劉敏鋒，吳明煜，吳長春，吳昊宇，柯文山

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 湖北 武漢 430062； 2.湖北輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 湖北 武漢 430070)

0 引言

湖北釘螺是日本血吸蟲的唯一中間宿主[1]，因此控制中間宿主湖北釘螺也是控制血吸蟲病的一個(gè)重要環(huán)節(jié).目前普遍采用的化學(xué)方法效果好，但存在水體污染和對(duì)水生動(dòng)物毒害作用難以克服的缺點(diǎn).因此，科學(xué)工作者試圖從生殖角度來控制釘螺的繁衍，而這需要快速找到識(shí)別釘螺雌雄的方法.1958年丁若望等“利用光照鑒別釘螺雌雄的方法”其正確率是80%左右[2]；且其方法介紹不清晰、用時(shí)長,誤差大.因此本研究試圖從實(shí)踐中找到快速鑒別釘螺雌雄性的方法，提高鑒別雌雄的正確率且縮短鑒別時(shí)間.快速掌握識(shí)別釘螺雌雄的方法，為研究釘螺繁殖方面[3]、釘螺種群動(dòng)態(tài)統(tǒng)計(jì)[4]、雌雄交配對(duì)策和性信息素[5]、控制釘螺種群等提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料釘螺：于2019年9月分別采自湖北省荊州市、黃石市和四川省，經(jīng)逸蚴法鑒定為陰性[6]，選擇活動(dòng)性好的成螺用于實(shí)驗(yàn).實(shí)驗(yàn)用的荊州釘螺，其成螺大小一般在8.64 mm×3.49 mm～9.73 mm×4.24 mm之間.黃石市成螺大小在7.54 mm×3.13 mm～7.87 mm×3.20 mm之間.四川省成螺大小在5.80 mm×2.71 mm～6.03 mm×2.85 mm之間.采回后反復(fù)用去離子水清洗，去除泥沙，剔除陽性螺和死亡螺，用實(shí)驗(yàn)室自制的瓦缽法[5]飼養(yǎng)釘螺.瓦缽直徑為16 cm,高13 cm,底為1.5 cm.然后將經(jīng)過高溫滅菌(121 ℃，20 min)并過篩(60目)的厚泥漿倒入缽底，泥漿厚度為2 cm.若泥漿干后出現(xiàn)裂縫時(shí)，壓平縫隙，缽口用紗罩封蓋.將瓦缽放在白色搪瓷盤中，盤中加入一定量的純水，保持一定的濕度.將瓦缽放置在室溫中，每天喂食3次硅藻營養(yǎng)液，溫度保持在(25±2) ℃以下，每天光照10 h.實(shí)驗(yàn)前挑選活性強(qiáng)的成螺，置于燒杯中，用去離子水清洗3次，準(zhǔn)備待用.

1.2 研究方法將釘螺放入培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于奧林巴斯解剖顯微鏡下，打開光源系統(tǒng)照明，用Nikon D5200單反相機(jī)拍攝釘螺的各體位圖.

1.3 釘螺的雌雄鑒別

1.3.1 鑒別工具 奧林巴斯解剖顯微鏡、培養(yǎng)皿、手電筒、放大鏡、鑷子、毛刷等.

1.3.2 室內(nèi)鑒別 從野外采回的釘螺放在瓦缽中飼養(yǎng)3 d，每天加3次營養(yǎng)液[7]，維持正常的生命所需.

1)用純水多次清洗釘螺表面的泥土，并用軟毛刷輕輕刷釘螺的殼體以去除釘螺身上的污漬和藻類.

2)將清洗干凈的釘螺放入9 cm的培養(yǎng)皿中，加適量的水淹沒釘螺[8]，將培養(yǎng)皿放置于解剖鏡下.

3)將解剖顯微鏡底部的光源打開，刺激釘螺頭足部伸出.

4)優(yōu)先選取其頭部和觸角伸出的釘螺，用鑷子夾住釘螺使其螺口朝左[9]，整個(gè)螺體位傾斜向右，觀察釘螺頭部與螺殼空隙.

1.3.3 室外鑒別方法

1) 將采集到的釘螺洗去螺殼上的污泥及藻類，以便觀察.

2) 清洗干凈的釘螺放在直徑為9 cm的濾紙上，用鑷子夾住釘螺使其螺口朝左，整個(gè)螺體位傾斜向右.

3) 借助太陽光或陰天使用手電筒，用放大鏡透過螺殼觀察釘螺頭部與螺殼空隙.

2 雌雄鑒別結(jié)果

2.1 室內(nèi)鑒別的結(jié)果用純水清洗干凈的釘螺，優(yōu)先選取其頭部和觸角伸出的釘螺，用鑷子夾住釘螺使其螺口朝左，整個(gè)螺體位傾斜向右，觀察釘螺頭部與螺殼空隙.釘螺對(duì)光照十分敏感，在光照條件下，釘螺會(huì)慢慢將厴打開，頭部伸出，觸角位于頭部背方的兩側(cè)和頭頸之間，是一對(duì)細(xì)長的突出，能伸縮運(yùn)動(dòng).在奧林巴斯解剖顯微鏡下釘螺頭部與螺殼空隙可觀察到粉紅色或肉突的陰莖(如圖1、圖2、圖3、圖5)，因此可以辨別出雄性釘螺，反之，則是雌性釘螺(圖4、圖6). 釘螺厴的閉合程度情況不一樣[11-12]，所以圖2與圖1雄性釘螺交配器所在位置也隨之發(fā)生改變. 觀察時(shí)用鑷子夾住螺體輕輕順時(shí)針旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)一周后找到粉紅色的陰莖則是雄螺，若沒有找到粉紅色的陰莖則是雌螺[10].圖5是四川釘螺，屬于山丘型釘螺，個(gè)體大小偏小，雄性陰莖也偏小，圖6則沒有觀察到粉紅色的肉突，則為雌性.

本室內(nèi)鑒別方法從2019年5—8月，每個(gè)月一批，每批100只釘螺，每個(gè)月分3次檢驗(yàn)，減少誤差，來確保在不同季節(jié)、不同時(shí)間段鑒別方法的正確性，每批螺在45 min內(nèi)可鑒別完成.鑒別正確率從5月份的92.60%到6月份的97.68%，最后7—8月份正確率均達(dá)100%，平均每個(gè)螺被成功鑒別的時(shí)間大約在30 s之內(nèi)完成.

圖1 湖北黃石雄性釘螺

圖2 湖北荊州雄性釘螺

圖3 湖北荊州雄螺交配器位于體螺層右側(cè)

圖4 湖北荊州雌性釘螺

圖5 四川雄性釘螺

圖6 四川雌性釘螺

2.2 野外鑒別結(jié)果清洗干凈的釘螺，優(yōu)先選取其頭部和觸角伸出的釘螺，用鑷子夾住釘螺使其螺口朝左，整個(gè)螺體位傾斜向右，觀察釘螺頭部與螺殼空隙.釘螺對(duì)光照十分敏感，在太陽光或者手電筒的光照條件下，釘螺會(huì)慢慢將厴打開，頭部伸出，觸角位于頭部背方的兩側(cè)和頭頸之間，是一對(duì)細(xì)長的突出，能伸縮運(yùn)動(dòng).在釘螺頭部與螺殼空隙可觀察到粉紅色的陰莖，因此可以辨別出雄性釘螺，反之，則是雌性釘螺.根據(jù)螺厴閉合程度不同，雄性釘螺交配器所在位置也隨之發(fā)生改變，如用鑷子將螺體旋轉(zhuǎn)一周觀察不到此結(jié)構(gòu)，則為雌螺.

2019年5月至10月，每月一批，每批鑒別100只釘螺，每次鑒別均可在60 min內(nèi)完成，平均每個(gè)螺被成功鑒別時(shí)間的大約在40 s內(nèi)完成，經(jīng)過室內(nèi)復(fù)檢正確率達(dá)到93.83%.

2.3 釘螺鑒定復(fù)查表我們對(duì)湖北荊州釘螺進(jìn)行了野外鑒別及室內(nèi)復(fù)查，具體結(jié)果見表1和表2.

表1 湖北荊州釘螺野外鑒別及室內(nèi)復(fù)查

表2 湖北荊州釘螺室內(nèi)鑒別統(tǒng)計(jì)表

3 小結(jié)與討論

野外鑒別時(shí)，洗凈釘螺，在陽光下或借助手電筒，并旋轉(zhuǎn)釘螺，尋找并確認(rèn)雄螺陰莖，釘螺雌雄檢出正確率超過90%，平均達(dá)93.83%(表1)，較前人的檢出率(80%)[2]大大提高.室內(nèi)檢出時(shí)，從摸索階段的92%(如5月)到熟練時(shí)檢出正確率為100%(如7—8月份)(表2).野外檢測(cè)時(shí)，由于某些釘螺殼體表面模糊、釘螺的厴向內(nèi)收縮幅度大、雄螺的陰莖從外殼上不易觀察，有少量雄螺不易檢出.而室內(nèi)在解剖顯微鏡的光源刺激下，釘螺頭足伸出，野外不易鑒別的雄螺在此時(shí)可清晰鑒別.而容易觀察的釘螺可以直接從螺外觀察到雄螺陰莖交配器如圖1、2、3、5.因此，野外不確定釘螺通過室內(nèi)觀察法加以糾正.

丁若望等(1958)雖然也利用光照鑒別釘螺雌雄的方法，但其報(bào)道的正確率是80%左右[2]，吳海萍[10]等方法介紹不清晰、誤差大，也沒有統(tǒng)計(jì)鑒別時(shí)長.我們?cè)谇叭嘶A(chǔ)上加以改進(jìn)，通過應(yīng)用對(duì)釘螺為期4個(gè)月(5—8月)，雌雄鑒別摸索，逐漸熟練掌握鑒別方法，大大提高了鑒定的準(zhǔn)確率.我們?cè)谑覂?nèi)45 min內(nèi)100只湖北荊州釘螺鑒別的正確率從5月份的92.60%到6月份的97.68%，最后7—8月的檢測(cè)正確率達(dá)100%，平均每個(gè)釘螺被成功鑒別的時(shí)間大約在30 s之內(nèi)完成.在室外60 min內(nèi)100只釘螺鑒別的正確率達(dá)93.83%，平均每個(gè)釘螺被成功鑒別大約在40 s內(nèi)完成，不但正確率高，且檢測(cè)時(shí)間短.因此此方法不失為快速、簡單、準(zhǔn)確辨別釘螺雌雄的方法.

盡管我們建立了一種快速鑒別雌雄釘螺的方法，但仍然有許多問題需要進(jìn)一步解決.譬如，在釘螺的雌雄鑒別中，肋殼釘螺螺紋增加了觀察的難度[13]，即使是熟練者也是有一定的誤差.不同地區(qū)生長的環(huán)境不一樣[14-15]，釘螺殼上附有許多影響觀察的物質(zhì)，如污泥、難以清洗的雜質(zhì)和藻類等，也同樣影響觀察者的鑒定.如果在陰天光線暗誤差可能會(huì)更大，在野外清洗不徹底，耗時(shí)比較長，影響工作的效率.不同地區(qū)釘螺的大小不一樣、肋殼釘螺和光殼釘螺的螺紋不一樣，為快速正確鑒定釘螺帶來一定難度，因此如何快速準(zhǔn)確鑒別雌雄還需進(jìn)一步探索.