賴剛剛，李 豐，黨金歡，冶子耕，張 萍，朱天生

（塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

0 前言

柳樹（Willow），楊柳科柳屬，雙子葉落葉喬木，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性廣，喜光，喜濕，耐寒。其品種繁多，全球約520余種，中國有250余種且分布在全國各地。作為一種重要的觀賞性樹種，柳樹在我國的栽培歷史已有2000多年。柳樹生命力強(qiáng)，栽培方法簡單且易繁殖，是重要的綠化用樹，許多國家將其作為城市、小區(qū)、園林和道路等綠化樹種，在觀賞、工藝與環(huán)境方面都有極大價(jià)值，在部分干旱地區(qū)維持生態(tài)平衡有很大優(yōu)勢(shì)，對(duì)于區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展也具有重要作用。

植原體（Phytoplasma）過去稱作類菌原體（Myco?plasma-like Organism，MLO）是一類專性寄生菌，屬原核生物界（Prokaryota）柔膜菌綱（Mollicutes）[1]。無細(xì)胞壁，由葉蟬和飛虱等刺吸式口器昆蟲傳播，也可通過菟絲子和嫁接進(jìn)行傳播。寄生于植物韌皮部和昆蟲的唾腺細(xì)胞。植原體病害最早記載是在1000 多年前，在我國宋朝的牡丹花上發(fā)現(xiàn)，由于牡丹花發(fā)病后形狀奇特而被人們認(rèn)為是花之典范[2]。我國明崇禎末（約公元1640 年前后）《沈氏農(nóng)書·運(yùn)田之法》中也有記載桑樹矮縮病[3]?？茖W(xué)界最早記載是在200 年前日本的桑樹上發(fā)現(xiàn)桑樹矮縮病，1967年日本植物病理學(xué)家土居養(yǎng)二（Doi）利用電子顯微鏡在表現(xiàn)叢枝癥狀的桑樹等植物韌皮部篩管細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)類似“支原體”的微生物，后命名為類菌原體[4]，引起植物病理學(xué)界廣泛關(guān)注，極大推動(dòng)植原體的研究。1992 年第9 屆國際支原體大會(huì)上，比較支原體國際研究項(xiàng)目植原體工作組（IRPCM）首次提議用“植原體”（Phytoplasma）這個(gè)名字來代替“類菌原體”（Mycoplasma-like organisms）[5，6]。1994年第 10屆國際菌原體組織會(huì)議上類菌原體正式被更名為植原體[3]。

1 國內(nèi)外植原體研究現(xiàn)狀及分析

1.1 植原體生物學(xué)特性

植原體具有復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由厚度約為10nm的2層蛋白質(zhì)膜和中間一層脂肪膜組成的單位膜包裹[7]。其直徑200～800nm，形態(tài)各異，有球形、橢圓形、棒形、細(xì)絲狀[8，9]、不規(guī)則形等，其形態(tài)隨所處環(huán)境的不同而發(fā)生變化[4]。植原體主要分布在被害植物韌皮部的篩管、伴胞、韌皮薄壁細(xì)胞及韌皮纖維中；在介體昆蟲中主要分布于唾液腺和脂肪體組織中[10]，可侵染昆蟲的卵，還可在昆蟲體內(nèi)進(jìn)行繁殖。目前為止，植原體尚不能像其他細(xì)菌一樣人工體外培養(yǎng)。Nicoletta Contaldo[11]等人在2012 年報(bào)道了對(duì)植原體的純培養(yǎng)方法，但由于該方法操作繁瑣、成本代價(jià)高未被廣泛應(yīng)用到植原體研究中。

植物被植原體侵染后，會(huì)在不同的部位引起一系列相應(yīng)的癥狀變化，如芽、莖、葉、花等不同部位會(huì)產(chǎn)生不同的癥狀，使植物的代謝發(fā)生紊亂。感病植物所表現(xiàn)出來的癥狀也會(huì)隨植物所處生長時(shí)期不同而發(fā)生變化，某些抗病植物表現(xiàn)出來的癥狀也會(huì)不明顯。國際上已見報(bào)道的植物被植原體危害后表現(xiàn)出來的癥狀主要有叢枝、黃化、花變?nèi)~、矮化、簇生、小葉、扁莖等。

1.2 植原體分類

由于植原體種類繁多，侵染不同的寄主植物后寄主表現(xiàn)出相同或相似癥狀，幾種植原體復(fù)合作用后引起的植物病害很難鑒定，加之植原體引起的癥狀與病毒引起的極為相似，因此植原體的研究面臨著許多困難與挑戰(zhàn)。早期研究人員主要根據(jù)寄主植物被植原體危害后，所表現(xiàn)出的癥狀及介體昆蟲的?；赃@兩類特征對(duì)植原體進(jìn)行分類，但這種分類方法并不全面和系統(tǒng)。目前植原體的分類主要還是依據(jù)其16S rRNA、rp（核糖體蛋白）、secY（分泌蛋白）等保守基因序列和基因組差異，及對(duì)傳播介體、天然植物寄主和限制性酶切片段多態(tài)性分析。根據(jù)植原體16S rRNA基因序列RFLP分析圖譜的相似系數(shù)，可將部分植原體分為不同的組及亞組[12]。2007年Wei wei等[13]用計(jì)算機(jī)模擬和RFLP分析鑒定了10 個(gè)新的植原體組。截止2019 年6 月植原體已鑒定劃分為52個(gè)暫定種、36個(gè)組和100多個(gè)亞組[3]；被完整測序的植原體基因組已有6 種，植原體基因組草圖測序成功的也有19種[7]。植原體基因組中有兩個(gè)rRNA操縱子，而這兩個(gè)rRNA操縱子基因序列存在同源異質(zhì)性，因此，在植原體16S rRNA 基因克隆測序中會(huì)出現(xiàn)序列不一致的結(jié)果，所以在分類鑒定中盡量選擇高度保真的DNA 聚合酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并多挑一些單克隆抗體進(jìn)行測序，以保證植原體的16S rRNA 基因序列的真實(shí)性。雖然16S rRNA基因序列較為保守，可以較好地對(duì)植原體進(jìn)行種、組和亞組的區(qū)分，但難以對(duì)種內(nèi)不同株系進(jìn)行區(qū)分。對(duì)植原體種內(nèi)進(jìn)一步分類，應(yīng)更多地克隆測序種間保守、種內(nèi)變異較大的基因，如tuf（與蛋白質(zhì)合成有關(guān)的延伸因子EF-Tu）基因、rp基因、secY基因、膜蛋白基因等，并對(duì)以上基因進(jìn)行序列一致性比對(duì)和分析[3]。tuf基因除了用于確認(rèn)植原體菌株的分類地位之外，還可以追蹤寄主植物和昆蟲載體中的植原體菌株的擴(kuò)散[14]。植原體的分類鑒定，還應(yīng)注重植原體的寄主范圍、特定植物寄主癥狀及不同的傳播昆蟲介體等植原體生物學(xué)特性的研究。

1.3 植原體檢測

在過去的幾十年里，由于沒有獲得植原體的純化培養(yǎng)基，所以對(duì)植原體的檢測，通常是通過寄主植物所表現(xiàn)出來的癥狀選擇將感病植物制成超薄切片，進(jìn)行觀察判斷；因植原體對(duì)四環(huán)素及其衍生物類的藥物敏感，給感病植物注射四環(huán)素，若癥狀消失，則證明感染植原體[4]；或根據(jù)寄主植物的種類、表現(xiàn)出來的癥狀、傳播介體等也可對(duì)是否植原體進(jìn)行判斷。但由于寄主植物間差異、種類差異、抗性差異、環(huán)境因素等，對(duì)植原體進(jìn)行鑒定時(shí)，耗時(shí)耗力且鑒定結(jié)果不一。隨著科技的發(fā)展及電子計(jì)算機(jī)水平的進(jìn)步，目前，應(yīng)用于植原體的檢測方法主要有電子顯微鏡法、組織化學(xué)法、血清學(xué)方法、PCR法和核酸雜交法等。

1.3.1 電子顯微鏡法

植原體無細(xì)胞壁，且形態(tài)大小容易受環(huán)境的影響，在電鏡下觀察到的形態(tài)有球形、桿狀、細(xì)絲狀、不規(guī)則形等，大小在200～800nm 不等。該方法可直接觀察到植物組織結(jié)構(gòu)中的植原體，具有較高的可行性，缺點(diǎn)是需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，耗時(shí)耗力，費(fèi)用高，難以普及。

1.3.2 血清學(xué)方法

1985年，Lin等[15]首次報(bào)道成功制備翠菊黃化病植原體的單克隆抗體。1988年，Chen等[16]也成功制備玉米叢矮病植原體的單克隆抗體。林木蘭等[17]成功制備泡桐叢枝病植原體的單克隆抗體，并進(jìn)行泡桐叢枝病的檢測。隨后，科研工作者又相繼成功制備了多種植原體的單克隆抗體并開展病害診斷。目前，主要的血清學(xué)方法有：瓊脂雙擴(kuò)散、酶聯(lián)免疫吸附測定、點(diǎn)免疫測定、熒光免疫及免疫電鏡技術(shù)等。

1.3.3 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是利用超速離心技術(shù)等獲得待研究植原體的DNA，然后將其酶切，回收片段DNA，將該片段標(biāo)記制成DNA探針，通過雜交該探針來檢測植原體。特別是在檢測木本植物中的植原體時(shí)，該方法具有快速靈敏的特點(diǎn)，但由于某些木本植物中植原體濃度低，也使該技術(shù)的使用受到一定限制。目前，主要的核酸檢測技術(shù)有：點(diǎn)印跡雜交技術(shù)、原位雜交技術(shù)和Southern 雜交技術(shù)。

1.3.4 組織化學(xué)法

組織化學(xué)法是利用熒光染料與光學(xué)顯微鏡對(duì)植原體進(jìn)行檢測。主要有DAPI 熒光顯微技術(shù)、迪納氏染色、苯胺藍(lán)染色等方法。DAPI對(duì)真原核細(xì)胞的核具有極高的靈敏性，是檢測植原體的高效熒光染料。組織化學(xué)法是一種間接的檢測手段，在被害植物植原體含量較低、植物組織中胼胝質(zhì)含量積累、含有大量酚類物質(zhì)及DNA 干擾物時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應(yīng)用時(shí)會(huì)受到限制，可作為輔助手段。

1.3.5 PCR技術(shù)

目前用于植原體檢測的有巢式PCR（Nested PCR）、免疫捕獲PCR（Immuno capture PCR）、競爭PCR（COP-PCR）、循環(huán)PCR（Rcycled-PCR）和實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)（Real-time PCR）等。巢式PCR 是使用兩對(duì)通用引物對(duì)植原體進(jìn)行兩輪擴(kuò)增，從而提高檢測的靈敏度；免疫捕獲PCR是采用單克隆抗體或多克隆抗體選擇性捕捉植原體DNA，再以捕捉的植原體DNA 為模板，用通用或特異引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，從而避免復(fù)雜的模板DNA 抽提過程，同時(shí)還提高植原體的檢測靈敏度[14]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)是指在常規(guī)PCR 反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，該探針與PCR產(chǎn)物雜交時(shí)，能檢測到熒光信號(hào)，因而熒光信號(hào)反映了PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量[18]。該技術(shù)比常規(guī)PCR具有更高的靈敏度、且能快捷簡便地定量檢測植物病原，還具有核酸雜交和光譜技術(shù)的高精確性和高特異性，在植原體檢測工作中具有廣闊的應(yīng)用前景。我國廖曉蘭等[19]首次將實(shí)時(shí)熒光PCR 法用于植原體病害的檢測，設(shè)計(jì)并合成椰子致死黃化、蘋果叢生、榆樹黃化3組植原體特異性熒光探針和植原體廣譜熒光探針，成功對(duì)植原體進(jìn)行分類鑒定[20]。

1.3.6 LAMP（環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）檢測

近年來，LAMP 檢測已被用于檢測寄主組織中的植原體，是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，該方法具有檢測成本低、速度快、操作簡易、特異性強(qiáng)、靈敏度高和可視化等優(yōu)點(diǎn)，非常適合在基層推廣和病害現(xiàn)場的快速檢測。2015年韓劍等[21]運(yùn)用LAMP技術(shù)建立棗瘋病植原體可視化檢測技術(shù)；2017年王圣潔等[18，22]建立寡核苷酸管芯片技術(shù)檢測和鑒別植原體技術(shù)體系，并利用LAMP 技術(shù)，以tuf基因?yàn)榘袠?biāo)擴(kuò)增5 種16SrⅠ組植原體。此外，還建立了一些替代診斷方法，例如異源雙鏈體移動(dòng)性測定[23]、單鏈構(gòu)象多態(tài)性[24]、T-RFLP[25]等。

1.4 植原體病害綜合治理

植原體病害以預(yù)防為主。加強(qiáng)檢疫與預(yù)防，利用寄主植物抗性、有效控制傳播介體、切斷傳播途徑并結(jié)合化學(xué)防治等方法來綜合治理。

1.4.1 農(nóng)業(yè)防治

植原體病害的農(nóng)業(yè)防治方法主要是消除侵染源，從源頭阻斷植原體的傳播，如加強(qiáng)植物檢疫，保證苗木及嫁接穗無病害；加強(qiáng)病蟲害防治，阻斷葉蟬、飛虱等刺吸式昆蟲的傳播，控制中間寄主。陽小勇等[26]提出測土配方防治方法，即測定土壤中各種養(yǎng)分的含量，缺哪種元素就進(jìn)行相對(duì)應(yīng)的補(bǔ)充，保持作物健壯，從而提高作物抗病力。

1.4.2 物理防治

主要是通過熱、冷處理的方法來脫除植物體內(nèi)的植原體。高溫對(duì)植原體的生長發(fā)育有直接的影響。低溫也能有效脫除植物體內(nèi)的植原體病原。

1.4.3 化學(xué)防治

植原體對(duì)四環(huán)素及其衍生物類藥劑較為敏感。2015年馮文全等[27]以呼和浩特市柳樹叢枝病為研究對(duì)象，用利福平、利福平+苯氧威和苯氧威等不同藥劑做藥效試驗(yàn)，結(jié)果表明3%的苯氧威對(duì)柳樹叢枝的抑制效果較為明顯。李巖峰等[28]報(bào)道四環(huán)素和阿維菌素兩種藥劑復(fù)配后通過噴灑和樹木輸液的方法，能夠有效防治植原體病害，還有助于殺死傳播介體昆蟲。也有人提出植物激素治療，但需要進(jìn)一步研究和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持[29]。

1.4.4 生物防治

在植物葉面噴施生物農(nóng)藥，如枯草芽孢桿菌，阿泰靈等可增加植物的抗性，有效緩解植原體對(duì)作物的危害。

1.4.5 選育抗病良種

劉曉光等[30]以棗瘋病植株培養(yǎng)苗中出現(xiàn)的疑似抗病株為材料，觀察并提取DNA進(jìn)行測定。在篩選的10株疑似抗病變異株中，經(jīng)過植原體檢測后發(fā)現(xiàn)其中3 株內(nèi)仍攜帶有少量植原體，進(jìn)一步對(duì)這些疑似變異株進(jìn)行DNA 水平的AFLP 分析，最終篩選出1株抗病株。

2 柳樹植原體病害研究現(xiàn)狀

2.1 為害癥狀

國內(nèi)外已見報(bào)道的柳樹植原體病害主要有柳樹叢枝（Willow witches-broom）、柳樹黃化（Willow yellows）、柳樹增生（Willow proliferation）和柳樹花變?nèi)~（Willow phyllody）等（圖1），并被劃分到16SrⅠ組、16SrⅥ組、16SrⅨ組和16SrⅫ幾個(gè)不同亞組。柳樹感染植原體后，由于植原體寄生于寄主韌皮部組織中，會(huì)隨著植物水分和養(yǎng)分運(yùn)輸?shù)綐潴w頂端，因此柳樹植原體病害的癥狀多發(fā)生于樹體新抽枝條或頂端；除表現(xiàn)出以上典型癥狀之外，還出現(xiàn)小葉、球狀結(jié)構(gòu)、非季節(jié)性落葉、枝條干枯等癥狀，隨著植原體含量不斷積累，樹體水分和養(yǎng)分供應(yīng)不足，最終造成樹木頂枯甚至死亡；另外，在部分干旱地區(qū)6—7月份溫度高、蒸發(fā)快，當(dāng)樹體感染植原體后，養(yǎng)分和水分會(huì)供應(yīng)不足，使柳樹提前進(jìn)入落葉期，樹葉發(fā)黃、脫落，造成非季節(jié)性落葉現(xiàn)象。

2.2 國內(nèi)研究現(xiàn)狀

我國最早報(bào)道該病害是在1992 年王純利[31]等發(fā)現(xiàn)新疆白柳叢枝病，當(dāng)時(shí)部分研究者認(rèn)為是由螨類危害引起的，但通過電子顯微鏡在柳樹韌皮部觀察到啞鈴狀無細(xì)胞壁顆粒，證明該叢枝病是由類菌原體引起；上世紀(jì)90年代植原體病害全疆各地均有發(fā)生，但由于當(dāng)時(shí)技術(shù)條件不足，未能從分子水平將其鑒定與分類。2005年朱天生等[32，33]調(diào)查南疆柳樹花變?nèi)~植原體病害，巴州地區(qū)發(fā)病率約10%，克州地區(qū)發(fā)病率為6%，喀什地區(qū)、圖木舒克市、阿克蘇地區(qū)、阿拉爾市和和田地區(qū)發(fā)病率分別為46%、51.3%、64.3%、51%和48%，2007年對(duì)來自新疆阿拉爾市的柳樹花變?nèi)~進(jìn)行鑒定，通過16SrRNA和rp基因分析將其劃分到AY 植原體組的16SrI-B 亞組。2009 年魏婷等[34]在陜西發(fā)現(xiàn)柳樹黃化植原體，并將其劃分于16SrΙ-C亞組。2011年Ana Alfaro-Fernan?dez[35]等報(bào)道西班牙東部地區(qū)發(fā)生柳樹植原體病害，發(fā)病柳樹表現(xiàn)出小葉、黃化和球狀的癥狀，將其劃分到16SrⅫ組。2012年張磊[36]等發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古鄂爾多斯市柳樹表現(xiàn)出叢枝、黃化、小葉、增殖和球狀等異常現(xiàn)象，對(duì)16SrDNA 進(jìn)行RFLP 分析將其劃分到16SrⅥ-A亞組，這是我國首次將植原體分類到16SrⅥ-A 亞組。Mou[37]等在2014 年報(bào)道湖南省元謀縣發(fā)現(xiàn)柳樹植原體病害，柳樹表現(xiàn)出叢枝和花變?nèi)~等異常癥狀，通過對(duì) 16SrRNA 基因、tuf基因和rp基因進(jìn)行分析，將其劃分至16SrΙ-B亞組。

2.3 國外研究現(xiàn)狀

國際上最早是1972 年Holmes[38]等在美國新罕布什爾州發(fā)現(xiàn)柳樹叢枝病，后來歐洲柳樹上也發(fā)現(xiàn)相似病害，研究者通過電子顯微鏡觀察到無細(xì)胞壁的形態(tài)多樣顆粒，證明該病害與美國發(fā)現(xiàn)的為同一類病害，由于當(dāng)時(shí)科學(xué)技術(shù)水平有限，無法證明其為植原體病害。1978年Varma[39]在印度也報(bào)道了柳樹叢枝病害。1994 年 Abdul-Hameed Khadha 等[40]在加拿大首次發(fā)現(xiàn)柳樹叢枝植原體病害，通過擴(kuò)增和分析16SrDNA基因發(fā)現(xiàn)其為三葉草增殖組成員，當(dāng)時(shí)柳樹叢枝病在加拿大幾種柳樹上普遍發(fā)生，另外還有部分植原體屬于翠菊黃花組（16SrΙ 組）。2017年Maryam Ghayeb Zamharir[41]等在伊朗發(fā)現(xiàn)柳樹叢枝表現(xiàn)出的癥狀與我國新疆和內(nèi)蒙報(bào)道的柳樹植原體引起的癥狀極其相似，經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育分析后認(rèn)為該植原體屬于16SrⅫ組，與西班牙柳樹叢枝植原體為同一組。2018 年 Fatemeh Shahryari 等[42]又報(bào)道伊朗柳樹增殖，經(jīng)過系統(tǒng)發(fā)育分析和RFLP分析，該植原體為16SrVI-A亞組成員。

3 結(jié)論與討論

自PCR技術(shù)出現(xiàn)以來，該技術(shù)對(duì)于植原體的檢測一直穩(wěn)定有效，LAMP 檢測提高時(shí)效性。由于植原體不能體外培養(yǎng)，DNA 獲取含量少，操作時(shí)容易污染；PCR 檢測過程也容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，不能準(zhǔn)確檢測植原體，需要通過測序獲得基因片段序列后才能確定，此過程代價(jià)較大，因此亟需開發(fā)有效快速的特異性檢測技術(shù)。

植原體病害在世界的分布范圍越來越廣，寄主范圍不斷擴(kuò)大，家族成員也越來越豐富。近年來，印度和伊朗報(bào)道柳樹植原體病害較多。柳樹不像梨、杏和棗等一些經(jīng)濟(jì)樹種能帶來直接經(jīng)濟(jì)效益，因此，柳樹植原體病害尚未納入檢疫性病害，對(duì)該病害的傳播、流行和防治等方面研究并不多。而柳樹植原體病害存在潛在的巨大危害，不僅嚴(yán)重危害柳樹，造成柳樹幾年內(nèi)干枯甚至死亡，導(dǎo)致嚴(yán)重的損失；另外植原體引起柳樹形成的叢枝、花變?nèi)~、增殖和球狀等癥狀，還會(huì)為部分農(nóng)業(yè)害蟲提供良好的越冬場所，間接對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)形成嚴(yán)重威脅。目前，亟需提出科學(xué)有效的防治措施來控制柳樹植原體病害傳播與發(fā)生，以減少農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)損失。