祝再然, 張明, 趙桂金, 董嘉良

天津市寧河區(qū)醫(yī)院 1內(nèi)分泌科, 2檢驗(yàn)科(天津 301500)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病患者的常見并發(fā)癥，約有40%的糖尿病患者均伴有不同程度的慢性腎臟疾病[1]，這類患者如果不能得到及時(shí)的診斷和治療，有可能導(dǎo)致腎臟功能衰竭，甚至死亡。目前DN尚無根治之法，臨床主要是控制血糖，延緩腎病進(jìn)程為主。鈉-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(sodium-dependent glucose transporters，SGLT) 2 抑制劑是一類新型的口服降糖藥，SGLT2 抑制劑除了能降血糖以外，還具有腎臟保護(hù)作用。達(dá)格列凈是一種SGLT2 抑制劑，于2017 年3 月在中國獲批上市[2]，但國內(nèi)上市的時(shí)間較短，臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)有限。DN的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，足細(xì)胞附著于腎小球基底，是腎小球血液濾過的重要組成部分，近年來研究[3]發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷是DN的病理基礎(chǔ)之一，被認(rèn)為是引起尿蛋白的關(guān)鍵原因。磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3 kinese/protein kinase B, PI3K/Akt)信號(hào)通路是參與體內(nèi)細(xì)胞分化、增殖和凋亡的主要通路?；A(chǔ)研究[4]表明高糖環(huán)境會(huì)通過PI3K/Akt通路引發(fā)足細(xì)胞損傷。第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白基因(phosphase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)是PI3K /Akt的上游調(diào)控基因，能通過磷酸化/去磷酸化調(diào)節(jié)該通路活性[5]。2018年1月至2019年8月，本研究旨在通過研究SGLT2 抑制劑對(duì)DN大鼠足細(xì)胞損傷的影響以及PTEN/PI3K/Akt通路的影響，來探討其保護(hù)腎臟功能的機(jī)制，以期為臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(200±20)g，動(dòng)物購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK(湘)2010-000。實(shí)驗(yàn)前在12 h日夜交替、(24±2)℃，相對(duì)濕度60%環(huán)境下適應(yīng)性培養(yǎng)1周。鏈尿佐菌素(STZ，Sigma公司)，p-PI3K多克隆抗體、兔抗鼠P-Akt(ser-473)多克隆抗體、兔抗鼠PTEN多克隆抗體試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)，Western blot一抗/二抗稀釋液購自上海哈靈生物科技有限公司?；圻_(dá)HD-310A/HD-310B生物組織包埋機(jī)，KD-202-VI冷凍切片機(jī)，邁瑞全自動(dòng)生化分析儀(BS180)，上海彼愛姆 BM-57XCS光學(xué)顯微鏡，及日立透射電子顯微鏡(H-7650)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DN模型建立[6]和給藥 SD大鼠適應(yīng)性培養(yǎng)1周后進(jìn)行造模，36只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(12只)、模型組(12只)和實(shí)驗(yàn)組(12只)，其中模型組和實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行DN造模：通過尾靜脈以60 mg/kg的劑量一次性注射1% STZ溶液(使用pH=4.2檸檬酸緩沖液溶解)，對(duì)照組注射等量生理鹽水；72 h后使用尾部靜脈針取血檢測空腹血糖，以血糖濃度>16.7 mmol/L為造模成功。本次造模全部成功。實(shí)驗(yàn)組每天早晨9點(diǎn)進(jìn)行1 mg/(kg·d)達(dá)格列凈灌胃，對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水，連續(xù)灌胃8周。試驗(yàn)期間所有大鼠進(jìn)行正常飲食和自由飲水，試驗(yàn)期間每2周進(jìn)行1次空腹血糖監(jiān)測，剔除空腹血糖<16.7 mmol/L的樣本，本研究試驗(yàn)期間未發(fā)生剔除樣本。

1.2.2 生化指標(biāo)檢測 第8周給藥結(jié)束后禁食12 h，期間自由飲水；采用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液，測定24 h尿蛋白排泄率，并測量空腹血糖；使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，收集腹部主動(dòng)脈血液，并分離雙側(cè)腎臟，腎臟在生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱重，計(jì)算腎臟指數(shù)，腎臟指數(shù)=雙側(cè)腎臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。腎臟組織稱重后-80℃冷凍備用。主動(dòng)脈血液3 500 r/min離心10 min取上清液，采用全自動(dòng)生化檢測儀檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)。

1.2.3 腎組織病理學(xué)檢測 取腎臟組織酒精梯度脫水石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色：組織切片脫蠟脫水后加入蘇木精染色1～2 min，水洗10 s后，加入1%鹽酸乙醇，3 s后水洗，加入促藍(lán)液返藍(lán)10 s，流水沖洗2 s，加入1%伊紅1～2 min，流水沖洗2 s，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封固，光學(xué)顯微鏡鏡檢。

1.2.4 足細(xì)胞觀察 取腎組織標(biāo)本，切成1 mm×1 mm×1 mm小塊，立即使用3.75%戊二醛固定4 h，PBS緩沖液沖洗，乙醇梯度脫水，包埋后切片機(jī)切片(80～90 mm厚度)，枸櫞酸鉛電子染色，采用透射電鏡鏡檢。

1.2.5 PTEN、p-PI3K、Akt蛋白表達(dá) 采用Western blot蛋白印跡法測定腎臟組織中PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)，取50 mg 1.2.2中腎臟組織使用勻漿研磨在液氮中研磨打碎，加入1 mL細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，冰上操作提取總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度，上樣量20 μg，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，加入0.5%脫脂奶粉封閉2 h，加入1∶1 000稀釋的一抗(兔抗鼠PTEN多克隆抗體、兔抗鼠p-P13K多克隆抗體、兔抗鼠p-Akt多克隆抗體、β-actin)，過夜，洗膜，加入1∶1 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，采用電化學(xué)發(fā)光發(fā)進(jìn)行顯影，采用Image Lab軟件分析蛋白條件的灰度值，蛋白相對(duì)表達(dá)量用目的蛋白的灰度值與β-actin的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生化指標(biāo)結(jié)果 建模成功后給藥前，模型組和實(shí)驗(yàn)組空腹血糖差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，給藥8周后模型組空腹血糖顯著高于實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。給藥8周后，血清Scr、血清BUN、腎臟指數(shù)、24 h尿蛋白排泄率均為：模型組>實(shí)驗(yàn)組>對(duì)照組，組間兩兩比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠行生化指標(biāo)結(jié)果比較

2.2 腎臟組織和足細(xì)胞檢測和結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下腎臟組織HE染色結(jié)果可見：對(duì)照組大鼠腎小球形狀完整，結(jié)構(gòu)清晰，未發(fā)生基質(zhì)增生，基底膜增厚，未見纖維組織；模型組大鼠和實(shí)驗(yàn)組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)可見不同程度基質(zhì)增生增厚，基底膜增厚，系膜擴(kuò)張，其中實(shí)驗(yàn)組大鼠與模型組比較腎臟組織可見改善。見圖1。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：實(shí)驗(yàn)組

電子顯微鏡下足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)可見：對(duì)照組毛細(xì)血管基底膜形態(tài)正常，未發(fā)生基底膜增生，足細(xì)胞形狀規(guī)則，排列整齊；模型組可見基底膜增厚，內(nèi)部出現(xiàn)沉積物，足細(xì)胞發(fā)生足突融合，排列混亂，裂空減少，線粒體數(shù)量減少、嵴斷裂，伴有空泡變性；實(shí)驗(yàn)組基底膜也發(fā)生增厚，但程度輕于模型組，足細(xì)胞可見部分足突融合，排列較模型組整齊，整體情況與模型組比較可見改善。見圖2。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：實(shí)驗(yàn)組

2.3 p-P13K、p-Akt、PTEN表達(dá)情況 Western blot結(jié)果表明p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)：模型組>實(shí)驗(yàn)組>對(duì)照組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)：模型組<實(shí)驗(yàn)組<對(duì)照組，組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖3。

表2 3組大鼠p-PI3K、p-Akt、PTEN蛋白相對(duì)表達(dá)比較

圖3 3組大鼠腎臟組織p-P13K、p-Akt、PTEN 蛋白Western blot檢測結(jié)果

3 討論

DN是2型糖尿病常見并發(fā)癥，是引起腎功能衰竭的重要原因，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的原因之一。其臨床病理改變?yōu)槟I小球基底膜增厚、系膜增生，臨床癥狀主要為腎功能衰退和出現(xiàn)尿蛋白[7]。DN發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前存在血流動(dòng)力學(xué)異常、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、糖代謝紊亂等多種相關(guān)假說，但單一假說尚無法完全闡釋DN的發(fā)病過程。近年來隨著研究深入，足細(xì)胞和PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制在DN的發(fā)病和發(fā)展中受到越來越廣泛的認(rèn)可，被認(rèn)為與血糖的穩(wěn)定型和尿蛋白形成密切相關(guān)。SGLT2抑制劑是一種新型降糖藥，被美國食品藥品監(jiān)督管理局和歐洲藥物管理局推薦為一線降糖藥物的替換選擇，并有研究發(fā)現(xiàn)其有獨(dú)立于降糖作用的腎臟保護(hù)作用[8]。

達(dá)格列凈是一種代表性SGLT2 抑制劑，于2017 年3 月在中國獲批上市，該藥在國內(nèi)上市的時(shí)間較短，臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)有限。因此本研究通過建立DN模型，來研究達(dá)格列凈的降糖作用和腎臟保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組大鼠的空腹血糖、血清Scr、血清BUN、腎臟指數(shù)、24 h尿蛋白排泄率均顯著低于模型組，但仍然顯著高于對(duì)照組，生化指標(biāo)結(jié)果說明在一定程度上達(dá)格列凈可以降低血糖，減輕尿蛋白。為了探究達(dá)格列凈對(duì)腎臟功能的保護(hù)作用，本研究進(jìn)一步對(duì)腎臟組織和足細(xì)胞的功能形態(tài)進(jìn)行了鏡檢，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡下可見實(shí)驗(yàn)組基質(zhì)增生增厚、基底膜增厚、系膜擴(kuò)張程度輕于模型組，電子顯微鏡下可見底膜增厚、足細(xì)胞足突融合以及足細(xì)胞排列狀態(tài)相對(duì)于模型組有明顯改善，說明達(dá)格列凈的干預(yù)對(duì)腎臟病理損傷和足細(xì)胞損傷有改善作用。足細(xì)胞是一種無增生能力的高度分化細(xì)胞，足細(xì)胞損傷的表現(xiàn)為足突發(fā)生融合甚至消失、排列紊亂、體積變小，最終從腎小球上脫落進(jìn)入尿液，足細(xì)胞發(fā)生損傷脫落后，濾過膜的完整性遭到破壞，濾過作用下降，形成尿蛋白[9]。一項(xiàng)Meta分析[10]表明SGLT2抑制劑能顯著改善血糖和中度腎功能損害。分析認(rèn)為持續(xù)高血糖是引起足細(xì)胞損傷的原因之一，一方面達(dá)格列凈的降血糖作用可以減輕高血糖對(duì)腎臟足細(xì)胞的損傷；另一方面達(dá)格列凈可以特異性地抑制腎小管SGLT2的表達(dá)，增加對(duì)鈉離子的重吸收，增加腎臟血流量，減輕腎小球內(nèi)壓，改善DN早期的腎小球高濾過狀態(tài)，有利于保護(hù)濾過膜的完整性[11]。

PI3K/Akt 信號(hào)通路通過磷酸化作用被激活生成p-PI3K/p-Akt，其表達(dá)與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，PTEN是PI3K/Akt 信號(hào)通路活化的上游抑制因子，Lin等[12]報(bào)道PTEN的丟失會(huì)加重足細(xì)胞損傷。因此基于前期的生化指標(biāo)和足細(xì)胞鏡檢結(jié)果，本研究進(jìn)一步檢測了上述蛋白在達(dá)格列凈干預(yù)的DN模型大鼠腎臟中的表達(dá)。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組p-PI3K、p-Akt蛋白低于模型組并高于對(duì)照組，PTEN蛋白表達(dá)高于模型組并低于對(duì)照組。李翠凡等[13]研究發(fā)現(xiàn)DN患者存在p-PI3K與p-AKT過度激活現(xiàn)象，PTEN蛋白是一種具有特異磷酸酯酶活性的酶，可以通過脫磷酸作用抑制PI3K活化，即PTEN蛋白的表達(dá)可以抑制p-PI3K/p-Akt的活性[14]。同時(shí)有研究[15]報(bào)道，激活后的PI3K/Akt信號(hào)通路會(huì)介導(dǎo)足細(xì)胞損傷，引起蛋白尿。陳玲等[16]發(fā)現(xiàn)達(dá)格列凈能調(diào)節(jié)DN大鼠的尿濃縮功能，并且能影響腎組織與重吸收相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的累積會(huì)激活PI3K與AKT，達(dá)格列凈可能是通過控制血糖降低PI3K/Akt的激活，也可能是通過獨(dú)立的腎臟保護(hù)作用上調(diào)PTEN蛋白表達(dá)，抑制PI3K/Akt 的磷酸化作用來調(diào)節(jié)下游蛋白表達(dá)改善足細(xì)胞損傷、保護(hù)腎臟功能的機(jī)制[17]。

本研究雖然通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察到SGLT2抑制劑對(duì)DN大鼠的腎臟組織和足細(xì)胞損傷具有一定的改善作用，且發(fā)現(xiàn)SGLT2抑制劑干預(yù)后PI3K/Akt的活化以及下游PTEN蛋白的表達(dá)發(fā)生變化，但是對(duì)于其影響PI3K/Akt/PTEN的具體機(jī)制尚不得知，這也將是我們未來的研究方向。綜上所述，達(dá)格列凈能降低DN大鼠的血糖水平，減少尿蛋白，改善腎功能和足細(xì)胞損傷，可能與其上調(diào)PTEN蛋白，下調(diào)p-PI3K/p-Akt表達(dá)有關(guān)。