用福美雙、百菌清和五氯硝基苯進行防治[9]。具有局部鏟除作用的二甲酰亞胺類殺菌劑（如異菌脲）和內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑（如苯菌靈）以及甾醇合成抑制劑（DMIs，如腈菌唑）的出現(xiàn)大大提高了防治效果[911]。但是連續(xù)大量地使用上述藥劑，使病原菌對多種殺菌劑如傳統(tǒng)保護性殺菌劑和上述3種具有局部鏟除或系統(tǒng)治療作用的殺菌劑等都產(chǎn)生了抗藥性[9]。2017年，我國有學者報道了在田間分離到的對丙環(huán)唑不敏感的10株草坪幣斑病菌對異菌脲的抗性呈下降趨勢，并推測其產(chǎn)生了多藥抗性[7]。除此之外，國際上也有相關研究報道了草坪幣斑病菌對多種作用機制不同的殺菌劑產(chǎn)生多藥抗性，如對異菌脲、丙環(huán)唑和甲基硫菌靈等的抗性[1217]。

1.2 灰霉病菌的多藥抗性發(fā)生情況

由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的多種作物的灰霉病，是一種在低溫高濕條件下易發(fā)生的重要病害[18]。20世紀60—70年代，國際上先后使用苯并咪唑類殺菌劑和二甲酰亞胺類殺菌劑來防治灰霉病，并獲得了非常好的防治效果[1920]。隨后，灰葡萄孢對這兩類殺菌劑相繼產(chǎn)生了抗性，甚至出現(xiàn)同時抗苯并咪唑類殺菌劑和二甲酰亞胺類殺菌劑的情況[2021]。日本在20世紀80年代開發(fā)出了與多菌靈具有負交互抗性的N-苯基氨基甲酸酯類殺菌劑乙霉威。負交互抗性是指病原菌對一種藥劑產(chǎn)生抗性后，和野生菌株或原來相比，對另一種藥劑更加敏感的現(xiàn)象[22]。然而，在多菌靈和乙霉威混用治理田間對苯并咪唑類殺菌劑產(chǎn)生高水平抗性的灰葡萄孢過程中，卻分離檢測到了同時對這兩種藥劑表現(xiàn)抗性的菌株，因此灰葡萄孢的多藥抗性現(xiàn)象不容忽視[20]。

葡萄灰霉病俗稱“爛花穗”，是世界上嚴重危害葡萄生長和貯藏的一種植物病害，同樣由灰葡萄孢引起[23]。目前用于防治葡萄灰霉病的殺菌劑主要有甲氧基丙烯酸酯類（QoIs）、琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs）和二甲酰亞胺類殺菌劑等，灰葡萄孢在葡萄園表現(xiàn)出多藥抗性[24]。1994年，在法國葡萄園中進行灰葡萄孢抗藥性監(jiān)測時，發(fā)現(xiàn)了2種多藥抗性菌株，分別定名為MDR1和MDR2菌株。2002年，又分離到第3種多藥抗性菌株MDR3。進一步檢測發(fā)現(xiàn)MDR1菌株對二甲酰亞胺類殺菌劑異菌脲和腐霉利，以及苯基吡咯類殺菌劑咯菌腈表現(xiàn)出抗性，MDR2菌株則對托萘酯、環(huán)酰菌胺、咯菌腈和放線菌酮具有較高抗性[25]，而MDR3菌株同時對以上不同類別的殺菌劑表現(xiàn)抗性，據(jù)此有人推測MDR3菌株可能是多藥抗性菌株MDR1和MDR2的雜交后代[26]。

1.3 小麥葉枯病菌的多藥抗性發(fā)生情況

小麥葉枯?。╳heat leaf blotch）是小麥種植中一類重要的病害，可危害硬粒小麥Triticum turgidum subsp. durum等多個品種，在世界各小麥產(chǎn)區(qū)都有發(fā)生，特別是在溫帶氣候區(qū)發(fā)生更為嚴重，給小麥產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重的損害和經(jīng)濟損失[2728]。Zymoseptoria tritici（同Mycosphaerella graminicola）是引起小麥葉枯病的重要病原菌之一，由Z.tritici引起的小麥葉枯病主要發(fā)生在歐洲，使用的防治藥劑主要包括SDHIs、QoIs、DMIs殺菌劑以及百菌清等多作用位點的殺菌劑。由于Z.tritici具有極強的適應能力，研究發(fā)現(xiàn)其已表現(xiàn)出了多藥抗性[29]。Leroux 和Walker對來自法國的Z.tritici菌株進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，Z.tritici對大多數(shù)DMIs藥劑具有高水平抗性，對SDHIs藥劑也產(chǎn)生了抗性[30]。

1.4 蘋果青霉病菌的多藥抗性發(fā)生現(xiàn)狀

蘋果青霉?。╞lue mold）是蘋果采后貯運過程中常見的一種傳染性病害，可導致果實腐爛，影響其商品價值[31]。該病害主要由擴展青霉Penicillium expansum侵染引起，主要通過傷口侵染，不僅導致果實腐爛，還會使果實產(chǎn)生對人體健康有害的青霉毒素[32]。咪酰胺類、苯二甲腈類、苯并噻二唑類等殺菌劑可用于蘋果青霉病的防治[33]。但近期Samaras等在希臘蘋果包裝廠中分離到了對嘧啶胺類、苯基吡咯類以及DMI類殺菌劑具有不同程度抗性的擴展青霉多藥抗性菌株，并對兩株多藥抗性菌株和一株敏感菌株進行了轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)其抗性機制與外排蛋白的過表達相關 [34]。

1.5 室內(nèi)誘導下植物病原菌的多藥抗性發(fā)生情況

一些植物病原真菌雖未報道田間多藥抗性的發(fā)生，但在實驗室條件下，通過紫外光誘導或者藥劑馴化獲得了多藥抗性突變體，表現(xiàn)出潛在的多藥抗性風險，如致病疫霉Phytophthora infestans、指狀青霉Penicillium digitatum和立枯絲核菌Rhizoctonia solani均有相關報道。

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉引起的一種單年流行性氣傳病害，對于我國北方一季作區(qū)來說，是一種毀滅性病害[3536]。2006年Ziogas等報道了致病疫霉的多藥抗性現(xiàn)象[37]。經(jīng)紫外誘變后，分離出了對異丙菌胺、芐谷威和環(huán)磷酰胺的高抗菌株。上述突變菌株對甲霜靈、烯酰嗎啉和百菌清等的敏感性也大大降低，并且對醚菌酯和抗霉素A等的敏感性也有所降低[37]。對突變菌株生存適合度的研究表明，與敏感菌株相比，突變體的生物學性狀相關指標大多受到了不利影響，其中孢子形成和孢子萌發(fā)均顯著減少。

青霉可引起柑橘青霉病，這是柑橘貯藏期最易發(fā)生的一種侵染性病害，也可以危害田間成熟期果實，常引起巨大的經(jīng)濟損失[3840]。DMIs殺菌劑特異性誘導多藥抗性基因PMR1（Penicillium multidrug resistance）過表達，地噻農(nóng)、白藜蘆醇特異性誘導PMR5過表達。PMR1與青霉對DMIs殺菌劑、環(huán)己酰胺、4-硝基喹啉-N-氧化物（4NQO）和吖啶黃的抗性有關，PMR5與青霉對苯醌、噻菌靈、喜樹堿和白藜蘆醇等的抗性有關[4142]。

立枯絲核菌寄主范圍廣，在我國廣泛分布，可侵染至少200多種植物。立枯絲核菌主要引起植物的苗期猝倒、爛種、立枯病、馬鈴薯黑痣病以及水稻紋枯病等，在田間一般為無性態(tài)[4345]。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，立枯絲核菌在雙苯菌胺的室內(nèi)馴化下也表現(xiàn)出了多藥抗性，對氟啶胺、嘧菌酯和咯菌腈等多種殺菌劑均表現(xiàn)出不同程度的抗性[46]。

2 多藥抗性產(chǎn)生機制

已有研究結(jié)果顯示，植物病原菌多藥抗性的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)運蛋白的過表達[24，26，4748]、解毒蛋白的過表達[49]以及多個靶標位點的變化有關[50]。引起這些變化的原因目前尚不明確，僅發(fā)現(xiàn)一些殺菌劑和植物次生代謝產(chǎn)物的誘導可引起轉(zhuǎn)運蛋白的過表達。如咯菌腈馴化下，灰葡萄孢中mrr1轉(zhuǎn)錄因子被激活突變導致atrB上調(diào)表達，同時BcmfsM2過表達也會導致MFS（major facilitator super family，MFS）轉(zhuǎn)運蛋白的上調(diào)表達[25];在青霉中發(fā)現(xiàn)兩個多藥抗性基因PMR1和PMR5分別受到DMIs殺菌劑和地噻農(nóng)、白藜蘆醇的特異性誘導而過表達[4142];對構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans而言，次生植物代謝產(chǎn)物、生物堿利血平、抗生素環(huán)己酰亞胺和DMIs殺菌劑都可以引起MDR相關基因表達水平的上調(diào)[47]。此外，也有學者認為，在香蕉、谷物、水稻和葡萄等主要作物病害的田間防治中，經(jīng)常將多種殺菌劑混用或者輪換使用作為一種延緩殺菌劑抗性發(fā)展的策略，這可能是導致植物病原菌對多種殺菌劑產(chǎn)生抗性的原因[47]。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運蛋白的過表達與多種植物病原菌的多藥抗性相關聯(lián)。從灰葡萄孢中克隆并且鑒定的ABC（ATP-binding cassette transporter，ABC）轉(zhuǎn)運蛋白有14個（BcatrA～BcatrN），其中有3個蛋白（BcatrB、BcatrD、BcatrK）被證實與灰葡萄孢MDR表型相關[24]。同時，也鑒定到了2個MFS轉(zhuǎn)運蛋白Bcmfs1和BcmfsM2在灰葡萄孢的多藥抗性表型中起作用[26，48]。在Z.tritici的多藥抗性相關研究中發(fā)現(xiàn)，不同化合物（如環(huán)唑醇、小麥分泌的防御化合物）會引發(fā)5個編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的基因（MgAtr1～MgAtr5）呈現(xiàn)不同的表達水平[47]。另一方面，MgMFS1基因的啟動子序列可發(fā)生519 bp的插入突變，致使該基因編碼的轉(zhuǎn)運蛋白過量表達，從而導致Z.tritici產(chǎn)生多藥抗性[28]。在構(gòu)巢曲霉的研究中發(fā)現(xiàn)，編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的atrB基因的過表達與病原菌產(chǎn)生MDR具有重要關系;敲除atrD基因會導致構(gòu)巢曲霉對環(huán)己酰亞胺、環(huán)孢菌素衍生物、安定霉素和尼日利亞菌素的敏感性升高;干擾atrG基因的表達，影響構(gòu)巢曲霉對咪唑類和三唑類殺菌劑的敏感性[47]。關于致病疫霉的多藥抗性，也有學者推測是能量依賴型的外排蛋白過表達引起的[37]。

在草坪幣斑病菌的多藥抗性機制中還存在著解毒基因調(diào)控因子突變現(xiàn)象。編碼外源性解毒調(diào)節(jié)因子的ShXDR1基因發(fā)生突變（M853T），使細胞色素P450（cytochrome P450）相關蛋白CYP561、CYP65和CYP68，以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白ShPDR1和ShatrD呈現(xiàn)過量表達。由于這兩類蛋白分別與細胞解毒途徑的Ⅰ、Ⅲ 階段有關，所以抗性菌株對外源藥劑的代謝與外排均得到增強，從而表現(xiàn)出多藥抗性表型[49]。

Yin等[60]報道了我國油桃和櫻桃灰葡萄孢對殺菌劑的抗性情況，檢測到了同時抗嘧菌酯、嘧菌環(huán)胺、多菌靈、乙霉威和異菌脲的多抗菌株BSC14-31a，并發(fā)現(xiàn)多種作用機制殺菌劑的靶基因發(fā)生了位點突變，包括對嘧菌酯產(chǎn)生抗性的Cyt b基因的G143A突變、導致對多菌靈抗性的TUB2基因的E198V/A突變及可引起對異菌脲抗性的BcOs1基因的I365S位點突變。

3 多藥抗性治理對策

植物病原菌多藥抗性問題的治理對殺菌劑的高效利用和減量增效具有重要意義。外排轉(zhuǎn)運蛋白的過量表達是植物病原菌產(chǎn)生多藥抗性最常見的原因[5152]，因此首先可將轉(zhuǎn)運蛋白作為切入點。可采用轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑與殺菌劑聯(lián)用的方法，通過抑制藥劑的外排而增加藥劑在菌體內(nèi)的積累量以達到增效的目的。目前醫(yī)學研究中發(fā)現(xiàn)羥基黃酮衍生物、氯丙嗪、戊脈胺和呼吸抑制劑等具有增效作用[5355]，但是有的調(diào)節(jié)劑，如原釩酸鈉只在實驗室條件下起作用，還不能應用于生產(chǎn)實踐，尚需進一步研究[56]。同時，也可在不影響現(xiàn)有殺菌劑活性的前提下，對其進行一定的結(jié)構(gòu)修飾，減少其與外排蛋白的結(jié)合與轉(zhuǎn)運，使之能夠避開病原菌的外排系統(tǒng)。目前這個思路已經(jīng)在醫(yī)學領域有所應用，但是在植物病原菌方面還未見相關的研究報道[57]。

另外，可采用綜合防治的策略，從農(nóng)業(yè)防治、抗病育種和生物防治等方面入手，與化學藥劑防治相結(jié)合進行有效防治。通過減少病原基數(shù)來降低病害發(fā)生率和發(fā)生程度，以減少田間用藥量和用藥次數(shù)，對于延緩病原菌抗藥性的發(fā)生和發(fā)展也具有重要作用。具體措施如下：1）積極采用農(nóng)業(yè)措施、抗病育種和生物防治進行病害防治，減少殺菌劑使用頻次，從而降低抗性發(fā)生的風險。如針對草坪幣斑病菌的抗性，草種混播、施加充足的氮肥、適當控制草坪修剪程度、使用生長調(diào)節(jié)劑等均可降低幣斑病發(fā)病率[3]。大棚果蔬灰霉病的防治可從環(huán)境上進行調(diào)控，如適當提高棚內(nèi)溫度，科學放風以降低環(huán)境濕度，根據(jù)土壤墑情調(diào)整澆水等均可降低發(fā)病率[18， 58]。還可利用生防真菌如芽胞桿菌進行生物防治[23，5960]。小麥葉枯病的農(nóng)業(yè)防治手段包括及時清理病殘體、合理密植、適當推遲播種期、推廣使用春性品種以及加強水肥管理、合理控水、控制氮肥的用量等[61]。防治馬鈴薯晚疫病，要樹立“以防為主，以控為輔”的綜合防控理念，如選擇無病種薯、選擇抗病性強的品種，合理施肥和灌溉、選擇排水能力好的地段，避免田間積水、適時早播、合理密植、及時清除中心病株等科學栽培管理，做好預測預報等[62]。2）科學使用不同作用機制的殺菌劑，選擇適宜的施藥時間，調(diào)整施藥間隔期，在保證作用效果的同時減小藥劑選擇壓力和對環(huán)境的影響。如防治番茄灰霉病時，可采用QoIs和SDHIs單劑如吡唑醚菌酯和啶酰菌胺輪換用藥，也可使用復配藥劑醚菌·啶酰菌和氟菌·肟菌酯等進行防治，還可配合使用臭氧化葵花油的物理防治手段和使用枯草芽胞桿菌的生物防治手段[6364]。防治小麥葉枯病也要注意噴藥的時間和部位，如適宜在小麥抽穗揚花期噴藥，注意全株噴勻等[65]。

除上述思路外，在醫(yī)學領域，已經(jīng)有許多研究報道了天然植物的提取物可以抑制或殺死一些多重耐藥的人類病原菌。比如紫羅蘭 Matthiola incana （Linn.） R.Br.、芫荽Coriandrum sativum Linn.、羅勒Ocimum basilicum Linn.、余甘子Phyllanthus emblica Linn.、薄荷Mentha canadensis Linn.的提取物對一些常見的人類病原菌，如銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus和大腸桿菌Escherichia coli的多重耐藥分離菌株表現(xiàn)出較好的抑制作用[6668]。這也為未來進一步研發(fā)對植物病原菌的多藥抗性菌株具有較好抑制作用的天然植物提取物提供了參考。

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（責任編輯：楊明麗）