程如楠，孔梓安，曹 莉，孫 路，岳 亮，王 真

(北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206，中國)

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCV)是引起新生犢牛拉稀、成年牛冬痢和呼吸道疾病的重要病原之一[1]。自19世紀(jì)70年代Mebus等[2]首次在腹瀉犢牛和成年牛糞便中檢測出牛冠狀病毒之后，在多個國家相繼發(fā)現(xiàn)了牛冠狀病毒，目前牛冠狀病毒病廣泛流行于世界各國，對養(yǎng)牛業(yè)影響很大。由于牛冠狀病毒病的治療沒有特效藥，早期診斷和疫苗接種是目前較有效的預(yù)防措施[3]。目前，牛冠狀病毒的檢測方法有病毒分離鑒定、電鏡鑒別、中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、RT-PCR等，而這些方法不同程度存在操作復(fù)雜、容易出現(xiàn)誤差、費(fèi)時費(fèi)力且價格昂貴等問題。而利用指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)獲得的適配體特異性好、成本低、易于合成和保存，且具有抗體相似的特性，能很好解決現(xiàn)有診斷方法的缺陷。

牛冠狀病毒基因約27～32 kb，包含2個開放閱讀框和5個結(jié)構(gòu)蛋白基因，分別表達(dá)棘突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)、小膜蛋白(E)、包膜蛋白(M)和血凝素-酯酶蛋白(HE)5種[4]。N蛋白通過與基因組RNA、M蛋白之間相互作用，在病毒體中發(fā)揮重要的結(jié)構(gòu)作用；參與基因組RNA合成的復(fù)雜機(jī)制，與病毒復(fù)制酶-轉(zhuǎn)錄酶復(fù)合物密切相關(guān)[5]。N蛋白除參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程外，還可增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫，產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)[6-7]。由于N蛋白基因序列高度保守，N蛋白常作為該病的檢測抗原。

適配體也稱核酸適配體，是基于SELEX從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選出與靶標(biāo)高特異性、高親和力結(jié)合的DNA或RNA小片段單鏈[8]。靶分子可以是核酸、肽、蛋白、細(xì)胞等多種物質(zhì)，而且適配體成本低、免疫原性低和可化學(xué)修飾的優(yōu)點(diǎn)使其成為生物領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

該研究首先原核表達(dá)出高純度高濃度的N蛋白，借助SELEX篩選獲得牛冠狀病毒N蛋白的特異性核酸適配體，為后續(xù)建立酶聯(lián)適配體方法奠定基礎(chǔ)，對牛冠狀病毒病的診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛冠狀病毒N蛋白編碼基因及擴(kuò)增引物(均由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)，人工合成隨機(jī)寡核苷酸庫(84 bp)5′-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-(N)40-CTGCAGGTCGAC GCATGCGCCG-3′(N=A，T，C，G)及適配體篩選特異性引物(由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成)；原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+) (北京農(nóng)學(xué)院動物疫病防控研究室保存)；BamHⅠ、XhoⅠ限制性內(nèi)切酶(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、短片段DNA膠回收試劑盒、零背景pTOPO-TA Simple克隆試劑盒和PCR所用試劑(均購自北京艾德萊生物科技有限公司)；BL21和DH5a感受態(tài)細(xì)胞(均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司)；His標(biāo)簽可溶性蛋白純化試劑盒(購自康為世紀(jì)生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純(購自國藥集團(tuán))；相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2 方 法

1.2.1 N蛋白重組表達(dá)載體構(gòu)建 借助 Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)N蛋白編碼基因特異性擴(kuò)增引物，并將BamHⅠ、XhoⅠ 酶切位點(diǎn)分別插入上游引物和下游引物中。以合成的N蛋白編碼基因序列為模板，擴(kuò)增目的基因(PCR體系：2×Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，目的基因模板2 μL，ddH2O為21 μL；PCR程序：預(yù)變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 40 s，退火64 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，延伸10 min，共30個循環(huán))，并按照質(zhì)粒提取試劑盒說明書從37 ℃過夜培養(yǎng)含pET-28a(+)的E.coli中提取pET-28a質(zhì)粒。將擴(kuò)增的基因產(chǎn)物及提取的質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切、電泳、純化，其中酶切體系為質(zhì)粒40 μL、10×Buffer 5 μL、ddH2O 1 μL、BamHⅠ 2 μL、XhoⅠ 2 μL，純化根據(jù)膠回收試劑盒說明書進(jìn)行。隨后二者于22 ℃水浴鍋連接2 h。連接體系(20 μL)為目的基因12 μL、質(zhì)粒5 μL、Buffer 2 μL、ddH2O 0.5 μL、T4 DNA連接酶0.5 μL。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞中，使用卡那抗性的LB平板培養(yǎng)，篩選轉(zhuǎn)化成功的陽性克隆。最后挑取陽性克隆增菌培養(yǎng)2 h，并將其為模板進(jìn)行擴(kuò)增，以鑒定目的基因是否成功導(dǎo)入，若出現(xiàn)陽性條帶則送公司測序進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2.2 N蛋白的表達(dá)和純化 取1.2.1步驟獲得的陽性菌液進(jìn)行平板劃線，用卡那抗性的LB培養(yǎng)基，于37 ℃搖床培養(yǎng)單菌落至OD600=0.6。此時加IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)培養(yǎng)2、4、6 h的菌液用SDS-PAGE鑒定分析，并設(shè)置未誘導(dǎo)組和空載體為對照。前期SDS-PAGE分析得知牛冠狀病毒最佳表達(dá)條件是終濃度1 mmol/L IPTG 37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h，且該蛋白為上清表達(dá)。對誘導(dǎo)得到的菌液離心、洗滌，加入適量磷酸鹽緩沖液懸浮菌體，超聲法裂解細(xì)菌，離心保留上清溶液。使用康為世紀(jì)可溶性蛋白純化試劑盒對上清中的目的蛋白進(jìn)行純化，為提高純化效率，利用試劑盒中原有Binding Buffer(NP-10)和Elution Buffer(NP-500)按一定比例配置咪唑?yàn)?0 mmol/L的Binding Buffer(NP-40)。先用10倍柱體積的NP-10平衡層析柱，隨后將N蛋白進(jìn)行掛柱，再用10倍柱體積的NP-40將多余雜蛋白洗去，最后用NP-500把目的蛋白洗脫下來，洗脫流速為1 mL/min。前3滴洗脫液棄去，其他洗脫液需收集保存進(jìn)行檢測。取50 μL純化的蛋白與10 μL 6×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，然后進(jìn)行SDS-PAGE檢測純化結(jié)果，純化得到的蛋白可長時間保存在-80 ℃。

1.2.3 N蛋白核酸適配體的篩選 將N蛋白包被在ELISA酶標(biāo)板上，4 ℃過夜；倒掉包被液后用HEPEST洗3次并拍干；加入含有3%的BSA的HEPES，37 ℃封閉2 h；HEPEST洗滌后，加入適配體文庫孵育2 h，再洗4次；加核酸洗脫液，采用酚抽提法提取洗脫液中的適配體；最后對適配體分別進(jìn)行一輪對稱和非對稱PCR(對稱PCR體系為2×Mix 25 μL，WZ-02 1 μL，WZ-04 1 μL，適配體 3 μL，去離子水 20 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共15個循環(huán)。非對稱PCR體系為2×Mix 25 μL，WZ-02 1 μL，WZ-04 0.02 μL，適配體 5 μL，去離子水 19 μL；非對稱PCR反應(yīng)程序與對稱PCR基本相同，循環(huán)設(shè)為28次)。純化的適配體由小片段DNA膠回收試劑盒收集。為了避免非特異性結(jié)合，第5輪起執(zhí)行反篩操作：在包被時設(shè)置無N蛋白包被液的反篩孔，其他步驟不變。

1.2.4 核酸適配體序列測定 最后一輪篩選出的適配體PCR產(chǎn)物(84 bp)連接到T載體(約160 bp)上，并把得到的連接產(chǎn)物(約240 bp)轉(zhuǎn)化DH5а感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃搖床培養(yǎng)1～2 h，經(jīng)離心濃縮后取200 μL涂在卡那抗性LB固體平板上，置37 ℃溫箱培養(yǎng)18 h。使用通用引物M13R和M13F擴(kuò)增平板上的白色單菌落，經(jīng)電泳挑選出條帶大小符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物送公司測序。

1.2.5 間接酶聯(lián)適配體試驗(yàn)(I-ELAA)測定適配體KD值 先對第11輪篩選并測序成功，且重復(fù)頻率高的3條適配體(N-12、N-33和N-45)在5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記，再使用I-ELAA法測定各條適配體的親和力。首先，將0.5 mg/mL的N蛋白包被酶標(biāo)板，4 ℃冰箱過夜，次日使用HEPEST洗板3次，加入1% BSA，37 ℃封閉2 h，向孔中加入0～100 nmol/L不同濃度的Bio-aptamer，37 ℃作用1 h后重復(fù)洗板5次，然后向孔中加入1∶6000稀釋的二抗 HRP-SA，37 ℃作用1 h，洗板后顯色，用酶標(biāo)儀測定每孔450 nm處吸光光度值(OD)大小。根據(jù)公式Y(jié)=Bmax/(KD+X)計(jì)算每條適配體KD值。其中Y是OD450平均值；Bmax是OD450最大值；X是適配體濃度。

1.2.6 核酸適配體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 將測序結(jié)果在核酸結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件MFOLD分析其二級結(jié)構(gòu)，軟件網(wǎng)址為http://mfold.rit.albany.edu。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 牛冠狀病毒N蛋白編碼基因的擴(kuò)增

使用合成的引物對N蛋白編碼基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的PCR產(chǎn)物上樣、電泳，獲得約1 363 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，說明成功擴(kuò)增出N蛋白編碼基因，見圖1。

2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE檢測

加入IPTG誘導(dǎo)6 h后，經(jīng)SDS-PAGE檢測，成功在上清中表達(dá)出相對分子質(zhì)量約為55 kD的目的蛋白，見圖2。

2.3 N蛋白適配體的篩選

利用微孔板法對N蛋白的適配體進(jìn)行篩選，共篩選11輪。使用引物WZ-02和WZ04對篩選出的適配體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，配制2%瓊脂糖凝膠并將對稱PCR產(chǎn)物和非對稱PCR產(chǎn)物上樣電泳。凝膠成像儀顯示擴(kuò)增產(chǎn)物約84 bp，大小符合預(yù)期。部分PCR結(jié)果見圖3和圖4。

2.4 菌液PCR鑒定及序列測定

菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖5。將第11輪篩選的PCR產(chǎn)物與T載體連接后轉(zhuǎn)化的DH5а感受態(tài)細(xì)胞涂板培養(yǎng)，使用M13F和M13R通用引物對135個單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物

編號Number核酸隨機(jī)序列Random sequence of nucleic acid重復(fù)次數(shù)RepeatN-12TAAAGCAACACGAATCCCCACACAGACATCGAAATGCGG8N-33ATTAAAAAACATTGGACTATAAACATGTATTGCCCGGTGC14N-45GGCCTGCGTCATTTCACTTGCGCTGCCATTATCTTCTCTC11

進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出123個陽性克隆，部分PCR電泳如圖5所示。提取123個菌液的質(zhì)粒送樣測序，共測出67條序列，其中N-12、N-33和N-45重復(fù)次數(shù)較多，說明這3條適配體對N蛋白具有較高的親和力，其核苷酸序列見表2。

2.5 適配體KD值測定

適配體N-12、 N-33和 N-45出現(xiàn)的頻率較高，故使用I-ELAA試驗(yàn)對其KD值進(jìn)行測定(表2)。使用軟件GraphPad Prism 5.0處理數(shù)據(jù)，公式Y(jié)=Bmax/(KD+X)算出3條核酸適配體KD值分別為32.81 nmol/L±4.75 nmol/L、19.61 nmol/L±8.36 nmol/L和21.01 nmol/L±5.48 nmol/L，其中N-12的KD值較高。此3條核酸適配體KD值均在納摩爾級，符合試驗(yàn)要求。

2.6 適配體二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

使用在線軟件預(yù)測適配體N-12、N-33和N45的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示，3條特異性適配體均具有各式的環(huán)狀、發(fā)卡狀結(jié)構(gòu)。

3 討 論

對牛冠狀病毒病檢測技術(shù)而言，檢測的靈敏度、特異性、穩(wěn)定性、成本及操作方法的簡便性等方面非常重要?；诳贵w的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，在抗體的提取和純化上存在步驟煩瑣、成本高、不穩(wěn)定、制備時間長等缺點(diǎn)。而與抗體相比，核酸適配體既可人工快速合成，而且在高溫等條件下更加穩(wěn)定，能在變性和復(fù)性中保持功能[9-10]。此外核酸適配體具有低免疫原性、易于化學(xué)修飾、低成本的良好特性。適配體具備如此多的優(yōu)勢，有望替代抗體建立新的疾病檢測方法。為了探索新的經(jīng)濟(jì)有效的牛冠狀病毒病診斷方法，該試驗(yàn)基于核酸-蛋白特異性結(jié)合原理，利用原核表達(dá)系統(tǒng)和SELEX，對核衣殼蛋白的核酸適配體進(jìn)行篩選。經(jīng)微孔板法多次、反向篩選最終得到多條與N蛋白特異性結(jié)合的適配體。其中N-12、N-33和N-45這3條適配體序列重復(fù)率較高。適配體篩選有多種方法，該研究中選用微孔板法進(jìn)行篩選，雖然耗時較長但對靶分子、儀器的要求低，低成本條件下仍能獲得特異性適配體。核酸適配體通過形成特定的二級結(jié)構(gòu)如發(fā)夾、環(huán)狀、凸起、G4聚體等與靶分子特異性結(jié)合，達(dá)到識別目的[11]。該研究中所得N-12、N-33和N-45適配體均具有結(jié)構(gòu)各式的環(huán)狀和發(fā)卡結(jié)構(gòu)，與牛冠狀病毒N蛋白空間結(jié)構(gòu)上特異性結(jié)合。故N-12、N-33和N-45在牛冠狀病毒病檢測方面具有應(yīng)用潛能，后續(xù)將使用N-12、N-33和N-45適配體，優(yōu)化和建立一種酶聯(lián)適配體的檢測方法，為牛冠狀病毒病的早期快速診斷奠定基礎(chǔ)。