胡小濤 李海龍 譚 悅

(1.贛南師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江西 贛州 341000；2.江西潤澤藥業(yè)有限公司，江西 贛州 341000)

血吸蟲病廣泛存在于熱帶、亞熱帶地區(qū)，感染該病后死亡人數(shù)已超過2.8萬人，是一種嚴(yán)重危害人類健康的傳染病?，F(xiàn)今，世界衛(wèi)生組織(WHO)已將該傳染病列為易復(fù)發(fā)傳染病[1]，尾蚴期是血吸蟲生命周期中唯一的感染期。目前，已報(bào)道了一些可用于預(yù)防控制和殺死水面尾蚴的藥物，例如氯硝柳胺，吡喹酮等[2]。但是，這些藥物在水中的溶解性差、價(jià)格昂貴、滅尾蚴時(shí)間短，難以大面積使用。因此，提高載藥量和藥時(shí)特性對(duì)防治血吸蟲病具有重要意義。

1 水凝膠簡介

水凝膠具有優(yōu)異的物理化學(xué)性能，其三維空間結(jié)構(gòu)可作為細(xì)胞、藥物吸收和釋放的基質(zhì)材料，且具有良好的生物相容性[3-6]。因此，它在組織工程、藥物釋放和細(xì)胞三維培養(yǎng)等方面具有重要的應(yīng)用前景[7-11]。水凝膠的主要驅(qū)動(dòng)力為分子間氫鍵、范德華力、π-π堆積作用、積作用、金屬配位作用、主客體相互作用和離子相互作用。它具有分子間相互作用能力強(qiáng)、合成工作量相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)。

水凝膠分為單組分凝膠和多組分凝膠，單組分凝膠是由溶液中的凝膠因子通過非共價(jià)鍵相互作用驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的凝膠化物質(zhì)，多組分凝膠是由兩個(gè)或兩個(gè)以上凝膠因子之間通過非共價(jià)鍵相互作用自組裝形成的具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定組分。

低分子凝膠是在溶液中通過各種非共價(jià)鍵作用力自組裝形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的半固態(tài)材料。其經(jīng)常表現(xiàn)出對(duì)外界環(huán)境如溫度、光照、pH等的響應(yīng)，在分子水平上構(gòu)造和修飾低分子凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及在納米尺度上調(diào)控低分子凝膠的自組裝結(jié)構(gòu)并不復(fù)雜。它還具有良好的高響應(yīng)性和可修飾性，在藥物釋放、組織工程和細(xì)胞培養(yǎng)等領(lǐng)域顯示出巨大的潛力。此外，低分子凝膠的發(fā)展還受到機(jī)械強(qiáng)度的限制。

2 凝膠因子介紹

氨基酸是一種生物相容性好、易修飾的化合物。通過對(duì)其羥基、羧基和酰胺基的官能團(tuán)進(jìn)行修飾，引入結(jié)構(gòu)片段，進(jìn)一步獲得反應(yīng)位點(diǎn)。氨基酸衍生物作為一種低分子凝膠劑，是利用C=O和N-H氫鍵自組裝而成的穩(wěn)定水凝膠優(yōu)良材料，是最具特色的生化材料之一，在細(xì)胞培養(yǎng)、藥物釋放和生物醫(yī)學(xué)成像等方面有著廣泛的應(yīng)用。NAAPD是由天冬氨酸與3，4，9，10-花四羧酸酐在一定條件下反應(yīng)生成的，NAAPD的結(jié)構(gòu)表明，它由兩部分組成：具有顯著的π-π堆積能力的苝和在凝膠化過程中作為氫鍵供體和受體的末端羧基。

石墨烯(GO)是一種新型的碳族單層二維納米材料(其結(jié)構(gòu)如圖1)。大量的研究者對(duì)其深感興趣，故掀起了一股GO的研究熱潮[12]。石墨烯是一種由碳正環(huán)己烷構(gòu)成的二維納米材料，GO表面含有許多可修飾的含氧官能團(tuán)，具有良好的水溶性和生物相容性。目前，GO在基因轉(zhuǎn)移方面取得了優(yōu)異的成果，具有載藥、生物成像和光熱療法等功能。近年來，由于GO具有較高的比表面積、多個(gè)含氧官能團(tuán)以及良好的生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，關(guān)于GO的報(bào)道越來越多，GO在藥物傳遞中也得到了相當(dāng)大的關(guān)注。在載藥和釋藥方面表現(xiàn)出來的機(jī)械性能也是極其重要的，多個(gè)含氧官能團(tuán)導(dǎo)致碳正環(huán)已烷的排列不均勻，因此，設(shè)計(jì)分子來修飾GO使其作為藥物載體材料是提高GO力學(xué)性能的一種方法。Wan等人用小分子自組裝法制備了環(huán)氧石墨烯，結(jié)果表明材料的力學(xué)性能得到了顯著改善[13]。

因此，本研究設(shè)計(jì)了N，N-天冬氨酸-3，4，9，10四羧酸二亞胺(NAAPD)作為目標(biāo)分子修飾石墨烯(GO)，以獲得NAAPD/GO雙組分超分子水凝膠，得到其優(yōu)異的力學(xué)性能。本文利用氨基酸衍生物通過自組裝行為構(gòu)建水凝膠，分別探討其力學(xué)性能、藥物釋放過程和防治血吸蟲病的能力，通過光譜和顯微鏡技術(shù)測(cè)定或表征了水凝膠的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)。

3 實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)

3.1 合成方法

NAAPD和GO的合成分別參考Li等人[14]和Hummers等人[15]的詳細(xì)方法，NMD的合成則使用本實(shí)驗(yàn)室之前報(bào)道過的方法進(jìn)行[16]。

3.2 傅里葉紅外光譜

在室溫下，在AVATAR 360 FT-IR分光光度計(jì)(美國威斯康星州麥迪遜市Nicolet)上使用KBr片進(jìn)行FT-IR光譜分析。

3.3 凝膠的掃描特性

將水凝膠滴在圓柱形銅基片的平面上制備掃描電鏡樣品，通過掃描電子顯微鏡(FEI，QUANTA 450，Hillsboro，OR，USA)在加速電壓為20.0 kV的情況下觀察樣品的形態(tài)。

3.4 流變性質(zhì)

通過冷凍干燥將新制的水凝膠干燥3小時(shí)，之后使用MSP-1S磁控濺射鍍膜機(jī)(日本東京)對(duì)樣品進(jìn)行鍍金處理，再使用板直徑為35 mm 的HAAKE RheoStress 6000流變儀(德國奧芬堡)測(cè)量其流變特性。在25℃下，0.01～10hz范圍內(nèi)對(duì)新形成的水凝膠進(jìn)行頻率掃描測(cè)量。應(yīng)變振幅設(shè)置為1%，時(shí)間掃描測(cè)量的頻率設(shè)置為6.28rads-1，應(yīng)變?yōu)?0%。

3.5 X射線衍射分析

在Bruker-D8聚焦衍射儀上，用CuKα射線衍射儀對(duì)干燥后的有機(jī)凝膠進(jìn)行了小角X射線衍射(SA-XRD)分析。

3.6 核磁共振

在室溫下，在400 MHz的ULTRASHIELD 400(Bruker，Zürich，Switzerland)光譜儀上記錄了核磁共振譜(NMR)。

3.7 凝膠化研究

對(duì)NAAPD和GO在復(fù)合溶液(THF/H2O=1/1)中的凝膠化進(jìn)行了研究。為了制備不同NAAPD/GO摩爾比的水凝膠體系，在玻璃管中稱取大量NAAPD和GO，加入0.5mL四氫呋喃(THF)后加入相當(dāng)量的二次蒸餾水，在室溫下超聲振動(dòng)6h。結(jié)果表明，在1/1摩爾比下，NAAPD/GO水凝膠體系能穩(wěn)定形成，管內(nèi)倒置時(shí)不流動(dòng)；還發(fā)現(xiàn)該體系的最小凝膠濃度為4.0%(w/v)。以氯硝柳胺衍生物(NMD)為控釋劑，考察了該控釋體系的釋藥性能；為了考察載藥量，將不同質(zhì)量的NMD以1/1的摩爾比加入1ml的NAAPD/GO水凝膠(THF/H2O=1：1)中。然后，在室溫下超聲處理6h。通過觀察水凝膠的形成，研究了這種超分子水凝膠材料的最大載藥量。通過體外釋放試驗(yàn)，從96孔玻璃板中取出300μL的溶液，在不同的釋放時(shí)間(依次為1h、2h、5h、24h、200h)。在錐形瓶中從水面采集日本血吸蟲尾蚴，在強(qiáng)光照射下浸泡2h，在不同的釋放時(shí)間，將感染的日本血吸蟲尾蚴從孔中取出，每隔30min用生物顯微鏡觀察尾蚴活性。

4 結(jié)果與討論

4.1 NAAPD、GO和NMD的化學(xué)式

圖1 N，N-天冬氨酸-3，4，9，10-四羧酸二亞胺(NAAPD)、氧化石墨烯(GO)和氯硝柳胺衍生物(NMD)的化學(xué)結(jié)構(gòu)

眾所周知，化學(xué)式是對(duì)化合物性質(zhì)的初步認(rèn)識(shí)。NAAPD、GO和NMD的化學(xué)式如圖1所示，NAAPD的結(jié)構(gòu)中心是一個(gè)大的苝烯，左右兩個(gè)天冬氨酸殘基。由于石墨烯基部和邊緣含氧基團(tuán)的存在，GO在水和極性有機(jī)溶劑中具有高度分散性?；ㄏ┍晃骄哂卸鄠€(gè)苯環(huán)結(jié)構(gòu)和GO結(jié)構(gòu)的m-m堆積鍵上，NAAPD具有良好的生物相容性和親水性，可以通過氫鍵參與凝膠化過程。通過試驗(yàn)，利用普通試管，在復(fù)合溶液(THF/H2O=1/1)中測(cè)定了化合物NAAPD和GO的凝膠能力。

4.2 NAAPD/GO水凝膠的表征

水凝膠的照片如圖2a所示。為了深入研究水凝膠的性質(zhì)，我們將水凝膠冷凍干燥，然后通過掃描電鏡觀察。發(fā)現(xiàn)該水凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，并與層狀結(jié)構(gòu)交聯(lián)，圖2b顯示了該水凝膠具有良好的載藥性能與空間結(jié)構(gòu)，能夠承載添加的藥物。

圖2 (a)水凝膠的照片；(b)NAAPD/GO樣品的SEM圖像；(c)NAAPD/GO的AFM圖像及其厚度直方圖

原子力顯微鏡(AFM)是表面形貌領(lǐng)域的一種重要儀器，利用熱解石墨HOPG原子力顯微鏡研究了NAAPD/GO的顯微結(jié)構(gòu)。NAAPD/GO的AFM圖像及其厚度直方圖如圖2c所示，NAAPD/GO呈層狀結(jié)構(gòu)，平均表面粗糙度為0.9nm。其結(jié)構(gòu)與凝膠的層狀結(jié)構(gòu)SEM圖像一致，NAAPD強(qiáng)烈地被排列有序的GO表面所吸引，水凝膠作為藥物載體材料具有優(yōu)良的力學(xué)性能。結(jié)果表明，GO和NAAPD在一定的厚度范圍內(nèi)形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。

紅外光譜是研究水凝膠分子間作用力的一種非常有效的方法。為了進(jìn)一步了解水凝膠的性質(zhì)，對(duì)凍干水凝膠進(jìn)行了紅外分析。圖3a中的酰胺基形成氫鍵，其吸收峰從3458cm-1移動(dòng)到3428cm-1。酰胺基形成氫鍵是NAAPD和GO自組裝水凝膠形成的主要驅(qū)動(dòng)力，使NAAPD與GO交聯(lián)形成三維層狀結(jié)構(gòu)。

X射線衍射(XRD)是利用X射線衍射分析粉末材料的衍射圖樣，獲得材料成分、材料內(nèi)部原子或分子的結(jié)構(gòu)或形態(tài)等信息的研究方法。圖3b中加入NAAPD后在10度之間有兩個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，說明水凝膠排列有序。水凝膠是由有序排列的m-m堆積作用形成的，這說明水凝膠在藥物載體材料方面具有良好的性能。

圖3 (a)2400-3900 cm-1之間的紅外吸收光譜，代表N-H拉伸帶的變化；(b)GO和NAAPD/GO干凝膠的X射線衍射圖譜；(c)濃度為4.0%(w/v)的NAAPD/GO水凝膠的應(yīng)變掃描；(d)濃度為4.0%(w/v)的NAAPD/GO水凝膠的動(dòng)態(tài)儲(chǔ)能模量(G′)和損耗模量(G″)的頻率依賴性濃度。

力學(xué)性能是衡量水凝膠性質(zhì)的重要物理量，通常用流變儀測(cè)量，如水凝膠的線性粘彈性應(yīng)變掃描響應(yīng)所示(圖3c)，在6.28 rad s-1下，在0.1Pa到100Pa的振幅下，儲(chǔ)能模量G′保持在大于損耗模量G″的狀態(tài)，這表明水凝膠是一種粘彈性材料，圖3d為水凝膠在4.0%(w/v)濃度下的動(dòng)態(tài)儲(chǔ)能模量和損耗模量的頻率依賴關(guān)系。所有的G′都在G″以上，兩者之間的差異基本上沒有變化，這表明該水凝膠具有良好的穩(wěn)定性。G′隨頻率的增加而略有下降，表明該水凝膠對(duì)外部剪切具有良好的耐受性。這些研究證實(shí)了NAAPD/GO形成的是穩(wěn)定的水凝膠，并顯示出優(yōu)良的力學(xué)性能，該水凝膠可作為藥物載體材料用于藥物釋放。

4.3 NAAPD/GO/NMD水凝膠的表征

作為一種新型載藥材料，水凝膠呈現(xiàn)出令人驚訝的三維網(wǎng)狀層狀結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上，自發(fā)地對(duì)水凝膠進(jìn)行了載藥性能的測(cè)試。在不破壞凝膠形成的情況下，1mL NAAPD/GO水凝膠(4%w/v)在1/1摩爾比下可達(dá)到600mg最大載藥量，如圖4a所示。如圖4b所示，與未載藥水凝膠相比，載藥水凝膠具有更致密的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，是一種穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，藥物在水凝膠材料表面有較強(qiáng)的吸附。

圖4 (a)NAAPD/GO水凝膠的照片；(b)樣品的掃描電鏡圖像；(c)NAAPD/GO水凝膠在4.0%(w/v)濃度下的應(yīng)變掃描；(d)NAAPD/GO水凝膠在0.1%應(yīng)變下的頻率掃描。

流變儀還測(cè)量了超分子載藥水凝膠的力學(xué)性能。儲(chǔ)能模量曲線高于損耗模量曲線，但隨著應(yīng)力的增大而突然減弱，表明水凝膠的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)已失去交聯(lián)(圖4c)。如圖4d所示，儲(chǔ)能模量大于損耗模量，兩條曲線始終保持直線趨勢(shì)，說明載藥水凝膠具有良好的彈性和穩(wěn)定性。這意味著水凝膠在給藥后仍具有良好的力學(xué)性能，是一種優(yōu)良的藥物載體。

4.4 藥物釋放研究

水凝膠在藥物傳遞領(lǐng)域取得了許多優(yōu)異的成果。研究中，在NAAPD/GO水凝膠體系中，水凝膠的最大負(fù)載量達(dá)到了600mg。在500μL水和500μL四氫呋喃(THF)溶液中加入20mg NAAPD和20mg GO。這是NMD在326.5nm處紫外可見分光光度計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線匹配圖(圖5a)。用于藥物釋放實(shí)驗(yàn)中NMD濃度的計(jì)算。在圖5b中，水凝膠的藥物釋放在前10天的破裂速率快速增加，表明載體水凝膠能夠在水中釋放藥物，達(dá)到治療血吸蟲病的效果。在Li等人的基礎(chǔ)上進(jìn)行了抗藥性實(shí)驗(yàn)，明確表明尾蚴在半小時(shí)內(nèi)NMD釋放量達(dá)10%以上。藥物釋放率隨時(shí)間逐漸降低，64天后達(dá)到最大值。因此，該水凝膠的釋藥性能可維持60天，并在早期具有快速釋藥性能。

圖5 (a)氯硝柳胺衍生物在326.5nm處紫外吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線；(b)載藥后NAAPD/GO水凝膠在25℃水中的累積釋放

所有實(shí)驗(yàn)至少分三次進(jìn)行。

圖6 NAAPD/GO/NMD水凝膠緩釋水溶液抗尾蚴實(shí)驗(yàn)(25℃)的日本血吸蟲尾蚴死亡率

對(duì)該藥物緩釋系統(tǒng)體外抗尾蚴能力進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。從圖6可以看出，96孔玻璃板在1小時(shí)的死亡率為7.5%，3小時(shí)后死亡率達(dá)到92.5%，甚至2小時(shí)釋放水的死亡率也可以達(dá)到100%?？梢姡琋AAPD/GO/NMD水凝膠體系對(duì)水體表面具有良好的抗尾蚴活性。

5 結(jié)論

低分子水凝膠具有良好的高響應(yīng)性和可修飾性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。同時(shí)，低分子水凝膠由于力學(xué)性能差而表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，這一問題成為低分子水凝膠發(fā)展的關(guān)鍵。

本文設(shè)計(jì)了一種力學(xué)性能優(yōu)良的雙組分水凝膠(NAAPD/GO)用于在水溶液中的藥物釋放，水凝膠的主要驅(qū)動(dòng)力是氫鍵和m-T堆積相互作用，NAAPD的-COOH與GO表面含氧官能團(tuán)形成氫鍵。通過NAAPD與GO分子間交聯(lián)，水凝膠呈現(xiàn)出三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和層狀結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)該水凝膠具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和較大的抗血吸蟲病藥物載藥量，水凝膠流變數(shù)值達(dá)到104Pa，超過了我們所知的正常低分子水凝膠流變數(shù)值(103Pa)。在1ml水凝膠體系中(20mg NAAPD/20mg GO)，水凝膠載藥量可達(dá)600mg。通過抗尾蚴試驗(yàn)，NAAPD/GO/NMD水凝膠能持續(xù)快速殺滅水中尾蚴，釋放時(shí)間超過2個(gè)月。

這項(xiàng)工作為不同需求的尾蚴防治提供了更大的可能性，藥物分子設(shè)計(jì)有望成為材料領(lǐng)域的新方向。