石 賀，夏 雪，信業(yè)久，顧 明

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

我國(guó)冠心病的發(fā)病率逐年增加，已成為患者死亡的主要原因.隨著PCI技術(shù)日益成熟，急性心肌梗死(AMI)的死亡率顯著下降，由于AMI后導(dǎo)致缺血性心肌病發(fā)病率增高，因此，缺血性心肌病已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).有研究[1]發(fā)現(xiàn)：半乳糖凝集素-3(Gal-3)參與了冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展，是冠心病發(fā)生與進(jìn)展的特異性標(biāo)志物；異丙基腎上腺素能夠迅速提升大鼠體內(nèi)兒茶酚胺水平，引發(fā)心肌缺血、缺氧.本實(shí)驗(yàn)首先建立了異丙基腎上腺素致大鼠心肌組織損傷模型，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察損傷心肌組織的形態(tài)學(xué)變化，測(cè)定大鼠血清腦尿鈉肽(Brain natriuretic peptide，BNP)表達(dá)水平以及Gal-3蛋白表達(dá)水平，以探討Gal-3蛋白表達(dá)在心力衰竭發(fā)生和發(fā)展中的作用.

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

20只雄性Wistar大鼠(北華大學(xué)生命科學(xué)研究中心)，體質(zhì)量180～200 g，室溫18～20 ℃，食水任意攝取.

1.2 研究方法

將20只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為異丙基腎上腺素組和對(duì)照組，每組10只.異丙基腎上腺素組：腹腔注射異丙基腎上腺素 5.0 mg/kg，1次/d，連續(xù)2 d；對(duì)照組：腹腔注射等劑量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)2 d.第14天處死大鼠，取材.

光學(xué)顯微鏡視野下(×400)隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域，計(jì)數(shù)各區(qū)域的心肌細(xì)胞總數(shù)、纖維化的心肌細(xì)胞數(shù)，計(jì)算心肌纖維化面積.使用乙醚將大鼠麻醉，抽取腹主動(dòng)脈血液，4 000 r/min離心，制備血清.使用Elisa試劑盒測(cè)定BNP；應(yīng)用Western blot檢測(cè)Gal-3蛋白表達(dá)，提取心肌組織總蛋白，測(cè)定蛋白濃度.取75 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目標(biāo)蛋白濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜，滴加一抗，兔抗人Gal-3單克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃過(guò)夜；次日滴加山羊抗兔IgG(1∶1 000稀釋)，室溫震蕩1 h.DAB顯色后用去離子水清洗，在干燥環(huán)境下保存，并在數(shù)字成像儀上顯示各條帶灰度值.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌組織病理變化情況分析

異丙基腎上腺素處理組大鼠心肌成纖維細(xì)胞明顯增生，膠原蛋白聚集率增加，蛋白沉積增多，Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白比例明顯提高，且排列紊亂，而對(duì)照組無(wú)明顯改變.異丙基腎上腺素處理組心肌纖維化面積明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).見(jiàn)表1、圖1.

2.2 兩組大鼠血清BNP的測(cè)定

與對(duì)照組比較，異丙基腎上腺素組血清中BNP升高(P<0.05)，表明經(jīng)異丙基腎上腺素處理后，大鼠的心力衰竭程度嚴(yán)重.見(jiàn)表2.

表1 兩組大鼠心肌纖維化面積比例Tab.1 Myocardial fibrosis area proportion of two groups

表2 大鼠血清BNP的測(cè)定結(jié)果Tab.2 BNP test results of rat serum

2.3 兩組大鼠心肌組織Gal-3蛋白表達(dá)水平

與對(duì)照組比較，異丙基腎上腺素組Gal-3蛋白表達(dá)水平明顯提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明異丙基腎上腺素致大鼠心肌損傷后，Gal-3蛋白表達(dá)水平明顯提高.見(jiàn)圖2、表3.

表3 兩組心肌組織Gal-3蛋白表達(dá)水平Tab.3 Gal-3 protein expression level between two groups

3 討 論

血清腦尿鈉肽(BNP)是由心肌細(xì)胞合成的具有生物學(xué)活性的天然激素，主要在心室中表達(dá)，同時(shí)也存在于腦組織中，其合成和釋放后心室容量負(fù)荷或者壓力負(fù)荷影響異丙基腎上腺素與心肌細(xì)胞的β受體結(jié)合，促使心率加快，心肌收縮力增強(qiáng).當(dāng)心率過(guò)快時(shí)心室舒張期明顯縮短，心室血液充盈量和搏出量明顯減少，心血液輸出量下降，最終導(dǎo)致心力衰竭.在臨床實(shí)驗(yàn)[1]中也發(fā)現(xiàn)：心力衰竭患者血清中Gal-3蛋白的表達(dá)上升，并且Gal-3蛋白的表達(dá)水平還與反應(yīng)心力衰竭嚴(yán)重程度的指標(biāo)相關(guān)，包括紐約心功能分級(jí)(心力衰竭的一種分級(jí)方法)、BNP等[2]，高水平的Gal-3可能提示心力衰竭患者的預(yù)后不良[3].此外，CALVIER等[4]研究顯示Gal-3可引起心肌纖維化和心力衰竭.還有研究[5-6]顯示高濃度的Gal-3與患者的心力衰竭程度及心肌纖維化有關(guān).張躍華等[7]研究發(fā)現(xiàn)：如果血清Gal-3濃度開(kāi)始升高，預(yù)示心功能也在逐漸惡化.也有研究[8]發(fā)現(xiàn)：Gal-3水平是心力衰竭預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，尤其是左心室射血分?jǐn)?shù)正常的心力衰竭患者.LOK等[9]發(fā)現(xiàn)：Gal-3 是預(yù)測(cè)中、重度充血性心衰患者死亡率的獨(dú)立因素.

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：通過(guò)異丙基腎上腺素誘導(dǎo)心肌損傷后大鼠的Gal-3蛋白表達(dá)升高，血清中的BNP水平也隨之升高，說(shuō)明當(dāng)心肌損傷時(shí)，引起心肌組織中的半乳糖凝集素-3(Gal-3)蛋白高水平表達(dá)，高水平表達(dá)的Gal-3蛋白啟動(dòng)并誘導(dǎo)心功能不全，在心力衰竭中發(fā)揮著重要作用.由此推測(cè)，Gal-3蛋白參與心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展，并在一定程度上能夠反映心力衰竭的進(jìn)展程度.

有研究[10]發(fā)現(xiàn)：Gal-3蛋白能夠通過(guò)激活細(xì)胞中的細(xì)胞周期蛋白D1，活化對(duì)應(yīng)蛋白激酶的抑制狀態(tài)，激活成纖維細(xì)胞.胞外基質(zhì)是由膠原蛋白、纖維連接蛋白等多種活性蛋白共同構(gòu)成的空間結(jié)構(gòu)，其中以Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白為主，在維持心肌信號(hào)傳導(dǎo)狀態(tài)中發(fā)揮關(guān)鍵作用.Ⅰ型膠原蛋白為彈性蛋白纖維，Ⅲ型膠原蛋白不穩(wěn)定，彈性張力較低.有研究[11]顯示：在健康小鼠心包中注入Gal-3蛋白后，能夠有效促進(jìn)Ⅰ型膠原蛋白產(chǎn)生，其作用強(qiáng)度是Ⅲ型膠原蛋白的3倍，可引發(fā)心肌組織和細(xì)胞的增生與僵化，導(dǎo)致心力衰竭.進(jìn)一步使用基因修飾技術(shù)將Gal-3基因敲除后，可抑制心力衰竭小鼠的病情發(fā)展，且作用效果與Gal-3蛋白特異性阻斷劑N-乙酰基乳糖一致.同時(shí)Gal-3蛋白可抑制細(xì)胞外基質(zhì)蛋白降解，促進(jìn)心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展.

本研究結(jié)果顯示：在某種程度上，Gal-3蛋白及BNP表達(dá)水平可作為判斷心肌損傷預(yù)后的指標(biāo)，對(duì)臨床判斷心肌損傷患者預(yù)后有很大幫助.