薛盼盼，張京云

中國疾病預(yù)防控制中心 傳染病預(yù)防控制所，北京 102206

核酸檢測技術(shù)是目前應(yīng)用最廣泛的微生物檢測技術(shù)之一[1]，常用于疾病診斷、菌毒株分型和溯源、病原體耐藥性和致病力分析等方面。保證核酸的高質(zhì)量往往是獲得可靠檢測結(jié)果的前提。影響核酸穩(wěn)定性的因素很多，例如酶促過程、氧化損傷、紫外線輻射和水解等[2]。低溫冷凍保存可以延緩核酸水解和氧化作用，因此被作為長期保存標(biāo)本和核酸的重要手段。反復(fù)凍融會加速核酸降解與損傷，因此標(biāo)本與核酸在凍存過程中要避免反復(fù)凍融。但是，每次凍融會對核酸造成多少影響，以及不同保存溫度下凍融操作的影響是否有差異，這些都缺少精確定量的數(shù)據(jù)。

微滴式數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是一種可對靶標(biāo)基因絕對定量的方法，目前在腫瘤學(xué)[3]、傳染病檢測[4]等方面受到關(guān)注。ddPCR檢測時，反應(yīng)體系被分散成幾萬至幾百萬個有限體積的微滴，每個微滴包含0、1個或幾個拷貝的靶標(biāo)核酸；每個微滴進行獨立的PCR反應(yīng)后，通過計數(shù)反應(yīng)陽性微滴的比例，根據(jù)泊松分布原理可計算原始模板濃度[5]。與實時熒光PCR相比，ddPCR對靶標(biāo)的定量不依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線、內(nèi)參對照和擴增閾值，結(jié)果更直觀；重復(fù)性好，對擴增抑制劑耐受性好，可避免對原始模板濃度評估的偏倚[6]。

我們以純化的沙門菌和志賀菌基因組DNA為研究對象，用ddPCR方法分析了5個常用的保存溫度下，反復(fù)凍融和保存天數(shù)對2種細菌的靶標(biāo)基因拷貝數(shù)的影響，可為實驗室選擇適當(dāng)?shù)暮怂岜４鏃l件、評估凍存造成的損耗等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

鼠傷寒沙門菌LT2和宋氏志賀菌臨床分離株SH1均在含20%甘油的凍存液中于-70℃長期保存。菌株使用時，先在普通LB瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，于37℃孵育過夜，次日選擇圓形、濕潤的典型單菌落再次劃線培養(yǎng)，取平板上的新鮮培養(yǎng)物進行后續(xù)試驗。

擴增預(yù)混液ddPCR Supermix for Probes、微滴生成油（droplet generation oil for probes）、微滴生成卡（DG8 cartridges for QX100/QX200 droplet generator）、微滴生成卡膠墊（droplet generator DG8 gaskets）、96孔 PCR板、封板膜（pierceable foil heat seal）、QX200微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)[包括微滴生成器（QX200 droplet generator）和微滴讀取儀（QX200 droplet reader）]、熱封儀 PX1 PCR plate sealer（Bio-Rad公司）；EX-RNA/DNA病毒提取試劑盒（磁珠法）、NP968-C全自動核酸提取儀（西安天隆科技有限公司）；Labcycler PCR儀（SensoQuest公司）。

1.2 引物和探針

用雙重ddPCR體系同時檢測沙門菌和志賀菌基因組DNA，引物和探針引自文獻[7]。沙門菌上游引物 SM-F（5′-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3′），下游引物 SM-R（5′-AGCAATGGAAAAAGCA GGATG-3′），探 針 SM-Probe（5′FAM-CATTTCTTA AACGGCGGTGTCTTTCCCT-3′BHQ1）；志賀菌上游引物 SH-F（5′-CGCAATACCTCCGGATTCC-3′），下游引物 SH-R（5′-TCCGCAGAGGCACTGAGTT-3′），探 針 SH-Probe（5′HEX-AACAGGTCGCTGCATGG CTGGAA-3′BHQ1）。引物和探針由生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.3 細菌核酸提取

將普通LB瓊脂平板上過夜培養(yǎng)的沙門菌LT2和志賀菌SH1新鮮菌落，以10 μL接種環(huán)挑起并懸于1.5 mL微量離心管內(nèi)的1 mL PBS溶液中，振蕩混勻后高速離心，去上清，用1 mL PBS洗1次，200 μL去離子水懸起，用EX-RNA/DNA病毒提取試劑盒（磁珠法）在NP968-C全自動核酸提取儀上提取細菌DNA，洗脫體積為100 μL。

1.4 ddPCR檢測

1.4.1 體系配制 20 μL探針法ddPCR反應(yīng)體系包括10 μL擴增預(yù)混液，沙門菌和志賀菌各條引物的終濃度均為800 nmol/L，2條探針的終濃度均為250 nmol/L，沙門菌核酸和志賀菌核酸各1 μL，用無菌去離子水補充體積至20 μL。

1.4.2 微滴生成 將配制的反應(yīng)液全部轉(zhuǎn)移至微滴生成卡樣品孔中，每個油孔中加入70 μL微滴生成油，然后轉(zhuǎn)移到微滴生成器制備微滴。

1.4.3 封PCR板 將制備的微滴轉(zhuǎn)移至96孔PCR板，用PX1熱封儀熱封（180℃，5 s）

1.4.4 PCR擴增 用Labcycler PCR儀按照三步法進行擴增（反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min；94℃變性30 s，58℃退火60 s，共40個循環(huán)；98℃熱變性10 min）。

1.4.5 讀板 PCR擴增結(jié)束后將96孔板置于微滴讀取儀中，檢測FAM和HEX信號，采用QuantaSoft 1.7.4軟件進行數(shù)據(jù)處理。

1.5 核酸凍融處理

因提取的核酸原液濃度高，超過ddPCR的檢測能力范圍，因此先將沙門菌和志賀菌的原始核酸用無菌去離子水稀釋至0.1～0.5 ng/μL，稀釋液各分裝 8管，每管 100 μL，分別于室溫（20～25℃）、4℃、-20℃、-40℃和-80℃保存。其中，每種核酸在-20℃、-40℃和-80℃各保存2管，一管為處理組（反復(fù)凍融并檢測），另一管為對照組（不凍融）,凍融周期為1 d，進行10次（即10 d）檢測。每次檢測時，于固定的時間將-20℃、-40℃和-80℃凍存的處理組核酸置于室溫融化，室溫和4℃放置的核酸則直接使用；將核酸振蕩混勻后短暫離心收集液體，取相同溫度保存的1 μL沙門菌核酸和1 μL志賀菌核酸進行雙重ddPCR檢測；每管每次檢測設(shè)3個重復(fù)孔，3次重復(fù)的平均值作為此次檢測結(jié)果。核酸分裝當(dāng)天（記為“第0 d”）的ddPCR檢測值作為起始模板量。10次凍融檢測結(jié)束后，對3個溫度的對照組核酸進行檢測。整個實驗過程，包括菌株培養(yǎng)、核酸提取及凍融檢測，共重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計分析

以核酸提取后未經(jīng)凍融（第0 d）時每個20 μL反應(yīng)體系中的靶標(biāo)拷貝數(shù)為基準(zhǔn)（100%），計算每次凍融后剩余的靶標(biāo)比例，后續(xù)統(tǒng)計分析均采用換算后的比例數(shù)值。用IBM SPSS statistic 21軟件對-20℃、-40℃、-80℃條件下，對照組、第1和第10 d的檢測結(jié)果進行單因素方差分析，α=0.05檢驗水平上P＜0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。對室溫、-20℃、-40℃、-80℃保存條件下靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)或天數(shù)的變化趨勢，用Graphpad Prism 8.0.2軟件按照單相衰減模型（One phase decay）進行曲線擬合。此模型的公式為y=（y0-plateau）*exp（-K*x）+plateau。其中，y0是x（時間）等于零時的y值，穩(wěn)定段（plateau）是無限時間的y值，K是速率常數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)（或天數(shù)）的變化趨勢

3次重復(fù)試驗中，沙門菌和志賀菌靶標(biāo)拷貝數(shù)的初始值（第0 d）均為103～104拷貝/反應(yīng)，處于ddPCR檢測能力范圍中結(jié)果比較穩(wěn)定的區(qū)間[8]。

不同溫度保存的細菌核酸，靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)（或天數(shù)）的變化趨勢不同。4℃保存時靶標(biāo)拷貝數(shù)比較穩(wěn)定，第10 d的靶標(biāo)拷貝數(shù)為初始值（第0 d）的95.8%（沙門菌）和77.3%（志賀菌）；第1～10 d的10次檢測中，拷貝數(shù)百分比的值（x±s）為沙門菌91.2%±8.0%，志賀菌89.5%±7.9%。

室溫放置的菌株核酸，靶標(biāo)拷貝數(shù)隨天數(shù)增加而逐漸降低，第10 d的靶標(biāo)拷貝數(shù)下降為初始值的30.7%（沙門菌）和22.4%（志賀菌），與初始值的差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＜0.05）。

-20℃、-40℃和-80℃保存時，靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)的增加而明顯下降，第10 d的靶標(biāo)拷貝數(shù)分別下降為初始值的25.3%～31.7%（沙門菌）和8.6%～18.4%（志賀菌），與初始值的差異均具有統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＜0.05）（圖1）。3個凍存溫度下，經(jīng)過1次凍融的對照組與第1 d（經(jīng)過1次凍融）的靶標(biāo)拷貝數(shù)接近或略低，均遠高于10次凍融后的拷貝數(shù)。

2.2 靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)（或天數(shù)）變化的擬合曲線

對室溫、-20℃、-40℃和-80℃的核酸檢測數(shù)據(jù)，采用Graphpad Prism軟件，使用指數(shù)回歸的單相衰減模型進行曲線擬合，分析靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)（或天數(shù)）的變化趨勢（圖2），主要指標(biāo)值見表1。分析2種細菌核酸衰減的速率常數(shù)，室溫和-80℃的2條曲線最為接近且數(shù)值較小，其次是-40℃曲線，最大的是-20℃曲線。對比核酸衰減的半衰期，室溫放置時半衰期（沙門菌/志賀菌）為3.21/3.99 d，-80℃保存時為2.84/3.38次凍融，-40℃保存時為2.09/2.21次凍融，-20℃保存半衰期最短，為1.61/2.06次凍融。但是，對比不同曲線速率常數(shù)和半衰期的可信區(qū)間，只有沙門菌的室溫和-20℃曲線之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)顯著性；其他曲線參數(shù)的可信區(qū)間互相覆蓋，不同曲線之間的差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性。

3 討論

圖1 同一溫度下反復(fù)凍融和保存時間對沙門菌（左）和志賀菌（右）靶標(biāo)拷貝數(shù)的影響

圖2 不同溫度保存的沙門菌（左）和志賀菌（右）核酸，靶標(biāo)基因拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)（或天數(shù)）變化的擬合曲線

表1 靶標(biāo)拷貝數(shù)隨凍融次數(shù)（或天數(shù)）變化趨勢的擬合曲線主要參數(shù)

高質(zhì)量的核酸是保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確的重要前提。低溫冷凍保存是標(biāo)本和核酸長期保存的重要手段，但不同的保存溫度、保存時間和凍融次數(shù)都會影響核酸的完整性，進而影響核酸檢測的準(zhǔn)確性[9-11]。本研究以ddPCR方法分析了5個常用的保存溫度下，反復(fù)凍融和保存天數(shù)對2種細菌的靶標(biāo)基因拷貝數(shù)的影響，定量衡量了反復(fù)凍融對核酸的損害，并分析了常溫和4℃放置時靶標(biāo)DNA的降解規(guī)律。

本研究中，核酸只凍融1次時，在凍存溫度（-20℃、-40℃和-80℃）保存10 d（即對照組）與保存1 d的靶標(biāo)拷貝數(shù)相比，數(shù)值接近或略有下降，說明對照組相對于第0 d拷貝數(shù)的降低主要歸因于1次凍融的作用，但保存期內(nèi)的自然降解也對靶標(biāo)基因的完整性有一定影響。對照組靶標(biāo)拷貝數(shù)遠高于凍融10次時，說明3個凍存溫度下第10 d拷貝數(shù)的降低主要由多次凍融所致。

菌株核酸在4℃保存時靶標(biāo)拷貝數(shù)比較穩(wěn)定，第10 d的拷貝數(shù)為初始值的95.8%（沙門菌）和77.3%（志賀菌），因此，菌株核酸在4℃短期存放不會明顯影響實驗室檢測結(jié)果。不論使用哪個凍存溫度，反復(fù)凍融都會對菌株核酸產(chǎn)生巨大傷害，靶標(biāo)拷貝數(shù)的半衰期為沙門菌1.61～2.84次凍融、志賀菌2.06～3.38次凍融，10次凍融后，靶標(biāo)拷貝數(shù)僅剩余25.3%～31.7%（沙門菌）和8.6%～18.4%（志賀菌）。即使僅1次凍融，靶標(biāo)拷貝數(shù)也會下降到初始值的71.5%～75.4%（沙門菌）和67.5%～76.1%（志賀菌）。因此，實際工作中如果需要對細菌核酸準(zhǔn)確定量，要盡量避免凍融，尤其是反復(fù)凍融。在不存在其他引起核酸降解的因素時，10 d內(nèi)要重復(fù)使用的核酸始終放置于4℃可能比經(jīng)過1次凍融的檢測結(jié)果更可靠、更接近初始狀態(tài)。

-20℃、-40℃和-80℃的擬合曲線差異不顯著，但2種菌株DNA均表現(xiàn)出在-20℃凍融時拷貝數(shù)降低更快的趨勢。這可能與凍結(jié)速度越慢、水分子結(jié)晶存在的時間越長，機械應(yīng)力造成更多的DNA鏈斷裂有關(guān)[12]。

以往也有一些研究探討保存溫度、時間、凍融次數(shù)等對核酸檢測結(jié)果的影響。單增李斯特菌基因組DNA用不同保存液于4℃、0℃和-20℃保存50和100 d，在real-time PCR檢測中，-20℃保存時Ct值改變最小，且保存液成分和DNA濃度都對檢測結(jié)果有影響[13]。純化的丙肝病毒（HCV）RNA及人免疫缺陷病毒（HIV）RNA在2～8℃條件下放置9 d仍保持穩(wěn)定[11]。人基因組DNA于4℃放置第3 d時拷貝數(shù)下降30%左右，第6 d下降50%；-40℃凍存的糞便DNA反復(fù)凍融第4次，其中的人基因組DNA降解具有統(tǒng)計學(xué)意義[10]。本研究以沙門菌和志賀菌的DNA為研究對象，獲得的數(shù)據(jù)與以上研究既有相似也有差異，這可能與核酸來源、保存液及檢測方法等因素有關(guān)。核酸來源不同、核酸分子的大小和形態(tài)不同時，例如線性與環(huán)狀DNA、較大的哺乳動物基因組與較小的DNA病毒核酸等，保存條件對核酸的影響可能會不同。溶解核酸的介質(zhì)成分、凍融操作程序等因素的改變都可能影響研究結(jié)果。另外，如果是對標(biāo)本或菌株進行檢測，保存條件的影響也會與核酸的數(shù)據(jù)有差異[10]。

綜上，在臨床診斷和監(jiān)測，以及基礎(chǔ)科學(xué)研究中，核酸的保存方式將影響結(jié)果的準(zhǔn)確性和可比性。本研究可為研究者選擇合適的細菌DNA保存方式和評估凍融對試驗結(jié)果的影響提供數(shù)據(jù)依據(jù)。