董雅容，楊 靜，寧鈞暉，王進(jìn)忠，王 合，田國(guó)忠，任爭(zhēng)光*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206；2. 北京市林業(yè)保護(hù)站，北京 100029；3. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091)

植原體(Phytoplasma)原稱類菌原體(Mycoplasma-like organism，MLO)，是一種重要的原核生物植物病原菌[1]。植原體隸屬軟壁菌門(Tenericutes)，柔膜菌綱(Mollicutes)，候選植原體屬(CandidatusPhytoplasma)，其主要特征是缺乏細(xì)胞壁，只有細(xì)胞膜包被[2-3]。植原體主要存在于植物韌皮部中的篩管細(xì)胞和介體昆蟲的淋巴、腸道、唾液腺等組織內(nèi)，能夠引起多種農(nóng)作物、園藝作物和園林植物病害，導(dǎo)致植物產(chǎn)生叢枝、黃化、花變?nèi)~、帶化等癥狀，嚴(yán)重者造成植物死亡[4]。中國(guó)報(bào)道的植原體相關(guān)病害有100余種，危害嚴(yán)重的主要有棗瘋病(Jujube witches’ broom，JWB)、泡桐叢枝病(Paulownia witches’ broom，PaWB)和桑萎縮病(Mulberry drawf，MD)等[5-6]。棗瘋病是棗樹生產(chǎn)上最嚴(yán)重的自然災(zāi)害，棗樹一旦得病將終生帶病，并具有強(qiáng)傳染性、難以治愈，高致死性的特點(diǎn)，被稱為棗樹的“癌癥”[7]。植原體與寄主的互作關(guān)系是植原體病理學(xué)研究的核心問題，由于沒有細(xì)胞壁，植原體分泌的蛋白和膜蛋白直接接觸寄主植物和昆蟲細(xì)胞。Clark等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)植原體表面參與膜組成的幾種蛋白具有免疫優(yōu)勢(shì)活性，稱之為免疫膜蛋白。目前的研究表明，植原體膜上發(fā)揮互作功能的免疫膜蛋白主要有3種，即免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白(immunodominant membrane protein，Imp)，免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白A(immunodominant membrane protein A，IdpA)和抗原膜蛋白(antigenic membrane protein，Amp)，其中Imp蛋白可以識(shí)別寄主植物的肌動(dòng)蛋白并與之結(jié)合，幫助植原體固定在寄主植物篩管分子表面，Amp蛋白則能與傳播昆蟲的肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白互作，從而利于植原體的傳播[10-11]。雖然這3種蛋白在植原體中普遍存在，但是它們之間在氨基酸序列上沒有相似性，不同組別的植原體之間的同一免疫膜蛋白氨基酸序列差異也很大[12]。

研究前期對(duì)棗瘋病植物樣本進(jìn)行了高通量測(cè)序，獲得大量棗瘋植原體序列，通過篩選得到編碼免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白的基因imp-DZ。該研究對(duì)imp-DZ基因進(jìn)行了克隆，并探索Imp-DZ蛋白的異源表達(dá)情況，為下一步深入研究棗瘋植原體致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

棗瘋病樣品采集自北京市昌平區(qū)發(fā)病冬棗樹上。植物基因組DNA提取試劑盒，pBM30快速克隆試劑盒購(gòu)自北京博邁德生物技術(shù)有限公司。菌株EscherichiacoliBL21(DE3)和E.coliDH5α，DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒，His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 棗瘋植原體imp-DZ基因序列分析 根據(jù)北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)棗瘋病植物樣品總DNA高通量測(cè)序結(jié)果(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，篩選出棗瘋植原體JWB-Dongzao編碼免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白基因imp-DZ的完整序列。將該序列在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用Blastn軟件進(jìn)行比對(duì)分析，并下載其他植原體imp基因相關(guān)序列，利用DNAMAN5.0軟件進(jìn)行基因完全比對(duì)，用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白Imp-DZ特征分析 用DNAMAN5.0軟件對(duì)imp-DZ基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行翻譯，用SignalIP4.1在線預(yù)測(cè)軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)對(duì)Imp-DZ蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行分析，用TMHMM v2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)Imp-DZ蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 植物總DNA的提取 取0.1 g患棗瘋病棗樹(冬棗)幼嫩葉片，用液氮研磨成粉末，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，溶解在無菌水中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4imp-DZ基因引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增 根據(jù)1.2.2中Imp-DZ蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增完整imp-DZ基因序列(不包含終止密碼子)引物Imp-F(5′-CACCATGAGAGGAAAGAA GAAAATGC-3′)和Imp-R (5′-TTTGTTAATAACTGCAATTGCTG-3′)；同時(shí)設(shè)計(jì)引物Imp-F2(5′-CACCAAAGAAGTTTGGCCATTCG-3′)與Imp-R配對(duì)用于擴(kuò)增去掉跨膜區(qū)核苷酸的imp-DZ基因部分序列。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[5]。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化回收。

1.2.5imp-DZ基因克隆與異源表達(dá) 將1.2.4中回收的2個(gè)DNA片段連接到蛋白表達(dá)載體pBM30上，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α中，將陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。挑選測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，獲得重組菌。將重組菌接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)3～5 h，菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8時(shí)，加入IPTG(50 μg/mL)誘導(dǎo)表達(dá)6～8 h。將誘導(dǎo)好的菌液在12 000 r/min離心1 min，收集菌體，加入蛋白上樣緩沖液，沸水中煮5 min，置于冰上備用，即為樣品總蛋白，同時(shí)用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒對(duì)總蛋白進(jìn)行純化。樣品總蛋白用15% SDS-PAGE電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗瘋植原體imp-DZ基因序列分析結(jié)果

前期利用二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)棗瘋病樣品(冬棗)總DNA進(jìn)行測(cè)序，去除棗樹DNA序列后，獲得大量棗瘋植原體JWB-Dongzao的序列，通過篩選基因注釋結(jié)果，找到編碼產(chǎn)物為免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白的基因imp-DZ，基因大小459 bp。將該基因序列放入NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核酸比對(duì)分析，imp-DZ與棗瘋植原體Jwb-nky全基因組(GenBank登錄號(hào)：CP025121)中一個(gè)編碼假定蛋白(hypothetical protein)的基因核苷酸一致性(identity)為96%。下載其他植原體的imp基因序列，進(jìn)行全基因和編碼氨基酸序列比對(duì)分析(表1)。imp-DZ基因序列僅與同組(16SrV)的葡萄黃化植原體FD-C Piemonte和FD-D，榆樹黃化植原體ULW的imp基因核苷酸一致性在56%左右，氨基酸一致性在30%以上，與其他植原體imp基因一致性均低于50%，說明不同植原體imp基因間的差異非常大。利用MEGA 5.2軟件構(gòu)建imp基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)，JWB-Dongzao的植原體與16SrV組植原體聚在一個(gè)大的分枝上，說明imp基因仍具有一定的保守性。

表1 imp-DZ基因與其他植原體imp及相關(guān)基因一致性比較結(jié)果Tab.1 The consistency comparison of imp-DZ gene with other phytoplasma imp genes

注：棗瘋植原體Jwb-nky為編碼假定蛋白(hypothetical protein)基因。

Note: The gene of Jwb-nky phytoplasma was hypothetical protein gene.

2.2 Imp-DZ蛋白特征分析結(jié)果

用DNAMAN5.0軟件對(duì)植原體JWB-Dongzao的imp-DZ基因進(jìn)行翻譯，獲得152個(gè)氨基酸序列，分子量大小約為16.8 kD，等電點(diǎn)10.35。將Imp-DZ的氨基酸序列用SignalIP4.1軟件進(jìn)行分析，Imp-DZ不具有信號(hào)肽(數(shù)據(jù)未顯示)。用TMHMM v2.0軟件對(duì)Imp-DZ的跨膜區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖2)，Imp-DZ蛋白具有一個(gè)明顯的跨膜區(qū)，跨膜區(qū)起始位置為第21個(gè)到第42個(gè)氨基酸(aa)；1-20 aa為疏水區(qū)域在細(xì)胞內(nèi)部，43-152 aa為親水區(qū)域在細(xì)胞外部。

2.3 imp-DZ基因的PCR擴(kuò)增與克隆

利用引物對(duì)Imp-F/Imp-R和Imp-F2/Imp-R分別對(duì)imp-DZ的完整基因(去除終止密碼子，大小456 bp)和去除編碼跨膜區(qū)的核酸序列(去除前126個(gè)核苷酸和終止密碼子，大小330 bp)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果見圖3。擴(kuò)增產(chǎn)物均在200～500 bp之間，和預(yù)計(jì)值大小相當(dāng)。將兩個(gè)PCR擴(kuò)增片段(分別命名為I4和I3)克隆到蛋白表達(dá)載體pBM30上，陽性克隆送公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)與高通量測(cè)序結(jié)果一致，分別得到重組質(zhì)粒pBMI4和pBMI3。

2.4 Imp-DZ蛋白的異源表達(dá)結(jié)果

將重組質(zhì)粒pBMI4和pBMI3分別轉(zhuǎn)入菌株E.coliBL21(DE3)中，在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)6 h，分別加入IPTG后立即取菌體和誘導(dǎo)6 h后取菌體。菌體裂解后SDS-PAGE檢測(cè)表達(dá)蛋白，結(jié)果見圖4。與IPTG誘導(dǎo)0 h的蛋白相比，含有pBMI4的重組菌體誘導(dǎo)6 h后并沒有出現(xiàn)過量表達(dá)的蛋白，而包含pBMI3的重組菌體在誘導(dǎo)6 h后在15～25 kD之間靠近15 kD處出現(xiàn)表達(dá)量明顯增多的條帶，大小和預(yù)計(jì)的融合蛋白一致(去除跨膜區(qū)后加上載體融合序列蛋白的大小為19 kD)；將包含pBMI3的重組菌體蛋白用His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化回收，在同一位置有單一蛋白條帶出現(xiàn)。說明克隆完整imp-DZ基因的重組質(zhì)粒(pBMI4)在大腸桿菌中并沒有表達(dá)，而去掉跨膜區(qū)后(pBMI3)，Imp-DZ蛋白得到大量表達(dá)。

3 討 論

該研究從棗瘋植原體JWB-Dongzao(16SrV組B亞組)的高通量測(cè)序結(jié)果中篩選到免疫優(yōu)勢(shì)膜蛋白編碼基因imp-DZ，與imp-DZ基因序列一致率最高的是16SrV組A亞組的榆樹黃化植原體ULW，C亞組的葡萄黃化植原體FD-C Piemonte和FD-D，但氨基酸一致率僅有30%左右，由此可見Imp蛋白在不同亞組成員之間仍存在著較大差異。利用imp基因核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)樹，棗瘋植原體同16SrV組其他植原體聚在一起，說明16SrV組植原體的imp基因仍具有共同的起源。

植原體的3種免疫膜蛋白(Imp、IdpA、Amp)雖然在氨基酸水平上無相似性，但有一些共同的特點(diǎn)，即都是鑲嵌在細(xì)胞膜上的蛋白，靠近兩端(N端和C段)有疏水區(qū)域構(gòu)成的跨膜區(qū)。不同的是Imp蛋白一般具有一個(gè)跨膜區(qū)，靠近N端，C端是親水區(qū)域裸露在細(xì)胞外部，而IdpA和Amp兩端具有2個(gè)跨膜區(qū)，中間部分為親水區(qū)域在細(xì)胞外部[13]。然而，正是由于這些跨膜區(qū)的存在影響免疫膜蛋白的異源表達(dá)。例如岳紅妮等[14]在用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)泡桐叢枝植原體PaWB-Shaanxi的Amp蛋白進(jìn)行表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn)，表達(dá)免疫膜蛋白全長(zhǎng)基因和切除C端的跨膜區(qū)均未檢測(cè)到相應(yīng)表達(dá)蛋白。牟海青等[15]只克隆泡桐叢枝植原體抗原膜蛋白amp基因中間編碼親水區(qū)域的核苷酸片段進(jìn)行異源表達(dá)，結(jié)果成功表達(dá)相應(yīng)的蛋白。同樣的，在E.coli中表達(dá)Imp的完整蛋白時(shí)，大腸桿菌的生長(zhǎng)受阻，表達(dá)出的蛋白較少或無法表達(dá)出蛋白，而去掉跨膜區(qū)后能成功高表達(dá)Imp蛋白[10,12]。該試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)這一現(xiàn)象，棗瘋植原體JWB-Dongzao的Imp-DZ具有一個(gè)跨膜區(qū)，無外泌信號(hào)肽，只有去掉跨膜區(qū)后才能成功表達(dá)出Imp-DZ蛋白。這種現(xiàn)象可能與植原體跨膜蛋白對(duì)大腸桿菌具有毒性有關(guān)，過量表達(dá)疏水膜蛋白可能導(dǎo)致大腸桿菌膜蛋白合成途徑飽和，導(dǎo)致大腸桿菌因ATP合成不足而死亡[16]。也有研究顯示表達(dá)攜帶跨膜區(qū)的Imp蛋白主要以包涵體形式存在，另外溫度，加入IPTG時(shí)大腸桿菌的濃度，IPTG的終濃度和誘導(dǎo)時(shí)間都會(huì)影響Imp蛋白的表達(dá)量[17]。

該研究對(duì)棗瘋植原體的免疫膜蛋白imp-DZ基因進(jìn)行克隆，對(duì)基因和蛋白編碼序列進(jìn)行分析，并在大腸桿菌中成功表達(dá)Imp-DZ蛋白，為后續(xù)特異性抗體制備和開發(fā)植原體免疫檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步了解植原體與寄主植物互作機(jī)理提供依據(jù)。