楊 翰，李愛芳，張永峰，黨麗云，任 斐，楊元利

(西安市胸科醫(yī)院，陜西 西安 710100)

2020年WHO全球結(jié)核病報告中指出[1]，在世界范圍內(nèi)，結(jié)核病仍然是導(dǎo)致高發(fā)病率和病死率的最重要的傳染病之一。2019年，全球估計1000萬人罹患結(jié)核病。人類免疫缺陷病毒(HIV)陰性的人群中有120萬人死于結(jié)核病，HIV陽性人群中有208 000人死于結(jié)核病。肺外結(jié)核的感染中，結(jié)核性腦膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)具有較高的致殘率和病死率[2]。TBM是最嚴(yán)重的結(jié)核病形式，通常需要緊急干預(yù)，由于結(jié)核分枝桿菌可以通過血液快速傳播，臨床表現(xiàn)為顱神經(jīng)損傷、精神狀態(tài)改變、腦梗死、持續(xù)發(fā)燒、卒中，且預(yù)后很差。文獻(xiàn)報道，TBM在成年患者的治療結(jié)果中，死亡風(fēng)險為24.7%(95%CI：18.7～31.9)，幸存者中神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的風(fēng)險為50.9%(95%CI：40.2～61.5)，被診斷為III期或HIV陽性的患者在治療期間死亡的可能性明顯更高(分別為64.8、53.4%)[3]。不幸的是,TBM很難診斷，因?yàn)樗c其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床表現(xiàn)相似。TBM的非病原學(xué)檢測技術(shù)在臨床應(yīng)用中較為廣泛，主要為基于機(jī)體免疫應(yīng)答產(chǎn)生的各類非特異性及特異性細(xì)胞因子、免疫細(xì)胞等。在50%以上的患者中通常很難使用常規(guī)方法在腦脊液(Cerebrospinal fluid,CSF)中出分離結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)[4]。近些年來，TBM診斷技術(shù)不斷更新，以臨床標(biāo)本為檢測對象，以MTB相關(guān)基因?yàn)樵\斷標(biāo)志物，完成對標(biāo)本中是否含 MTB 核酸或耐藥基因檢測的方法，對實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求低于多種傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)診斷方法，因而具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

1 基于實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的分子診斷

實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)技術(shù)通過使用特異性引物擴(kuò)增帶有熒光基團(tuán)的特異性序列IS6110，IS6110只存在于 MTB 復(fù)合群，對于結(jié)核病診斷的靈敏度和特異度較高，可用于鑒別診斷 MTB 與非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculosis mycobacteria，NTM)[5]。通過對MTB的相關(guān)耐藥基因片段擴(kuò)增(利福平ropB，異煙肼AhpC、inhA、KatG，乙胺丁醇embB，鏈霉素rpsL、rrs，氟喹諾酮gyrA，二線注射類藥物eis)，利用熔解曲線及多色半巢式技術(shù)檢測耐藥基因的突變情況，快速獲得與抗結(jié)核藥物耐藥性相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌基因組突變信息，為確定結(jié)核病患者臨床治療決策提供可靠的依據(jù)。

1.1 常規(guī)qPCR技術(shù) 常規(guī)qPCR技術(shù)通過對CSF標(biāo)本中可能存在的MTB進(jìn)行核酸提取，擴(kuò)增特異性序列IS6110，該方法對于TBM的診斷效能較高[6]。有文獻(xiàn)[7]報道，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，qPCR敏感度(91%)要高于培養(yǎng)(63%)、MPB64蛋白(34%)及hsp65Kda(46%)等檢測方法，同時qPCR中核酸的提取方法導(dǎo)致核酸質(zhì)量的差異也是影響其敏感性的重要因素。常規(guī)qPCR技術(shù)具有大通量的優(yōu)勢，檢測時間3～6 h，但其使用對于試驗(yàn)場地具有嚴(yán)苛要求，使得該類方法僅能在具有資質(zhì)的核酸實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，限制了該類方法在基層醫(yī)院的推廣。

1.2 GeneXpert MTB/RIF技術(shù) GeneXpert MTB/RIF(簡稱Xpert)是一種快速、半定量、操作簡便的檢測方法[8]，實(shí)驗(yàn)場地要求不高，整個檢測流程僅需1～2 h，被世界衛(wèi)生組織2010年批準(zhǔn)用為推薦的MTB檢測分子學(xué)方法。Hernandez等[9]對30項(xiàng)研究進(jìn)行Meta分析(包括5項(xiàng)隊(duì)列研究和25項(xiàng)橫斷面研究)，系統(tǒng)回顧Xpert對結(jié)核性腦膜炎的診斷準(zhǔn)確性，對于明確的TBM病例經(jīng)過QUADAS-2 工具分析，Xpert敏感性為85%(95%CI：70%～93%)，特異性為98%(95%CI：97%～99%)，陰性似然比為0.15(95%CI：0.04～0.27)；疑似TBM病例敏感性為81%(95%CI：66%～90%)，特異性為99%(95%CI：97%～99%)。Xpert MTB/RIF Ultra(Xpert Ultra)是Xpert的下一代產(chǎn)品，使用多拷貝IS1081和IS6110片段為MTB目標(biāo)序列。相較于Xpert(112.6 CFU/ml)，Xpert Ultra(15.6 CFU/ml)具有更低的檢測下限[10]。WHO同時在2017年3月推薦使用Xpert Ultra代替Xpert。在肺外結(jié)核檢測應(yīng)用中，Xpert Ultra具有更高的敏感性、特異性。有研究[11]顯示，培養(yǎng)陽性的病例中Xpert Ultra與Xpert的敏感性分別為83.7% (95%CI：68.7～92.7) 和 67.4% (95% CI：51.3～80.5)，特異度分別為92.0%(95% CI：72.5～98.6)和96.0%(95% CI：77.7～99.8)，特異度分別為92.0%(95% CI：72.5～98.6)和96.0%(95% CI：77.7～99.8)，Xpert Ultra具有明顯的優(yōu)勢，對于TBM的診斷[12-13]，相比較于其他傳統(tǒng)方法同樣具有更高的敏感性。GeneXpert平臺用于TBM檢測的優(yōu)勢十分明顯，一次腰椎穿刺獲得標(biāo)本量有限，但需檢測項(xiàng)目較多(常規(guī)、生化、微生物、病理等)。GeneXpert平臺使用1.5 ml標(biāo)本直接上樣檢測，2 h內(nèi)報告結(jié)果，樣本間檢測可單獨(dú)進(jìn)行，高靈敏度、特異度及利福平分子藥敏結(jié)果，試驗(yàn)場地?zé)o特殊要求等，這些技術(shù)特點(diǎn)使得GeneXpert平臺成為目前為止各級別醫(yī)院首選檢測手段。

1.3 恒溫擴(kuò)增技術(shù) 因PCR 技術(shù)需要反復(fù)的熱變性，無法擺脫精良儀器設(shè)備的依賴，從而限制了其在臨床現(xiàn)場檢測中的應(yīng)用，無須熱變性的核酸恒溫擴(kuò)增技術(shù)則克服了這一困難。目前應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌檢測較成熟的恒溫擴(kuò)增技術(shù)包括環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增反應(yīng)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，以RNA為模板的實(shí)時熒光核酸恒溫擴(kuò)增檢測技術(shù)(Simultaneous amplification and testing,SAT)。在TBM診斷中，高漫等[14]、歐維正等[15]、張海晴等[16]研究表明，SAT技術(shù)的敏感性低于Xpert及qPCR技術(shù)，但高于傳統(tǒng)的培養(yǎng)及涂片，這與SAT技術(shù)的RNA靶標(biāo)有關(guān)，與傳統(tǒng)的基于DNA模板的核酸擴(kuò)增技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)為[17-18]：①對儀器的要求低，操作簡便，穩(wěn)定性和結(jié)果準(zhǔn)確性高；②起始靶標(biāo)為環(huán)境中極易降解的RNA，可有效避免污染；③因RNA只在活菌中存在，SAT還可監(jiān)測疾病活動性及藥物療效；④RNA拷貝數(shù)比DNA的拷貝數(shù)高，并且熒光標(biāo)記的RNA探針可同步檢測擴(kuò)增信號，提高檢測敏感性。由于RNA降解快，如果患者的腦脊液含菌量不多，而SAT操作時間控制不當(dāng)，如放在核酸提純儀中超聲處理留置時間過長，也可能會造成SAT對MTB的檢出率下降[19]；另外，若樣本中或容器內(nèi)存在核酸擴(kuò)增抑制劑，檢測出現(xiàn)假陰性的可能性會增加。LAMP技術(shù)使用六個特異性引物用于識別結(jié)核分枝桿菌IS6110基因組序列，包括一個正向外引物、一個反向外引物、兩個相應(yīng)的內(nèi)引物和兩個環(huán)引物，反應(yīng)溫度和時間分別為63 ℃和60 min(反應(yīng)溫度和時間在不同引物組合間存在差異)，使用商業(yè)試劑盒針對結(jié)核分枝桿菌的IS6110區(qū)域進(jìn)行巢式聚合酶鏈反應(yīng)可以在任何實(shí)驗(yàn)室、基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)中進(jìn)行[20]。有研究[21]表明，172例診斷為結(jié)核性腦膜炎病例中抗酸染色(AFB染色)、MGIT 960培養(yǎng)、LAMP和聚合酶鏈反應(yīng)(RTFQ)對結(jié)核分枝桿菌診斷的敏感性分別為2.91% (5/172)、12.79% (22/172)、43.02% (74/172)和34.30% (59/172)。LAMP對TBM的敏感性明顯高于AFB染色和MGIT960培養(yǎng)(χ2=75.11,P<0.001；χ2=43.88,P=0.002)，而LAMP與RTFQ差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.08,P=0.130)。LAMP診斷TBM的特異性為92.86% (26/28)，陽性預(yù)測值為97.37% (74/76)，陰性預(yù)測值為20.97% (26/124)。LAMP和RTFQ診斷結(jié)核性腦膜炎的總體一致性為88.5%，Kappa值為0.870。LAMP與MGIT960培養(yǎng)的一致性為71%，Kappa值為0.730。在所有方法中，LAMP具有較高的敏感性、特異性和陽性預(yù)測值，與MGIT960培養(yǎng)和RTFQ具有高度一致性。多靶點(diǎn)LAMP的應(yīng)用對TBM病例的診斷更具有優(yōu)勢。除了上述兩種臨床常用恒溫檢測技術(shù)外，目前商品化試劑還有結(jié)核分枝桿菌DNA實(shí)時熒光恒溫擴(kuò)增檢測[22]，恒溫擴(kuò)增微流控芯片技術(shù)[23]，交叉引物恒溫擴(kuò)增技術(shù)[24]等。恒溫擴(kuò)增技術(shù)是高擴(kuò)增效率酶發(fā)現(xiàn)帶來的產(chǎn)物，高效率酶配合引物設(shè)計的合理性，使得DNA擴(kuò)增效率要高于PCR技術(shù)，也使得檢測敏感度更高、擴(kuò)增儀器不受限，可在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)篩查中推廣使用。

1.4 高分辨熔解曲線技術(shù) 熒光PCR探針高分辨熔解曲線法 (High resolution melt curve analysis,HRM),一方面可以對抗結(jié)核分枝桿菌一線、二線藥物耐藥基因進(jìn)行熔點(diǎn)變化分析，判定相應(yīng)基因是否發(fā)生突變[25]；另一方面可通過對gyrB基因進(jìn)行熔點(diǎn)變化進(jìn)行分類及鑒別細(xì)菌[26]。國內(nèi)外的研究表明HRM技術(shù)相比較傳統(tǒng)的涂片、培養(yǎng)來說提高了腦脊液病原體檢出的陽性率(1.8%涂片、10.9%培養(yǎng)和83.63%HRM[27])，同樣提高了結(jié)核分枝桿菌的耐藥篩查率。HRM分析是一項(xiàng)對技術(shù)人員水平要求較高的技術(shù)，溶解溫度不同帶來熒光信號曲線變化，專業(yè)技術(shù)人員可以從不同類型的曲線形式獲得更多的信息，如不均一耐藥及所占比例。亦或是在失敗的擴(kuò)增中，如何調(diào)整整個體系構(gòu)建(主要是核酸的純度及濃度的調(diào)整)，從而獲得精確的分子耐藥信息，確定是無法獲得準(zhǔn)確耐藥位點(diǎn)突變類型。

2 基于雜交技術(shù)的分子診斷

利用堿基配對原則，將待檢分子與已知序列分子探針進(jìn)行雜交，通過對雜交產(chǎn)物的檢測，獲得待檢標(biāo)本中存在的核酸分子的信息。其優(yōu)勢在于多靶標(biāo)的分析，隨著載體材料的不斷發(fā)展，靶標(biāo)高度集成，優(yōu)勢也越發(fā)顯著，尤其是突變分子或 SNP 的檢測與分析。主要應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)檢測，以及耐藥基因突變檢測[28]及分枝桿菌菌種鑒定[29]。雜交技術(shù)的優(yōu)勢在于能夠獲得特定位點(diǎn)的突變信息，但這也成為了缺點(diǎn)，除了特定位點(diǎn)外無法獲得更多的信息。

2.1 線性探針法 將生物素標(biāo)記PCR產(chǎn)物變性后與固定在膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過雜交信號而獲得序列信息，酶免疫顯色法顯示結(jié)果，但受膜上探針的限制，不能檢測出所有的突變類型。研究[30]顯示，其對 MTB 檢測的敏感性>95%，特異度為 100%，且可用于快速檢測抗結(jié)核一線藥物(敏感性和特異度方面：RFP為100%，50%，INH為86.11%，47.06%)、氟喹諾酮類(87.5%、94.7%)及二線注射藥物(88.9%、98.9%)耐藥相關(guān)的分子診斷。線性探針法同樣屬于雜交技術(shù)的一種，儀器的特殊需求限制了臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用，但其較高的敏感性、特異度具有一定的價值。

2.2 基因芯片技術(shù) 將樣品DNA或RNA通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增并進(jìn)行熒光標(biāo)記，然后與芯片探針雜交再用掃描儀掃描雜交信號，通過軟件分析得到基因表達(dá)或突變的相關(guān)信息，主要應(yīng)用于耐藥篩查及菌種鑒定。其對利福平、異煙肼、卡那霉素均具有高靈敏度及特異度，但對阿米卡星及卷曲霉素、氟喹諾酮的靈敏度較低[31]，能夠鑒定常見十幾種NTM菌種[32]。在TBM診斷中，基因芯片法具有陽性率高，準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢[33]。以Bactec MGIT 960藥敏結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),Xpert MTB/RIF、熒光PCR熔解曲線和基因芯片技術(shù)檢測利福平耐藥的敏感度分別為88.89%(16/18)、94.44%(17/18)、88.89%(16/18),特異度分別為96.21%(127/132)、96.21%(127/132)、95.45%(126/132)，三種檢測方法的敏感度和特異度比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)[34]。與其他雜交技術(shù)相比較，基因芯片的特點(diǎn)是集成度更高，能夠同時獲得大量的信息。

3 基于基因測序技術(shù)的分子診斷

基因測序可獲得完整和準(zhǔn)確基因序列信息,被認(rèn)為是基因檢測和分子診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)測序原理不同,可分為一代測序、二代測序技術(shù)及三代測序。一代測序技術(shù)的主要特點(diǎn)就是測序讀長可達(dá)1000 bp，準(zhǔn)確性高達(dá)99.999%，但它的通量低，成本高。目前一代測序在驗(yàn)證序列以及驗(yàn)證基因組組裝完整性方面都是金標(biāo)準(zhǔn)。二代測序(Next-generation sequencing，NGS)又被稱為高通量測序,具有測序速度快、敏感性好、分辨率高等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前診斷、腫瘤和遺傳性疾病診斷等領(lǐng)域,在感染性疾病的診斷和藥敏分析領(lǐng)域也表現(xiàn)出良好的應(yīng)用價值[35]。利用NGS技術(shù)，研究者對TB的病原學(xué)篩查、耐藥基因檢測及分枝桿菌菌種鑒定已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究[36]，提高了TB、NTM的診斷效能及治療效果。第三代測序技術(shù)是指單分子測序技術(shù)[37]，DNA測序時，不需要經(jīng)過PCR擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨(dú)測序，三代測序具有更長的測序讀長優(yōu)勢，對于TB等微生物測序而言數(shù)據(jù)更加保真,具有讀取高質(zhì)量基因序列能力[38]。在應(yīng)用于TBM診斷中，4項(xiàng)研究(包含342個CSF樣本)的Meta分析[39]顯示，宏基因組測序(Metagenomic next-generation sequencing，mNGS)敏感性范圍在27%～84%，平均61%，I2值92%，特異性范圍在96%～100%，平均98%，I2值74%，ROC曲線下面積AUG=0.98。mNGS對TBM的診斷敏感性中等，特異性高，ROC曲線下面積表明診斷效果非常好。Xing等[40]一項(xiàng)前瞻性多中心研究表明，mNGS在病毒性腦膜炎中AUC：0.659，95%CI：0.566～0.751，敏感性為42.6%；在結(jié)核性腦膜炎中AUC：0.619，95% CI：0.516～0.721，敏感性為27.3%；在細(xì)菌性腦膜炎中AUC：0.846，95% CI：0.711～0.981，敏感性為73.3%；在隱球菌性腦膜炎和腦曲菌病敏感性分別為76.92%和80%，研究顯示腦脊液mNGS檢測能夠有效識別引起傳染性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病原體。mNGS、抗酸染色、常規(guī) PCR和培養(yǎng)對TBM的診斷敏感性分別為 66.67%、33.33%、25%、8.33%[41]?；蚪M測序相對于其他技術(shù)對TBM的診斷更具有優(yōu)勢，且能夠?qū)Σ煌哪X膜炎疾病進(jìn)行鑒別診斷，高昂的測序成本使其不能夠在臨床中常規(guī)應(yīng)用，但應(yīng)用于疑難病例及危重癥患者是一個不錯的選擇[42]?；蚪M測序的靈敏度較高，再無法保證CSF標(biāo)本絕對清潔的前提下，結(jié)果分析也是需要生信專家及臨床醫(yī)生的綜合分析。

4 基于核酸質(zhì)譜技術(shù)的分子診斷

基于PCR反應(yīng)的電噴霧核酸質(zhì)譜(PCR coupled with electrospray ionization mass spectrometry，PCR-ESI-MS)是一種新技術(shù)，最近被用于從臨床標(biāo)本或培養(yǎng)后6 h后的標(biāo)本中鑒定病原體，可用于評估耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)，以及鑒定分枝桿菌屬。有研究[43]表明，以16S rRNA基因測序?yàn)闃?biāo)準(zhǔn)，在對68株MTBC和97株NTM鑒定中，PCR-ESI-MS準(zhǔn)確的鑒定了所有的MTBC分離株，對瓊脂培養(yǎng)物和MGIT肉湯培養(yǎng)物鑒定到種水平的準(zhǔn)確性分別為97.9%和95.8%。與瓊脂比例法檢測耐藥性相比，PCR-ESI-MS鑒定MTB的敏感性和特異性分別為利福平100%和92.3%，異煙肼100%和93.8%，乙胺丁醇91.6%和94.4%，氟喹諾酮100%和100%。這種新技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確的方法，在MTB的診斷中該方法優(yōu)勢明顯，有限的CSF標(biāo)本中獲得菌種鑒定及耐藥信息是臨床治療中迫切需求的，但其局限性在于勞動力成本過高、對專業(yè)人員的要求以及儀器成本過高，無法應(yīng)用于小型臨床微生物實(shí)驗(yàn)室。

5 基于游離DNA技術(shù)的分子診斷

循環(huán)游離DNA(Circulating cell-free DNA，cfDNA)是指從人體細(xì)胞或分枝桿菌(死亡或分泌等形式)釋放出的DNA，主要存在于各種體液循環(huán)中，如血液、唾液、尿液、痰、腦脊液和組織等。cfMTB-DNA檢測對胸膜結(jié)核的敏感性為50%～79.5%，對結(jié)核性腦膜炎診斷敏感性為56.5%～100%。且cfMTB-DNA 檢測明顯優(yōu)于Xpert試驗(yàn)，Xpert試驗(yàn)顯示靈敏度≤16.7%，特異性為100% (95%CI：89.7%～100%,P<0.001)。cfMTB-DNA qPCR檢測是一種準(zhǔn)確的分子檢測，可以提供結(jié)核分枝桿菌病原學(xué)的直接證據(jù)，并有望提高結(jié)核分枝桿菌的診斷水平[44]。cfDNA在體內(nèi)含量較少，無論qPCR技術(shù)或者測序技術(shù)，只有具有較高的檢測深度，才能提高其在TBM檢測中的診斷價值。

6 挑戰(zhàn)與希望

TBM的臨床表現(xiàn)多樣性，以及腦脊液標(biāo)本菌量少等特征，限制了當(dāng)前診斷方法的效能，因此臨床工作中早期準(zhǔn)確診斷具有挑戰(zhàn)性，雖然濃縮收集腦脊液方法在一定程度上提高了核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)(Nucleic acid amplification test，NAAT)的敏感性，但臨床中大量腦脊液標(biāo)本收集存在一定困難，導(dǎo)致分子診斷敏感性不高，陰性結(jié)果不能排除TBM。Xpert和新一代Xpert Ultra在檢測結(jié)核分枝桿菌及利福平耐藥中得到了全球的認(rèn)可，但越來越多的耐多藥結(jié)核病例出現(xiàn)，單一藥物耐藥性檢測同樣存在不足。高分辨熔解曲線及其他分子雜交技術(shù)應(yīng)用于TBM分子耐藥性檢測也受限于腦脊液標(biāo)本中分枝桿菌量過少，無法提供高質(zhì)量的且足量的核酸，檢測藥物較少?；蚪M測序技術(shù)雖然對中樞系統(tǒng)感染的診斷鑒別具有明顯的優(yōu)勢，但其高昂的測序成本不能夠常規(guī)應(yīng)用到臨床。

以上各類方法的局限性對下一代NAAT提出了新的要求，寄希望于敏感性更高的新技術(shù)的研發(fā)，提高對TBM的早期快速準(zhǔn)確效能，減少誤診和漏診，使得TBM患者能夠得到早期規(guī)范的治療，進(jìn)一步降低致殘率和病死率。