劉開莉 梁貴秋 許忠裕 周曉玲 肖 瀟 陸春霞*

(1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南寧市 530007)

隨著蠶桑業(yè)的發(fā)展，蠶蛹也不斷被人研究，其食用價值、醫(yī)藥價值以及其他領(lǐng)域的利用率相當高[1]。兩廣二號是廣西當前主要的家蠶品種，是由廣東省農(nóng)科院蠶業(yè)所與廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站(原廣西蠶業(yè)指導(dǎo)所)合作共同選育的品種，1996年通過全國農(nóng)作物品種審定委員會審定[2]。兩廣二號家蠶品種適合多個地區(qū)推廣飼養(yǎng)，具有體質(zhì)強健、抗病性強、好飼養(yǎng)等優(yōu)點[3]。其蠶蛹更是具有很高的經(jīng)濟價值，含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物、多酚等營養(yǎng)和活性成分[4]。生物總黃酮是指黃酮類化合物，是一類天然的產(chǎn)物，在植物界廣泛存在，是一類極具開發(fā)價值的化合物[5]。方洪帥等[6]通過提取葛根總黃酮對患有糖尿病的小鼠進行灌胃測定空腹血糖含量，表明總黃酮具有降血糖作用。黃酮類化合物還具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化以及保護心血管和肝臟等生理作用[7]。

總黃酮的提取方法有溶劑提取法[8]、超聲提取法[9]、酶制取法[10]等，本研究以兩廣二號品種家蠶為研究對象，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法[11]優(yōu)化蠶蛹總黃酮提取工藝，并選出最佳工藝測定蠶蛹總黃酮含量。通過研究，為蠶蛹的食藥功能和工藝研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹：廣西市售兩廣二號鮮蛹；蘆丁標準品、無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：國產(chǎn)分析純；實驗用水純水，實驗室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(JA3003，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器(JK-450DB，合肥金尼克機械制造有限公司)，紫外-可見分光光度計(TU-1810PC,上海光譜儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S2，金壇市易晨儀器制造有限公司)

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

鮮蛹經(jīng)過60 ℃恒溫干燥至恒重后，粉碎成粉，用索氏抽提法進行脫脂，直至磨砂玻璃棒上無油斑表明抽提完畢[12]。準確稱取0.1 g(精確到0.001 g)脫脂蠶蛹粉，加入一定體積的乙醇溶液，在100 w功率下超聲波處理一定的時間后，放于恒溫水浴鍋中抽提3 h，放置冷卻過濾得到的澄清液即為試樣液。

1.3.2 蘆丁標準曲線的繪制

取20 mg蘆丁標準品于50 mL的75%乙醇溶液中溶解，定容至100 mL，即蘆丁濃度為0.2 mg/mL。準確吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL標準溶液，用75%乙醇溶液定容至5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，加入4 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻充分反應(yīng)15 min。蘆丁質(zhì)量分別為：0 mg、0.1 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.4 mg、0.5 mg。以質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線(見圖1)，計算得回歸方程：A=0.5389x+0.0423，R2=0.9979。

1.3.3 蠶蛹總黃酮含量的測定

準確移取1 mL待測樣品液，按照標準曲線法測定待測液的吸光度值，由回歸方程計算出蠶蛹總黃酮的含量。

1.4 單因素試驗與響應(yīng)面試驗設(shè)計

1.4.1 單因素試驗設(shè)計

采用單因素試驗，分別考察料液比(1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，g/mL)、水浴提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲提取時間(20 min、30 min、45 min、60 min、75 min)、乙醇濃度(30%、45%、55%、65%、75%)等因素對蠶蛹總黃酮含量的影響，每個單因素試驗做3次重復(fù)。

1.4.2 響應(yīng)面試驗設(shè)計

參考單因素試驗的結(jié)果分析，選取料液比A(1∶60、1∶70、1∶80，g/mL)、水浴提取溫度B(60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲提取時間C(20 min、30 min、45 min)、乙醇濃度D(30%、45%、55%)等(如表1)，運用Design-Expert8.06軟件設(shè)計進行響應(yīng)面試驗并分析，確定蠶蛹總黃酮提取的最佳工藝。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平

1.5 響應(yīng)面試驗驗證

重復(fù)3次試驗驗證正交試驗得到的最佳工藝，分析計算蠶蛹總黃酮的提取含量，并求出相對標準偏差，以確保最佳條件的科學(xué)性和穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗數(shù)據(jù)采取直觀分析法分析，確定各因素對蠶蛹總黃酮含量影響的參數(shù)區(qū)間。在單因素的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.06軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果分析

2.1.1 料液比對蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗設(shè)計，在料液比分別為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)時，考察料液比對蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知：當溶劑從1∶40(g/mL)增加到1∶80(g/mL)時，總黃酮含量逐漸增加，在1∶70(g/mL)時，蠶蛹總黃酮含量達到最大5.28 mg/g，溶劑增大至料液比1∶80(g/mL)以后，蠶蛹總黃酮的含量趨于下降趨勢且不再上升。一般來說，溶劑增加有利于蠶蛹總黃酮的提取，含量也增加，到達一定的量時，總黃酮已充分提取，過多溶劑只會造成溶劑和能源的浪費。故選擇料液比為1∶70(g/mL)。

2.1.2 水浴提取溫度對蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗設(shè)計，分別在提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃時，考察水浴提取溫度對蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知：隨溫度的升高，總黃酮含量先增加再下降，在溫度為70 ℃時，總黃酮含量達到最大8.27 mg/g。其原因可能是溫度過高，使總黃酮成分發(fā)生變化，導(dǎo)致含量降低。故選擇提取溫度為70 ℃。

2.1.3 超聲提取時間對蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗設(shè)計，在提取時間分別為20 min、30 min、45 min、60 min、75 min時，考察超聲提取時間對蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知：隨提取時間的增加，總黃酮含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在提取30 min時達到最大值9.14 mg/g。提取時間增加，總黃酮含量趨于平緩且有下降趨勢，其原因可能是時間過長，使總黃酮成分發(fā)生變化而導(dǎo)致含量降低。綜合考慮，選擇提取時間為30 min。

2.1.4 乙醇濃度對蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗設(shè)計，在乙醇濃度分別為30%、45%、55%、65%、75%時，考察乙醇濃度對兩廣二號家蠶蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮含量呈先上升后平穩(wěn)下滑的趨勢，在45%時達到最大5.73 mg/g。乙醇濃度繼續(xù)升高，總黃酮含量下降，其原因可能是乙醇含量的增加使總黃酮提取率下降。故選擇乙醇濃度為45%。

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。響應(yīng)面試驗共有27個試驗點，其中22個析因點，5個中心點。應(yīng)用響應(yīng)面分析試驗結(jié)果，得到以蠶蛹總黃酮含量為響應(yīng)面的回歸方程為：

總黃酮含量=4.43-0.81A+0.51B+0.25C+1.55D-0.87AB-0.24AC-2.27AD+0.052BC-0.57BD-0.65CD+0.81A2-0.240B2+0.078C2+0.91D2

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 蠶蛹總黃酮回歸模型的方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果可知，模型P<0.0001，說明回歸模型極顯著；失擬項(P=0.2125>0.01)不顯著，說明模型擬合效果好，可信度高；模型相關(guān)系數(shù)=0.9854與調(diào)整確定系數(shù)=0.9708相差較近，說明該模型擬合程度好，可以用于指導(dǎo)蠶蛹總黃酮提取試驗設(shè)計。各因素對總黃酮含量的影響由大到小順序依次為乙醇濃度、料液比、水浴提取溫度、超聲提取時間。4個因素對蠶蛹總黃酮含量的影響均達極顯著。通過圖6各因素交互作用對蠶蛹總黃酮含量影響的響應(yīng)面等高線圖和三維圖，可直觀地反應(yīng)各因素對響應(yīng)值總黃酮含量的影響，并可以分析出各因素之間相互作用。

由圖6各因素交互作用對蠶蛹總黃酮含量影響的等高線圖和三維響應(yīng)面圖可知，料液比與水浴提取溫度的交互作用、料液比與乙醇濃度的交互作用、水浴提取溫度與乙醇濃度的交互作用、超聲提取時間與乙醇濃度的交互作用對蠶蛹總黃酮含量有顯著影響；料液比與超聲提取時間的交互作用、水浴提取溫度與超聲提取時間的交互作用對總黃酮的含量影響不顯著。

經(jīng)過Design-Expert8.06軟件分析，可以得出蠶蛹總黃酮提取的最佳條件為：料液比1∶60，水浴提取溫度79 ℃，超聲提取時間20 min，乙醇濃度55%,預(yù)測蠶蛹中總黃酮含量為10.54 mg/g。

2.3 優(yōu)化檢測條件驗證試驗

為了驗證優(yōu)化檢測條件的穩(wěn)定性和可靠性，按上述最佳檢測條件進行了3次重復(fù)性試驗，得到蠶蛹中總黃酮含量分為10.54 mg/g、10.50 mg/g、10.58 mg/g，平均值為10.54 mg/g，與預(yù)測值10.54 mg/g相比，相對標準偏差為0.30%。結(jié)果表明此工藝可靠、穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本研究采取單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗的方法，在考察料液比、水浴提取溫度、超聲提取時間、乙醇濃度分別對蠶蛹總黃酮含量影響的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.06軟件的中心組合設(shè)計方法設(shè)計響應(yīng)面試驗，得到各因素對蠶蛹總黃酮含量影響的大小順序依次為乙醇濃度、料液比、水浴提取溫度、超聲提取時間。優(yōu)化蠶蛹總黃酮檢測的最佳條件為料液比1∶60、提取溫度79 ℃、提取時間20 min、乙醇濃度55%。在該檢測條件下，蠶蛹中總黃酮含量為10.54 mg/g。本研究為兩廣二號蠶蛹總黃酮的檢測以及開發(fā)利用提供了有利依據(jù)。