楊貴軍 劉鼎闊 劉芳 李源 胡鵬程 林霖雨 管振國/天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300383

針對奶牛乳房炎這一疾病，國內(nèi)外很多學(xué)者對其進(jìn)行了深入研究，但目前這一疾病仍舊是導(dǎo)致奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等病原微生物是造成奶牛乳房炎最為主要的病原體。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，乳酸鏈球菌素對奶牛乳房炎具有顯著的治療效果。同時(shí)，有研究表明，乳酸鏈球菌素在一定條件下對金黃色葡萄球菌具有抑制作用。

1 試驗(yàn)?zāi)康?/h2>

本試驗(yàn)旨在檢測改構(gòu)乳酸鏈球菌素在一定濃度范圍內(nèi)對奶牛乳房炎主要致病菌是否具有抗菌活性。

2 試驗(yàn)材料

2.1 菌株鏈球菌（Streptococcus）臨床菌株L 1473、L 4732、L 2348、L 2853、L 1463 和L 5321 與大腸桿菌分離株來自同樣的兩個奶牛場的乳房炎患牛；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 1717 和ATCC 29213：購 自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）；臨床菌株S 1963、S3210、S1689 和S2425 與鏈球菌、大腸桿菌分離株來自同樣的兩個奶牛場的乳房炎患牛。大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 43895 和ATCC 43890：購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC）；臨 床菌株EC3521、EC5632、EC3478 及EC2569大腸桿菌分離株：取自兩個奶牛場的乳房炎患牛。

2.2 儀器UV～2600 型紫外可見分光光度計(jì)（上海尤尼柯）；電子天平（深圳市恒志?？萍加邢薰荆?；8037～SVD 壓力蒸汽滅菌鍋（山東博科消毒設(shè)備有限公司）；THZ～82 恒溫?fù)u床（上海躍進(jìn)）；微量移液器（德國艾本德）；超凈工作臺、生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)）；其它玻璃儀器（北京鼎國）。

2.3 藥品和試劑供試品：改構(gòu)乳酸鏈球菌素，由天津市生物飼料添加劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。效價(jià)：2000IU，經(jīng)檢驗(yàn)合格。

MH 肉湯培養(yǎng)基（MHB）（BD Biosciences）；二甲基亞砜（DMSO）（sigma）。

2.4 試驗(yàn)所需試劑的配制

（1）藥物配制：精確稱取改構(gòu)乳酸鏈球菌素，溶解于DMSO 中，配制成濃度為51200 μg/mL 的母液，備用。

（2）MHB 培養(yǎng)基：稱取MHB 粉末21.0 g，加熱溶解于1000mL 蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，備用。

3 試驗(yàn)方法

3.1 細(xì)菌培養(yǎng)取各受試菌的甘油保存液，以1∶100 接種到3～5mL 各自適宜的培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中震蕩培養(yǎng)18～24 h，再劃線接種于瓊脂平板上，置于37℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。挑取各平板上的單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，再次劃線接種于瓊脂平板上。生化培養(yǎng)箱中靜置過夜后，用封口膜密封，置于4℃環(huán)境保存。再次挑取各平板上的單菌落，接種于MHB 培養(yǎng)基中，置于37℃搖床中振蕩培養(yǎng)10～12 h 至對數(shù)生長期。應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測定OD600，用MHB 培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)菌濃度至5×108CFUs/mL，待用。

3.2 最小抑菌濃度（MIC）的測定取高壓滅菌后的試管置于超凈工作臺中，12 支試管為一行。每行第一支試管中加入1975 μL MHB 培養(yǎng)基，其余試管均加入1mL 培養(yǎng)基。然后于第1 個試管中加入改構(gòu)乳酸鏈球菌素儲備液25 μL，混勻后依次進(jìn)行倍比稀釋（藥物經(jīng)稀釋后DMSO 含量不超過1%），使得改構(gòu)乳酸鏈球菌素的濃度依次為512、256、128……1 μg/mL 共10 個濃度梯度。同時(shí)設(shè)陽性對照。而最后一支為不加待測藥物的陰性對照。每支試管中加入5 μL 稀釋后的菌液，使得每支試管的菌液濃度為 5×105CFUs/ml。每組重復(fù)三次。將試管架置于生化培養(yǎng)箱中 37℃靜置培養(yǎng)12～24 h 后觀察，記錄結(jié)果。以沒有肉眼可見的細(xì)菌生長的最低藥物濃度為評判標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 最小殺菌濃度（MBC）的測定取高壓滅菌后的試管置于超凈工作臺中，7 支試管為一行。每行第一支試管中加入濃度為16 MIC 改構(gòu)乳酸鏈球菌素，充分混勻后，依次2 倍稀釋至第五支試管。余下的試管一支為只加菌液的陰性對照，另一支為只有培養(yǎng)基的空白對照。加入5 μL 稀釋后的菌液，使得每支試管的菌液濃度為 5×105CFUs/ml。每組重復(fù)三次。將試管架置于生化培養(yǎng)箱中 37℃靜置培養(yǎng)12～24 h 后，分別用直徑4 mm 的接種環(huán)取一環(huán)樣液劃線接種于各自適宜的固體培養(yǎng)基上，于37℃孵育48 小時(shí)。觀察有無細(xì)菌生長，以無菌生長的最低濃度作為最小殺菌濃度。。

4 試驗(yàn)結(jié)果

4.1 改構(gòu)乳酸鏈球菌素對奶牛乳房炎主要致病菌的最小抑菌濃度（MIC）本實(shí)驗(yàn)采用試管二倍稀釋法考察了改構(gòu)乳酸鏈球菌素對引起奶牛乳房炎的三大主要病原菌的抗菌活性。結(jié)果，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對所測的6 株金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，其MIC 值在0.02～0.06 μg/mL 范圍之內(nèi)。試驗(yàn)結(jié)果說明，即使金葡菌對其他抗生素具有不同的敏感性，但是對耐藥金葡菌（ATCC 1717）及不耐藥金葡菌（ATCC 29213）對改構(gòu)乳酸鏈球菌素的敏感性并未受此影響。并且，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對臨床分離金葡菌的抑菌作用，與其對標(biāo)準(zhǔn)（耐藥和不耐藥）菌株的抑菌作用基本上在同一水平，均具有較強(qiáng)的抑菌性。本研究中改構(gòu)乳酸鏈球菌素對6 株鏈球菌的抑菌作用與其對金葡菌的抑菌作用水平相似，MIC 值范圍為0.04～0.06 μg/mL；改構(gòu)乳酸鏈球菌素對本研究所測的6 株大腸桿菌的MIC 值范圍為0.062～0.115 μg/mL。

4.2 改構(gòu)乳酸鏈球菌素對奶牛乳房炎主要致病菌最小殺菌濃度（MBC）根據(jù)最小抑菌濃度，調(diào)整改構(gòu)乳酸鏈球菌素受試濃度。結(jié)果表明，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對金黃色葡萄球菌、鏈球菌及大腸桿菌所試菌株的MBC 基本在MIC～4MIC之間。三種菌株的MBC 依次分別為0.04～0.16 μg/mL、0.09～0.15 μg/mL 及0.15～0.32 μg/mL。若依據(jù)細(xì)菌對所試藥物產(chǎn)生了耐藥性的MBC 標(biāo)準(zhǔn)為MBC≥32 MIC，則本試驗(yàn)中18 株試驗(yàn)菌株對改構(gòu)乳酸鏈球菌素均未產(chǎn)生耐藥性。

5 結(jié)論

分析藥敏試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，改構(gòu)乳酸鏈球菌素對于金葡菌、鏈球菌和大腸桿菌的抑菌及殺菌作用較強(qiáng)。這一結(jié)果提示改構(gòu)乳酸鏈球菌素是一種潛在的可開發(fā)為抗奶牛乳房炎感染的新藥物。