楚福英, 李元敬, 王雨亭, 施樹良, 張彥龍, 雷 虹,*, 李文輝,*

(1. 黑龍江大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 哈爾濱 150080; 2. 黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心, 哈爾濱 150500; 3. 華南師范大學(xué)汕尾校區(qū) 海洋與環(huán)境工程學(xué)院, 廣東 汕尾 516600; 4. 哈爾濱工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，哈爾濱 150001)

0 引 言

動 物 胃腸道系統(tǒng)中有大量微生物在此定殖，例如擬桿菌門(Bacteroidetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Phylum Firmicutes)等，其中定殖在胃腸道中更加豐富的菌群是Verrucomicrobia。因?yàn)閯游镂改c道內(nèi)會形成一種黏液層，其組成成分主要是黏蛋白。腸道菌群中屬于 Verrucomicrobia，阿克曼氏菌屬(Akkermansia)的嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansiamuciniphila)能夠特異性的降解黏蛋白[1]，還能以黏蛋白為唯一碳源和氮源，產(chǎn)生短鏈脂肪酸來為宿主提供能量[1-2]。2004年由Derrien利用黏蛋白培養(yǎng)基首次從人體糞便中分離出來，在人類腸道普遍定殖，是人類腸道微生物中最豐富的成員之一，約占總量的3%～5%[3-6]。腸道黏液層至少存在8種不同的Akkermansia在此定殖[1]。

目前已發(fā)現(xiàn)的屬于Akkermansia的細(xì)菌只有2種A.muciniphila和A.glycaniphila，其中A.glycaniphila只在網(wǎng)紋蟒體內(nèi)被檢測到并成功分離，并未在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)[7]。而A.muciniphila在小鼠[2,8]、驢[9]、人類[3,8,10]等動物的糞便中均被檢測到，是Verrucomicrobia中第一個(gè)被成功分離和鑒定的腸道細(xì)菌，并廣泛分布于多種動物的腸道內(nèi)。目前發(fā)現(xiàn)哺乳動物中的Akkermansia均為A.muciniphila[4,11]。近年來，在動物和人類研究中，A.muciniphila的變化顯然與各種疾病(肥胖、早衰、阿爾茲海默癥等)的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且在其中發(fā)揮重要作用[12-13]。有學(xué)者指出A.muciniphila有望成為下一代益生菌[6,13]。本文綜述了A.muciniphila的培養(yǎng)方法及其與肥胖、早衰、阿爾茲海默癥這幾種疾病之間的關(guān)系。

1 A. muciniphila的培養(yǎng)方法

A.muciniphila作為一種嚴(yán)格厭氧的革蘭氏陰性菌，很難在普通培養(yǎng)基中生長繁殖，對起始存在的環(huán)境、培養(yǎng)的條件和操作方法等均要求嚴(yán)格[4]。研究表明，A.muciniphila在分別以黏蛋白、果糖、半乳糖、纖維二糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰葡萄糖胺作為碳源的培養(yǎng)基中生長情況分別為最佳生長、不生長、不生長、不生長、微弱生長、微弱生長、微弱生長[3]。A.muciniphila的培養(yǎng)條件是在溫度20～40 ℃和pH 5.5～8.0之間，其中37 ℃是最佳溫度、6.5是最佳pH值，pH<5.5或>8.0都不生長，并且需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境才能生長(182 kPa、20%CO2、80%N2)。在以寡糖(葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰半乳糖胺)為碳源的培養(yǎng)基上生長緩慢，在黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長狀況最佳，到目前為止黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基是其唯一的選擇性培養(yǎng)基[3-4]。

2004年，Derrien等[3]首次提到了適用于A.muciniphila培養(yǎng)的基礎(chǔ)碳酸氫鹽緩沖培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基中含有：0.4 g KH2PO4；0.53 g Na2HPO4；0.3 g NH4Cl；0.3 g NaCl；0.1 g MgCl2·6H2O；0.11 g CaCl2；1 mL 維生素溶液；1 mL堿性微量元素溶液；1 mL酸性微量元素溶液；0.5 mg刃天青；4 g NaHCO3；0.25 g Na2S·7-9H2O 。在該培養(yǎng)基中還添加了0.7%(v/v)的澄清無菌瘤胃液和0.25%(v/v)的豬胃粘蛋白，稱之為“黏蛋白培養(yǎng)基”。后來的研究發(fā)現(xiàn)瘤胃液和維生素并不是該菌株生長所必需的。MucT菌株也在腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)和哥倫比亞肉湯培養(yǎng)基中生長，但在這些培養(yǎng)基中細(xì)菌的生長密度只是黏蛋白培養(yǎng)基中的1/2[3]。

目前對于A.muciniphila的培養(yǎng)大多依賴于由豬胃黏蛋白和牛腦心浸液干粉配制而成的培養(yǎng)基，雖然培養(yǎng)效果好，但成本較高[14-15]。2016年，Plovier等[16]改造了黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用濃度為25 mmol·L-1混合糖(葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺)、16 g·L-1大豆蛋白胨以及4 g·L-1蘇氨酸來替代黏蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)效果與黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基相似。

近幾年有大量學(xué)者發(fā)明了關(guān)于培養(yǎng)A.muciniphila的培養(yǎng)基。2019年，彭永正等[14]發(fā)明了一種培養(yǎng)A.muciniphila的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基組分包括大豆蛋白胨、葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、蘇氨酸、磷酸氫二鈉和氯化鈉，在厭氧箱中培養(yǎng)3～4 d，得到了純的A.muciniphila。王敏等[17]發(fā)明了一種A.muciniphila的低氧培養(yǎng)方法，這種方法特異性的營造出一種低氧的培養(yǎng)環(huán)境，其中各種混合氣體的體積比是：70%～94%N2、1%～5%O2、5%～25%CO2，培養(yǎng)時(shí)間為24～36 h。該發(fā)明提供了一種全新的、氧氣濃度較高的、更適合A.muciniphila生長的低氧混合氣體。對比傳統(tǒng)的絕對無氧環(huán)境和現(xiàn)有的微氧環(huán)境，該專利的發(fā)明方法使A.muciniphila進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間大為縮短，并且這一低氧環(huán)境，對于不同的培養(yǎng)基，可展現(xiàn)出類似的促進(jìn)作用。2020年，朱永亮等[15]發(fā)明了一種新的培養(yǎng)A.muciniphila的培養(yǎng)基,此培養(yǎng)基的成分包括腦心浸液、豬胃黏蛋白、N-乙酰-D-氨基葡萄糖、蘇氨酸、L-半胱氨酸鹽和維生素。該培養(yǎng)基可使A.muciniphila在含有較低濃度的豬胃黏蛋白和腦心浸液的培養(yǎng)基中仍然能夠獲得充足的營養(yǎng)物質(zhì)，來保證菌株的正常生長。2021年，王敏等[18]又發(fā)明了一種A.muciniphila的厭氧培養(yǎng)方法，所采用的混合氣體比例是85%～94%N2、5%H2、1%～10%CO2，所采用的是改良的BHI培養(yǎng)基，即在其中添加了黏蛋白和酵母膏。該專利中發(fā)明的培養(yǎng)方法使A.muciniphila的生長繁殖不受液面高度的限制，使其能在搖瓶和平板表面生長良好，降低培養(yǎng)難度。同時(shí)該方法使A.muciniphila的培養(yǎng)時(shí)間由傳統(tǒng)的3～4 d縮短為24～36 h，對A.muciniphila的擴(kuò)大培養(yǎng)和深入研究均有重大意義。

培養(yǎng)基中既使不添加黏蛋白，A.muciniphila在其中也能正常生長。且A.muciniphila在這些培養(yǎng)基上的培養(yǎng)效果與黏蛋白基礎(chǔ)培養(yǎng)基能達(dá)到相似效果，甚至培養(yǎng)效果更好、難度更小、時(shí)間更短、成本更低，使體外實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)更易進(jìn)行。目前培養(yǎng)A.muciniphila的方法還在不斷探索，對于A.muciniphila的分離方法及其與各種疾病之間關(guān)系的研究意義重大。

2 A. muciniphila與各種疾病之間的關(guān)系

2.1 A. muciniphila與早衰的關(guān)系

腸道是受衰老過程影響的器官之一，老年人群中腸道疾病的發(fā)生率相當(dāng)高[19]。作為腸道的主要居民，腸道微生物群在維護(hù)健康方面發(fā)揮著重要作用。在衰老過程中，腸道菌群組成發(fā)生重大變化，如有益菌減少，致病菌增加，其中A.muciniphila的顯著降低引起了人們的廣泛關(guān)注[20]。有研究表明，A.muciniphila的分布與年齡有關(guān)，且隨著年齡的增加而降低，與成年人相比，老年人腸道內(nèi)該細(xì)菌的定殖量顯著降低[1,13]。A.muciniphila與動物的早衰也密切相關(guān)，且A.muciniphila在其中起到益生菌的作用，可延長早衰動物的壽命[21]。

Barcena C等[21]發(fā)現(xiàn)腸道菌群失調(diào)在兩種不同的早衰癥小鼠模型中表現(xiàn)尤為明顯，其變化主要包括疣微菌豐度顯著降低。與這些發(fā)現(xiàn)相似的是，腸道菌群失調(diào)是人類早衰癥患者表現(xiàn)出的現(xiàn)象之一，但值得注意的是，長壽的人(百歲老人)卻表現(xiàn)出疣微菌的顯著增加。測試了向LmnaG609G/G609G小鼠提供A.muciniphila是否會延長它們的壽命，并對百歲老人的腸道菌群進(jìn)行宏基因組分析。結(jié)果表明，A.muciniphila對早衰癥狀具有有益作用，會使壽命延長。因口服A.muciniphila可以延長早衰小鼠的壽命，并且有利于腸粘膜層的增厚[22]。接受A.muciniphila的LmnaG609G/G609G小鼠也顯示腸三葉因子Tf3的增加，這能促進(jìn)傷口愈合和粘膜層的修復(fù)[23]。該研究表明了A.muciniphila的給藥會使早衰癥患者壽命延長，從而拓展了以前關(guān)于Akkermansia在哺乳動物和老年小鼠腸道中能促進(jìn)健康的研究結(jié)果[21,24]。

Van der Lugt B等[25]通過給老化的Ercc1/δ7小鼠補(bǔ)充70 d的A.muciniphila，并研究了腸道健康的組織學(xué)和免疫學(xué)方面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)腸黏液層的厚度在補(bǔ)充A.muciniphila后增加了3倍，比補(bǔ)充植物乳桿菌WCFS1的小鼠更厚。結(jié)腸基因表達(dá)譜表明，炎癥和免疫功能相關(guān)基因和途徑的表達(dá)減少，并表明結(jié)腸中B細(xì)胞減少。補(bǔ)充A.muciniphila后，脾和腸系膜淋巴結(jié)中的總B細(xì)胞未變。骨髓中成熟和未成熟的B細(xì)胞增加，而B細(xì)胞前體則不受影響。這些發(fā)現(xiàn)表明A.muciniphila影響了B細(xì)胞的遷移而不是產(chǎn)生?；啬c中的基因表達(dá)譜表明，補(bǔ)充A.muciniphila后，代謝和免疫相關(guān)過程以及抗菌肽的產(chǎn)生減少。此外，A.muciniphila降低了淋巴結(jié)中活化的CD80+CD273-B細(xì)胞的數(shù)量。此外，腹膜常駐巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加，脾和腸系膜淋巴結(jié)中Ly6Cint單核細(xì)胞數(shù)量的降低為A.muciniphila的潛在抗炎特性提供了證據(jù)[25]。

以上這些結(jié)果支持A.muciniphila在老齡人群中的治療應(yīng)用，并為衰老疾病的治療提供了一種新型治療方法。進(jìn)一步的研究可集中在人類應(yīng)用的實(shí)際方面，如劑量、頻率和給藥方式等，盡快提供一種高效且無毒副作用的治療方法。

2.2 A. muciniphila與肥胖的關(guān)系

隨著人們生活水平的提高，肥胖的發(fā)病率也在逐年升高，最近的研究發(fā)現(xiàn)肥胖的發(fā)生與腸道菌群紊亂，炎癥和腸道屏障破壞等癥狀密切相關(guān)。雖然在肥胖期間影響上述癥狀的微生物組成與宿主之間的作用機(jī)制尚不明確，但卻發(fā)現(xiàn)腸道菌群中的A.muciniphila在其中起到重要作用，口服A.muciniphila治療能明顯改善肥胖的癥狀[25]。

目前A.muciniphila的研究也多與肥胖有關(guān)，高脂喂養(yǎng)的小鼠與正常小鼠的A.muciniphila豐度明顯不同[24,26]。Schneeberger M等[24]已經(jīng)證明，腸道細(xì)菌在肥胖過程中發(fā)生了特定變化，在高脂飲食(High-fat diet, HFD)喂養(yǎng)下A.muciniphila的豐度降低。隨著肥胖的加重，A.muciniphila的水平與幾乎所有涉及脂肪酸氧化和脂肪褐變的參數(shù)呈強(qiáng)正相關(guān)。相反，在此過程中還發(fā)現(xiàn)A.muciniphila的水平與炎癥標(biāo)記物、脂質(zhì)合成以及胰島素抵抗、心血管風(fēng)險(xiǎn)和肥胖癥的幾種血漿標(biāo)記物呈負(fù)相關(guān)。隨著小鼠飲食治療時(shí)間的延長，A.muciniphila的豐度逐漸下降，而這種影響在HFD中會加劇。

Everard等[26]證明了A.muciniphila在肥胖中發(fā)揮著重要作用，其豐度在肥胖小鼠中顯著降低，并且觀察到用低聚果糖喂養(yǎng)遺傳性肥胖小鼠可使其體內(nèi)A.muciniphila豐度增加近100倍，這與代謝狀況的改善有關(guān)。除此之外，還證明了口服A.muciniphila治療改善了高脂飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂，包括脂肪組織炎癥、脂肪量增加、代謝性內(nèi)毒素血癥和胰島素抵抗。同時(shí)證明了只有活的A.muciniphila能實(shí)現(xiàn)這些效果，熱殺死的A.muciniphila并不能改善代謝紊亂。

雖然Everard等已經(jīng)表明熱殺死的A.muciniphila消除了有益效果，但最近的研究表明，益生菌在70 ℃巴氏殺菌30 min的情況下，可以部分或完全保留其有益效果[16,26]。Plovier H[16]等評估了在合成培養(yǎng)基上生長并經(jīng)巴氏殺菌滅活的A.muciniphila的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過巴氏殺菌的A.muciniphila獨(dú)立于食物攝入并發(fā)揮了比活菌更強(qiáng)的作用，用巴氏殺菌的A.muciniphila處理的HFD小鼠顯示出與用對照飲食(control diet, ND)喂養(yǎng)的小鼠相似的體重和脂肪量增加。在兩組實(shí)驗(yàn)中，與HFD組相比，處理的HFD小鼠表現(xiàn)出更低的葡萄糖不耐受和胰島素濃度，這導(dǎo)致處理小鼠的胰島素抵抗指數(shù)較低。處理的HFD小鼠與ND小鼠相比其回腸中的杯狀細(xì)胞密度更大，這表明處理的HFD小鼠產(chǎn)生了更多的黏液。此外，當(dāng)將處理的HFD小鼠與未經(jīng)處理的HFD小鼠進(jìn)行比較時(shí)，其平均脂肪細(xì)胞直徑標(biāo)準(zhǔn)化，血漿瘦素顯著降低。在用活A(yù).muciniphila處理的小鼠中未觀察到這些現(xiàn)象。與其他組相比，處理組的HFD小鼠糞便熱量含量更高，表明其能量吸收更低，這有助于該組中小鼠體重和脂肪量降低。 另有研究表明，通過用454焦磷酸測序法分析16S rRNA基因序列可用來評估二甲雙胍對腸道微菌群組成的影響。結(jié)果表明用二甲雙胍處理的HFD喂養(yǎng)的小鼠顯示出比HFD喂養(yǎng)的對照組小鼠更高的黏蛋白降解細(xì)菌A.muciniphila的豐度，且肥胖癥狀得到明顯改善，說明二甲雙胍治療可以顯著增加了A.muciniphila的數(shù)量來改善肥胖[27]。

以上研究表明，不管是活的還是經(jīng)巴氏殺菌過的A.muciniphila均在治療肥胖上發(fā)揮重要作用，且經(jīng)過外物(二甲雙胍等)的干預(yù)可以輔助治療，加強(qiáng)治療效果。雖然A.muciniphila在肥胖的治療過程的具體機(jī)制尚不清楚，但這些成果均為預(yù)防或治療肥胖及其相關(guān)疾病提供了重要的理論依據(jù)，為肥胖的治療提供一條新的途徑。

2.3 A. muciniphila與阿爾茲海默癥(AD)的關(guān)系

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以廣泛性癡呆為特征的疾病，如記憶障礙、視覺功能喪失、行為改變等[28]。目前全球?qū)D的治療只能緩解其癥狀，還未有有效的方法來緩解疾病的進(jìn)展[29-30]。早期診斷是最有效的治療方法。2010年，阿爾茨海默病國際報(bào)告稱，全球的癡呆癥治療和護(hù)理費(fèi)用已經(jīng)超過8 180億美元。且有專家推測，2050年[31]，AD患者的數(shù)量可能會達(dá)到3 000萬，其中近71%的患者主要集中在發(fā)展中國家，包括南亞、中國、印度和西太平洋地區(qū)。

淀粉樣蛋白β(β amyloid, Aβ)是Aβ前體蛋白(β amyloid precursor protein, APP)通過β-和γ-分泌酶的蛋白水解產(chǎn)生的肽。Aβ40和Aβ42的毒性均很強(qiáng)，容易聚集在一起并引發(fā)神經(jīng)毒性效應(yīng)，被廣泛認(rèn)為是AD的關(guān)鍵生物標(biāo)志物，診斷AD的基本神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)是細(xì)胞外Aβ的沉積和細(xì)胞內(nèi)過度磷酸化蛋白沉積，與多種病理特征有關(guān)[32-33]。代謝綜合征，包括肥胖和胰島素抵抗等，也是影響AD的關(guān)鍵高危因素[34-37]。前面已經(jīng)提到A.muciniphila對肥胖和胰島素抵抗等都具有改善作用。且有研究表明，AD患者和正常人之間的腸道微生物組成存在重大差異，其中A.muciniphila在AD小鼠腸道中豐度明顯降低[32,34]。因此，通過飲食、益生菌或糞菌移植可能是AD的潛在治療方法[35]。

Ou Z等[32]用正常飲食和HFD喂養(yǎng)APP/PS1小鼠，每天灌胃A.muciniphila，連續(xù)6個(gè)月，研究了A.muciniphila對AD小鼠模型糖代謝、腸屏障和脂代謝的影響，分析了腦病理學(xué)和神經(jīng)行為學(xué)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)A.muciniphila能有效改善AD模型小鼠的糖耐量、腸屏障功能障礙和血脂異常，延緩AD模型小鼠腦內(nèi)病變，減輕空間學(xué)習(xí)記憶障礙。歐子豪等[34]的研究表明A.muciniphila給藥能顯著降低AD模型小鼠體內(nèi)的血清二胺氧化酶和空腹血糖水平，緩解結(jié)腸粘液細(xì)胞數(shù)量降低的癥狀。但在治療過程中也發(fā)現(xiàn)A.muciniphila并未緩解AD模型小鼠體重的增加，但卻能使血脂水平降低，還可改善肩部棕色脂肪白色化和肝脂肪變性，降低海馬中Aβ蛋白的沉積和大腦皮層的Aβ40-42水平，AD模型小鼠Y型迷宮的學(xué)習(xí)時(shí)間減少且準(zhǔn)確率提高，有效緩解其自身認(rèn)知能力所造成的損害。

綜上所述，雖然目前對于A.muciniphila與AD之間的關(guān)系鮮有報(bào)道且其作用機(jī)制尚不清楚，上述研究均證明了A.muciniphila能夠顯著改善AD的癥狀，為AD的防治提供了一種新的治療策略。A.muciniphila還在炎癥性腸病[11,36-37]、Ⅱ型糖尿病[26,38]、酒精性脂肪肝[5,39]、宿主免疫反應(yīng)[27,40]、帕金森[41-42]等患者的治療方面發(fā)揮重要作用。且王淼[43]的研究表明缺鐵性貧血小鼠與正常小鼠相比，其體內(nèi)A.muciniphila豐度顯著降低，表明A.muciniphila可能在缺鐵性貧血的治療方面發(fā)揮作用。然而其對各種疾病影響的具體機(jī)制尚不清楚。

3 結(jié)論與展望

A.muciniphila作為腸道菌群中一種潛在益生菌，培養(yǎng)難度較大，隨著研究的深入，其培養(yǎng)方法也逐漸優(yōu)化，不僅在厭氧環(huán)境中的培養(yǎng)技術(shù)越來越成熟，還掌握了在低氧環(huán)境中的培養(yǎng)方法，使培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)難度大大降低，與之相關(guān)的研究內(nèi)容和方向也越來越多。目前的研究主要集中在各種疾病(衰老、肥胖、阿爾茲海默癥等)的治療方面，發(fā)現(xiàn)A.muciniphila能夠顯著改善這些疾病的癥狀，將為這些疾病的治療提供一條新思路。全面了解A.muciniphila在相關(guān)疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的變化規(guī)律，進(jìn)而闡明其發(fā)揮作用的具體機(jī)制尤為重要。通過口服或糞菌移植等方法探究A.muciniphila治療上述各種疾病的具體機(jī)制，早日為各種疾病的治療提供一條無毒副作用的新途徑。