劉 悅 張雪松

(佳木斯大學(xué) 整形外科，黑龍江 佳木斯 154000)

P-PRP由抗凝全血通過離心或過濾獲得，含低濃度白細(xì)胞和高濃度血小板，P-PRP凝膠是加入激活劑形成的膠凍狀物，激活后，血小板通過脫顆粒作用釋放多種生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1和β2等[1]。本文就P-PRP的制備方案研究進(jìn)展做一綜述。

1 P-PRP的制備過程考查因素

1.1 制備人員的選擇

2019年Naoya Kikuchi等學(xué)者將2名具有制備經(jīng)驗(yàn)的骨科醫(yī)生作為E組，將只看了3次由BTI生物科技研究所制作的具有教育意義DVD的人設(shè)為NE組，比較兩組制備的PRP有無質(zhì)的差別，結(jié)果表明制備PRP的經(jīng)驗(yàn)對(duì)PRP的質(zhì)量沒有影響，但作者認(rèn)為還是應(yīng)盡量選擇有經(jīng)驗(yàn)的人制備[2]。

1.2 抗凝劑的選擇

枸櫞酸鹽抗凝是通過與Ca2+形成難解離的可溶性絡(luò)合物枸櫞酸鈣(ACD-A)。ACD-A更接近生理性凝血，有利于保護(hù)血小板內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，從而提高血小板的整體反應(yīng)性，所以ACD-A應(yīng)用更為廣泛[3, 4]?？鼓? mL 血液至少需要6 mg的枸櫞酸鹽，值得注意的是超過300 mL可能引起低鈣血癥等中毒反應(yīng)[5]。

1.3 離心力和離心時(shí)間的選擇

不同的離心參數(shù)對(duì)制備出的P-PRP有較為明顯的影響[6-9]。P-PRP制備方法包括血液過濾法和密度梯度離心法。Mccarrel TM等學(xué)者[10]采用The Purecell Select System for Whole Blood MNC Enrichment,根據(jù)制造商說明過濾血液，可得到白細(xì)胞減少血，再經(jīng)Smart Prep 2 system離心，并根據(jù)生產(chǎn)商說明重懸，得到白細(xì)胞減少PRP。由于其操作復(fù)雜，需要特殊設(shè)備及耗材，成本較高，所以密度梯度離心法應(yīng)用更為廣泛。密度梯度離心法基于斯托克斯定律。1851年，英國(guó)數(shù)學(xué)家、物理學(xué)家斯托克斯發(fā)現(xiàn)并提出這一定律，即液體都具有一定程度的粘滯性，體積較小的球形物體在層流速度較小的流體中運(yùn)動(dòng)時(shí)，粘滯阻力能夠運(yùn)用此定律來描述。該定律提示，血細(xì)胞在血漿中的沉降率隨離心力的增加而增加[11]，離心力可以加速血小板、白細(xì)胞，紅細(xì)胞在血漿中沉降，并且增加沉降速率的差別，最終在試管內(nèi)分為血漿層，白細(xì)胞層，紅細(xì)胞層。為最大限度回收血小板，還要選取恰當(dāng)?shù)碾x心時(shí)間，因其能夠確保沉降速率的差別。制備L-PRP與P-PRP的差別在于轉(zhuǎn)移白細(xì)胞層，應(yīng)用移液管轉(zhuǎn)移更為準(zhǔn)確有效。密度梯度離心法包括一次和兩次離心法，Sanchez M等學(xué)者[12]使用抗凝全血以580×g，8 min獲得P-PRP,其所含白細(xì)胞稀少，血小板濃度是全血的2～3倍，大量實(shí)驗(yàn)證明二次離心法提取率、血小板濃度更高，臨床應(yīng)用也更為廣泛。第一次選取較小的離心力能降低紅細(xì)胞間隙中血小板沉積，第二次選取略大的離心力有助于回收血小板且防止其早期被激活[13]。兩次離心法有兩個(gè)影響血小板回收率的主要因素，一是多數(shù)血小板保留在血漿層內(nèi)，沒有進(jìn)入白細(xì)胞層被遺棄，且所有白細(xì)胞均沉降至白細(xì)胞層內(nèi)，避免為了除去白細(xì)胞而損耗血小板；二是確保經(jīng)第二次離心獲取的P-PRP保留血漿層中的大多數(shù)血小板，而沒有因?yàn)樵谏蠈友獫{中懸浮而隨之丟棄[14]。Bausset O等學(xué)者使用抗凝全血經(jīng)Thermo Scientific 以130×g，15 min進(jìn)行軟旋轉(zhuǎn)，隨后進(jìn)行硬旋轉(zhuǎn)，時(shí)間為15 min，以不同離心速度進(jìn)一步濃縮血小板，離心速度分別為130×g、250×g、400×g、1 000×g，結(jié)果顯示250×g離心時(shí)血小板數(shù)量大于其他速度，說明高轉(zhuǎn)速可能對(duì)血小板功能有害，130×g離心時(shí)活化狀態(tài)的血小板更少，說明較低的離心速度更有利于血小板靜息狀態(tài)的保存，P-PRP中P-selection增加，意味著血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)性降低，與400×g相比，血小板濃度較低時(shí)，250×g離心速度血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)性略有改善，且形態(tài)變化較小[15]，因此250×g，15 min或許是富集40 mL抗凝全血中血小板的最佳第二次離心。但Magalon等學(xué)者發(fā)覺，Bausset法盡管在較多指標(biāo)方面強(qiáng)于現(xiàn)有的P-PRP制備方案，卻不能優(yōu)化血小板回收率[16]。殷文靖學(xué)者認(rèn)為產(chǎn)生這一結(jié)果的原因是Bausset等學(xué)者在沒有進(jìn)行試驗(yàn)研究的情況下果斷的選擇130×g，15 min作為第一次離心方案。前期實(shí)驗(yàn)證明，110×g，15 min或許導(dǎo)致部分白細(xì)胞遺留血漿層中，180×g，10 min或許導(dǎo)致白細(xì)胞層進(jìn)入多數(shù)血小板，另外，180×g，10 min與450×g，15 min之間的第二次離心都能使P-PRP中包含血漿層中的多數(shù)血小板。據(jù)此殷文靖等通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)選取110×g，15 min至180×g，10 min之間對(duì)PCP各細(xì)胞含量最有利及180×g，10 min至450×g，15 min之間對(duì)血小板功能最有利的兩次離心法最佳方案，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各P-PRP樣本中白細(xì)胞濃度、紅細(xì)胞濃度、白細(xì)胞清除率、紅細(xì)胞清除率、炎癥因子濃度、基礎(chǔ)血小板CD62P表達(dá)率接近，160×g，10 min能夠保證血小板功能并且除去白細(xì)胞和紅細(xì)胞以及盡可能回收血小板[14]，250×g，15 min 相對(duì)于較弱方案ADP誘導(dǎo)的CD62P表達(dá)率顯著升高，意味著可以保證血小板對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)性，與更強(qiáng)的離心方案相比血小板回收率和富集度無顯著差異，第二次離心是為了盡可能富集血小板并保護(hù)血小板功能，綜上所述，160×g，10 min續(xù)以250×g，15 min或許是使用40 mL抗凝全血制備P-PRP的最佳方案。

1.4 激活劑的選擇

將P-PRP運(yùn)用在臨床或科研研究時(shí)常應(yīng)用外源性激活劑將其激活，推動(dòng)生長(zhǎng)因子自血小板α顆粒釋放[17]。P-PRP樣本加入激活劑得到的凝膠內(nèi)生長(zhǎng)因子濃度可達(dá)到全血3～7倍[18]，凝血酶激活劑使血小板10 min內(nèi)釋放70%生長(zhǎng)因子，且能使幾乎全部生長(zhǎng)因子1小時(shí)內(nèi)釋放[19]，但常用的凝血酶激活劑通常為牛來源，牛凝血酶在使用中存在不確定性，因?yàn)槠湓谑褂眠^程中通常會(huì)形成人凝血蛋白抗體[20, 21]，可能引發(fā)致命性凝血紊亂，但Mrax認(rèn)為凝膠中的牛凝血酶劑量少，固化在P-PRP凝膠內(nèi)，且未進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，不會(huì)導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂[22]。凍融循環(huán)激活與Cacl2激活的PRP作比較，Cacl2激活可加速凝膠化支架中的纖維蛋白原，得到的P-PRP凝膠中PDGF-BB水平顯著升高[2]，而且與牛凝血酶相比其可以避免免疫反應(yīng)和疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)[23]，與生理凝血過程更相似，并使生長(zhǎng)因子釋放更持久[24]，因此Cacl2更適合作為激活劑使用，但其使用小口徑針頭時(shí)注射困難[25]，因此，在臨床中需要根據(jù)應(yīng)用部位和治療目的來選擇激活方法。

2 展望

P-PRP凝膠的制備方案隨著組織工程技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展出現(xiàn)多元化及成熟化的趨勢(shì)，不同制備方案擁有不同的優(yōu)點(diǎn)，依據(jù)某一項(xiàng)數(shù)據(jù)獨(dú)斷哪種制備方案最好是錯(cuò)誤的，雖然當(dāng)下P-PRP凝膠在臨床應(yīng)用中的效果存在爭(zhēng)論，但無可厚非的是，其在組織修復(fù)研究中有廣闊的應(yīng)用前景。