解屹 徐翔 葛明 張萬(wàn)紅 黃坤 江連強(qiáng) 趙世民 王玉潔 彭子忠 廖成 楊金廣 王鳳龍

摘 要：CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)為細(xì)菌和古細(xì)菌免受外來(lái)核酸和噬菌體的侵害提供了保護(hù)。其中2類VI-A型CRISPR-Cas效應(yīng)子Cas13a（之前稱為C2c2），可受CRISPR RNA的引導(dǎo)，靶向切割與原始間隔區(qū)反向互補(bǔ)的單鏈RNA。本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)，多靶標(biāo)編輯煙草花葉病毒（TMV）RdRP、MP和CP基因，以抑制病毒在寄主煙草體內(nèi)的侵染與擴(kuò)散，從而達(dá)到保護(hù)寄主的作用。該系統(tǒng)在瞬時(shí)表達(dá)測(cè)定中表現(xiàn)出對(duì)野生型TMV-U1和表達(dá)綠色熒光蛋白的TMV-30b的干擾以及對(duì)病毒累積和病毒病癥狀的抑制。靶向TMV RdRP基因的CRISPR RNA表現(xiàn)出比靶向MP和CP基因更好的編輯效能。經(jīng)過(guò)適當(dāng)設(shè)計(jì)的CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)被賦予了廣譜抗性，可以特異性編輯多種TMV菌株。研究表明，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)可以用于針對(duì)RNA病毒的抑制干擾。

關(guān)鍵詞：基因編輯;CRISPR-Cas13a;煙草花葉病毒;病毒防控;多靶標(biāo)編輯

Abstract： The CRISPR-Cas adaptive immune system provides protection for bacteria and archaea from foreign nucleic acids and bacteriophages. In the CRISPR-Cas adaptive immune system， two classes of the VI-A CRISPR-Cas effector Cas13a （previously called C2c2） can be guided by CRISPR RNA to target and then cut the single-stranded RNA that is reversely complementary to the protospacers. In this study， the CRISPR-Lsh-Cas13a system was used for the multi-target editing of RdRP， MP， and CP genes of Tobacco mosaic virus （TMV） to protect the host from infection and spread of the virus. This system showed interference with wild-type TMV-U1 and TMV-30b expressing green fluorescent proteins in transient expression assays， as well as suppression of virus accumulation and viral disease symptoms. The CRISPR RNA targeting TMV RdRP gene showed better editing efficiency than that targeting MP and CP genes. The appropriately designed CRISPR-Lsh-Cas13a system was endowed with broad-spectrum resistance and can specifically edit a variety of TMV strains. This study showed that the CRISPR-Cas13a system can be used for the suppression and interference against RNA viruses.

Keywords： gene editing; CRISPR-Cas13a; tobacco mosaic virus; virus prevention and control; multi-target editing

植物RNA病毒種類繁多，其中最具代表性的煙草花葉病毒TMV（Tobacco mosaic virus）富有極強(qiáng)的侵染性、抗逆性和危害性，寄主范圍十分廣泛，可侵染150余屬350余種植物[1]，包括煙草、番茄、馬鈴薯、菠菜等多種作物。一旦發(fā)病會(huì)造成大規(guī)模擴(kuò)散感染，導(dǎo)致作物產(chǎn)量、品質(zhì)嚴(yán)重下降，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。據(jù)報(bào)道，世界各地每年因TMV侵染作物造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)1億美元[3]。TMV可從微傷口處侵染寄主。發(fā)病初期，寄主新葉葉脈及周圍葉肉組織出現(xiàn)半透明明脈癥狀;進(jìn)而病毒持續(xù)復(fù)制增殖，嚴(yán)重干擾寄主自身細(xì)胞分裂，導(dǎo)致葉片厚薄不均、畸形、皺縮，并呈現(xiàn)典型的花葉癥狀，植株也隨之生長(zhǎng)遲緩，呈現(xiàn)矮化、節(jié)間縮短等癥狀，侵染嚴(yán)重的植株逐漸壞死凋亡。TMV基因組為一條線性正義ssRNA，全長(zhǎng)約6395個(gè)核苷酸，病毒質(zhì)粒為大小約300 nm×18 nm的桿狀體，擁有4個(gè)開(kāi)放式閱讀框（ORF）[4]，分別編碼相對(duì)分子質(zhì)量為126、183 kDa的復(fù)制酶，17.5 kDa的外殼蛋白以及30 kDa的運(yùn)動(dòng)蛋白[5]。

針對(duì)TMV的常規(guī)防治措施常存在見(jiàn)效慢、防治效果低、經(jīng)濟(jì)成本高、不具廣譜抗性等弊端，且化學(xué)藥劑的使用極易引起農(nóng)殘超標(biāo)、病毒變異加速等問(wèn)題。因此，亟需開(kāi)發(fā)高效、環(huán)保、具備廣譜抗性的病毒防治技術(shù)以應(yīng)對(duì)這一世界農(nóng)業(yè)難題。近年來(lái)隨著基因編輯技術(shù)的興起與發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)利用基因編輯技術(shù)可以針對(duì)植物病毒基因組特定基因進(jìn)行高效修飾與改造，抑制植物病毒在寄主體內(nèi)的擴(kuò)繁與侵害，從而達(dá)到高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保防控病毒病的目的。隨著對(duì)于各項(xiàng)基因編輯技術(shù)的篩選與淘汰，CRISPR-Cas系統(tǒng)逐漸被人們熟知與接受。

簇狀規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列與相關(guān)聯(lián)的Cas蛋白組成的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng)可在分子水平上為細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗核酸和噬菌體等外來(lái)遺傳因素的侵害，提供自身免疫保護(hù)能力。建立這種適應(yīng)性免疫反應(yīng)需要3個(gè)步驟：1.適應(yīng)，CRISPR陣列會(huì)攝取入侵遺傳因素基因組并整合至自身，形成間隔區(qū);2. CRISPR RNA（crRNA）的加工和生物發(fā)生，在轉(zhuǎn)錄CRISPR陣列后生成的前crRNA可被Cas核酸內(nèi)切酶加工形成成熟的crRNA，成熟crRNA可與Cas蛋白結(jié)合形成“效應(yīng)子”復(fù)合物，組成完整的CRISPR-Cas適應(yīng)性免疫系統(tǒng);3.對(duì)入侵遺傳因素的干擾，入侵者基因組一旦與crRNA間隔區(qū)存在足夠的堿基對(duì)互補(bǔ)性，互補(bǔ)區(qū)域就被視為靶標(biāo)區(qū)域，crRNA牽引Cas蛋白至靶標(biāo)區(qū)域，利用Cas蛋白的核酸酶性質(zhì)，對(duì)目的核酸進(jìn)行裂解，從而完成對(duì)細(xì)菌或古細(xì)菌的免疫保護(hù)工作。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)人為適當(dāng)?shù)卦O(shè)計(jì)crRNA，CRISPR-Cas9系統(tǒng)可以切割病毒基因組的雙鏈DNA，并賦予植物對(duì)該病毒的高效抗性。關(guān)于CRISPR-Cas系統(tǒng)新領(lǐng)域開(kāi)發(fā)方向更多地轉(zhuǎn)向RNA編輯，以期為植物RNA病毒的防治研究提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二類VI型CRISPR-Cas13系統(tǒng)是迄今為止于CRISPR家族中發(fā)現(xiàn)的僅靶向于ssRNA的系統(tǒng)[6]，根據(jù)自身結(jié)構(gòu)差異可分為Type VI-A、Type VI-B、Type VI-C和Type VI-D 4個(gè)亞型，其中以A亞型CRISPR-Cas13a研究居多。

CRISPR-Cas13a系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)、提出至今，已在植物分子抗病蟲害領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但在煙草防控植物病毒方面，關(guān)于該系統(tǒng)定向降解侵染病毒基因組以抑制病毒侵染危害的研究尚且較少。AMAN[7]和SHARMA[8]等分別于2018年和2021年，通過(guò)在本氏煙中表達(dá)CRISPR-Cas13a系統(tǒng)以驗(yàn)證其對(duì)外侵蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的干擾效果。兩項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果均表明，CRISPR-Cas13a系統(tǒng)可以通過(guò)靶向降解病毒基因組，抑制病毒在寄主體內(nèi)的侵染與繁殖，一定程度實(shí)現(xiàn)對(duì)病毒積累的負(fù)調(diào)控作用。本研究基于明確CRISPR-Cas13a系統(tǒng)定向編輯RNA機(jī)制，構(gòu)建了可用于多靶標(biāo)編輯TMV基因組的新型CRISPR-Lsh-Cas13a表達(dá)載體，驗(yàn)證該系統(tǒng)針對(duì)TMV的基因編輯效能與抑制成效，以期為植物RNA病毒的防治提供科學(xué)、可靠的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為本氏煙草（Nicotiana benthamiana）和枯斑三生煙（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）。播種發(fā)芽后移栽至盛有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)土的一次性塑料杯中，培養(yǎng)于晝夜周期為16 h/8 h、相對(duì)濕度60%、光合有效輻射為100 μmol/（m2·s）的人工氣候室中。TMV-U1、TMV 30b毒源由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供，Lsh-Cas13a表達(dá)載體由湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供[9]。

1.2 CRISPR-Cas13a新型表達(dá)載體構(gòu)建

NCBI Genbank搜集38種不同株系TMV RdRP、MP、CP基因，利用DNAMAN軟件篩選各基因保守序列，結(jié)合原始間隔區(qū)核苷酸識(shí)別偏好性原則（sgRNA對(duì)于靶位點(diǎn)3'相鄰的首個(gè)核苷酸表現(xiàn)出對(duì)A，U或C的嚴(yán)格偏好而不是G，靶位點(diǎn)側(cè)翼存在G核苷酸時(shí)會(huì)顯著降低HEPN核酸酶活性，而A，U和C會(huì)導(dǎo)致HEPN核酸酶發(fā)揮最大活性），于篩選的保守序列區(qū)域選取28 nt靶基因序列，將其反向互補(bǔ)得到sgRNA。crRNA DR區(qū)域莖環(huán)結(jié)構(gòu)，選擇9-nt為其環(huán)，序列設(shè)計(jì)為AATATCGAA;5個(gè)Watson-Crick堿基對(duì)為其莖，序列設(shè)計(jì)為ACCCC/GGGGU。莖上的2-nt凸起選擇AC，插于莖的3'核苷酸GU之間;莖環(huán)結(jié)構(gòu)上游5'單鏈區(qū)只設(shè)置一個(gè)胞嘧啶（C），下游設(shè)置5 nt 3'單鏈區(qū)，序列設(shè)計(jì)為AAAAC;在間隔區(qū)3'添加oligo （A） rich tails作為核出口的信號(hào)，以及RNA pol III終止子TTTTTT。綜上，將序列按照莖環(huán)5'側(cè)翼單鏈、莖環(huán)結(jié)構(gòu)、莖環(huán)3'側(cè)翼單鏈、sgRNA的先后順序依次組裝成完整的crRNA，選用U6啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。將3個(gè)“U6+crRNA”序列串聯(lián)，基于Cas13a表達(dá)載體pLsh-Cas13a酶切位點(diǎn)Sac II于串聯(lián)序列兩端添加相應(yīng)“同源臂”序列，送往山東賽恩斯科技有限公司合成。合成序列采用一步克隆法連接至pLsh-Cas13a載體，得到基因編輯重組載體pLsh-Cas13a-TMV。重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α（TransGen Biotech）。挑取單克隆，測(cè)序，陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞 LBA4404（TransGen Biotech）。本試驗(yàn)引物合成及測(cè)序均由派森諾生物科技有限公司完成。陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)所用載體pLsh-Cas13a-PDS（針對(duì)編輯本氏煙PDS基因）構(gòu)建方法同上。本方法所用引物詳見(jiàn)表1。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 本氏煙、枯斑三生煙重組載體瞬時(shí)表達(dá) 挑取農(nóng)桿菌單克隆接種至含有kana、利福平的液體LB培養(yǎng)基，28 ℃ 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h。農(nóng)桿菌菌液1500 g離心5 min，棄去上清。重懸沉淀菌體至OD600=0.8，黑暗靜置3 h。利用無(wú)菌注射器將pLsh-Cas13a-TMV重懸菌液緩慢注入4周齡的本氏煙、枯斑三生煙背面，作為處理組葉片，并設(shè)置4個(gè)技術(shù)重復(fù);將pLsh-Cas13a（質(zhì)粒載體上無(wú)crRNA）重懸菌液緩慢注入本氏煙、枯斑三生煙處理組葉片下方第一片葉片中，作為陰性對(duì)照組葉片，并設(shè)置4個(gè)技術(shù)重復(fù);將pLsh-Cas13a-PDS、pLsh-Cas13a重懸菌液緩慢注入4周齡本氏煙葉片，作為陽(yáng)性對(duì)照組葉片，設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。試驗(yàn)組所有材料均培養(yǎng)于人工氣候室中。

1.3.2 機(jī)械摩擦接毒 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后第3天，取1 g野生型TMV-U1毒源葉片，1 g TMV-30b毒源葉片，置于滅菌的研缽中，加入80 mL PBS緩沖液（pH 6.8）研磨成漿，紗布過(guò)濾除去葉片殘?jiān)@得懸浮液進(jìn)行病毒機(jī)械摩擦接種。利用棉棒將TMV-30b懸浮液輕輕涂抹于撒有石英砂的本氏煙處理組、陰性對(duì)照組葉片正面，將野生型TMV-U1懸浮液輕輕涂抹于撒有石英砂的枯斑三生煙正面，接毒植株置于人工氣候室光照培養(yǎng)。

1.3.3 病毒生物學(xué)測(cè)定 本氏煙試驗(yàn)組機(jī)械摩擦接毒后第5天，紫外（UV）光下統(tǒng)計(jì)處理組、陰性對(duì)照組接毒葉片中綠色熒光蛋白信號(hào)強(qiáng)度（點(diǎn)數(shù)或面積），對(duì)比數(shù)據(jù)估測(cè)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)基因編輯效能。枯斑三生煙機(jī)械摩擦接毒后第3天，統(tǒng)計(jì)處理組、陰性對(duì)照組接毒葉片枯斑數(shù)量，對(duì)比數(shù)據(jù)估測(cè)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)基因編輯效能。

1.3.4 相對(duì)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)分析 采用TRIzol法提取處理組、陰性對(duì)照組葉片總RNA，HiScriptII Q Select RT SuperMix for qPCR（Vazyme）反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。以各樣品cDNA為模板，本氏煙actin為內(nèi)參基因，參照AceQ qPCR SYBR? Green Master Mix（Vazyme）試劑盒說(shuō)明配置反應(yīng)體系，置于Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR system進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán);95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性檢驗(yàn)分析。本方法所用定量檢測(cè)引物詳見(jiàn)表1。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）分析 采集枯斑三生煙處理組、陰性對(duì)照組葉片，液氮速凍后置于液氮預(yù)冷的研缽研磨至粉末。取1 g研磨物裝于液氮預(yù)冷的潔凈離心管中，加入1 mL事先預(yù)冷的蛋白裂解液（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），上下翻轉(zhuǎn)混勻，冰面靜置30 min，低溫離心15 min，吸取上清液至另一液氮預(yù)冷離心管，得到植物總蛋白。通過(guò)SDS-PAGE電泳和100 V濕法轉(zhuǎn)膜90 min，將聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）先置于含5%牛血清蛋白的TBST中封閉1 h，再置于含有TMV抗體和actin抗體緩沖液中，4 ℃孵育過(guò)夜。次日將PVDF膜置于二抗緩沖液中室溫孵育1 h，放入凝膠成像儀載物臺(tái)，加入化學(xué)發(fā)光液，發(fā)光成像。

2 結(jié) 果

2.1 CRISPR-Cas13a表達(dá)載體構(gòu)建與功能驗(yàn)證

2.1.1 靶序列選取、串聯(lián)序列及重組載體獲得 本研究選取TMV基因組序列第941位至968位堿基（28個(gè)）、第5227位至5254位堿基（28個(gè)）、第5991至6018位堿基（28個(gè)）分別作為編輯TMV RdRp、MP、CP的靶序列，選取本氏煙PDS表達(dá)基因序列第356位至383位堿基（28個(gè)）、第557位至第584位堿基（28個(gè)）作為編輯PDS的靶序列。按照設(shè)計(jì)方案完成crRNA組裝與crRNA序列串聯(lián)（圖1 a-c），pLsh-Cas13a-TMV和pLsh-Cas13a-PDS質(zhì)粒圖譜（圖2 a-b）如下。本載體選用可以加強(qiáng)基因表達(dá)的pUBQ 10啟動(dòng)子高效表達(dá)Lsh-Cas13a蛋白，載體抗性基因?yàn)榭敲顾乜剐曰颉?/p>

2.1.2 重組載體構(gòu)建驗(yàn)證與分析 對(duì)兩個(gè)重組載體crRNA進(jìn)行PCR測(cè)序分析。結(jié)果如下圖（圖3 a-e），5個(gè)crRNA堿基測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)一致，峰圖未出現(xiàn)雙峰情況，證明兩段串聯(lián)序列準(zhǔn)確連接至pLsh-Cas13a，pLsh-Cas13a-TMV與pLsh-Cas13a-PDS構(gòu)建成功。對(duì)將pLsh-Cas13a-TMV、pLsh-Cas13a-PDS、pLsh-Cas13a導(dǎo)入的大腸桿菌菌液進(jìn)行菌液PCR測(cè)試，瓊脂糖凝膠電泳條帶（圖3 f）與預(yù)期大小一致，分別為1320、1037和4953 bp，表明3種質(zhì)粒均已成功導(dǎo)入，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.3 重組載體功能驗(yàn)證與分析 本試驗(yàn)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組，選擇本氏煙基因組中PDS表達(dá)基因作為CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)的目的基因進(jìn)行編輯，觀察是否有白化或類白化現(xiàn)象發(fā)生，作為載體功能正常性依據(jù)。陽(yáng)性對(duì)照組葉片瞬時(shí)表達(dá)pLsh-Cas13a-PDS、pLsh-Cas13a后第7天觀察處理葉片的形態(tài)變化，如圖4所示，瞬時(shí)表達(dá)pLsh-Cas13a-PDS的處理葉片不同程度出現(xiàn)類白化現(xiàn)象，而瞬時(shí)表達(dá)pLsh-Cas13a的對(duì)照葉片未出現(xiàn)白化或類白化現(xiàn)象。上述試驗(yàn)結(jié)果證明重組載體功能正常。

2.2 本氏煙、枯斑三生煙試驗(yàn)組病毒生物學(xué)測(cè)定

如圖5 a-b所示，本氏煙處理組樣品接毒葉片中的綠色熒光蛋白信號(hào)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于陰性對(duì)照組樣品接毒葉片。據(jù)統(tǒng)計(jì)，處理組4個(gè)接毒葉片與陰性對(duì)照組4個(gè)接毒葉片的綠色熒光蛋白信號(hào)比值約為1：10.44，差異顯著（p<0.05）。如圖5 c-f所示，枯斑三生煙處理組樣品接毒葉片正、背兩面枯斑數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于陰性對(duì)照組樣品接毒葉片正、背兩面的枯斑數(shù)量。據(jù)統(tǒng)計(jì)，處理組4個(gè)接毒葉片與陰性對(duì)照組4個(gè)接毒葉片的枯斑數(shù)量比值約為1∶11，差異顯著（p<0.05）。

上述結(jié)果表明，在葉片中瞬時(shí)表達(dá)CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)的處理組樣品對(duì)于TMV的抑制效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于僅表達(dá)Lsh-Cas13a蛋白的陰性對(duì)照組樣品，證明CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)能夠起到良好的TMV抑制效率，也說(shuō)明Cas13a蛋白只有依賴于crRNA才能發(fā)揮其核酸內(nèi)切酶活性。

2.3 qRT-PCR病毒基因水平檢測(cè)及分析

為進(jìn)一步證實(shí)CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)可以有效抑制TMV在寄主體內(nèi)的侵染，利用qRT-PCR對(duì)本氏煙、枯斑三生煙兩試驗(yàn)組接毒葉片中的病毒基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如圖6-7所示。本氏煙試驗(yàn)組，相比于陰性對(duì)照組4個(gè)接毒葉片中TMV-30b CP基因的表達(dá)量（陰性對(duì)照值設(shè)為1），處理組4個(gè)接毒葉片中TMV-30b CP相對(duì)表達(dá)量約為0.134 4，差異極顯著（p<0.01），可見(jiàn)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)針對(duì)TMV-30b抑制效率為86.56%。枯斑三生煙試驗(yàn)組，相比于陰性對(duì)照組4個(gè)接毒葉片中TMV-U1 RdRp基因、MP基因和CP基因的表達(dá)量（陰性對(duì)照值均設(shè)為1），處理組4個(gè)接毒葉片中TMV-U1 RdRp、MP和CP基因的相對(duì)表達(dá)量分別約為0.049 6、0.097 1和0.136 2，差異分別為極顯著（p<0.01）、顯著（p<0.05）和顯著（p<0.05），可見(jiàn)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)針對(duì)TMV-U1抑制效率為86.38%。

上述數(shù)據(jù)可明顯體現(xiàn)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)對(duì)于病毒的抑制趨勢(shì)，在葉片中瞬時(shí)表達(dá)CRISPR-Lsh-Cas13a系統(tǒng)的處理組樣品可對(duì)TMV產(chǎn)生高效抑制作用，對(duì)TMV基因組的積累起到了顯著負(fù)調(diào)控作用，從而實(shí)現(xiàn)自身針對(duì)TMV侵染與復(fù)制的抑制，保護(hù)自身免受病毒侵害。

2.4 Western Bolt蛋白水平驗(yàn)證與分析

Western Blot檢測(cè)結(jié)果（圖8）顯示，接毒3 d后，枯斑三生煙處理組葉片與陰性對(duì)照組葉片中均檢測(cè)到TMV，但處理組葉片TMV蛋白含量明顯少于陰性對(duì)照組葉片。此數(shù)據(jù)可輔證2.2、2.3結(jié)果。

3 討 論

自適應(yīng)免疫CRISPR-Cas系統(tǒng)已被用作包括植物在內(nèi)各種系統(tǒng)的強(qiáng)大基因組編程工具[10]。其中，CRISPR-Cas13系統(tǒng)初步應(yīng)用于針對(duì)RNA病毒基因組的編輯工作。CRISPR-Cas13系統(tǒng)可以利用其sgRNA與病毒基因組目的基因具有同源性的特點(diǎn)與其特異性結(jié)合成為雙鏈，crRNA引導(dǎo)具有核酸酶屬性的Cas13蛋白移動(dòng)至目的基因處，進(jìn)行特異性切割、降解，從而達(dá)到針對(duì)病毒基因組進(jìn)行編輯的目的，抑制其對(duì)于寄主的復(fù)制與侵染。與傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)（如ZFNs、TALENs等）相比，CRISPR-Cas13基因編輯技術(shù)操作性更簡(jiǎn)便，對(duì)于目的基因的編輯更為精準(zhǔn)高效，脫靶率低，試驗(yàn)周期短且無(wú)物種限制，因此備受科學(xué)界的關(guān)注與認(rèn)可。

本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)針對(duì)TMV基因組的編輯效能及病毒抑制效果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，CRISPR-Lsh-Cas13a可以介導(dǎo)對(duì)TMV的分子干擾。靶向編輯、降解侵染本氏煙的TMV 30 b（攜帶GFP標(biāo)簽） CP基因可以導(dǎo)致GFP水平降低，從而在受侵葉片中檢測(cè)到GFP信號(hào)減少;靶向編輯、降解侵染枯斑三生煙的野生型TMV不同基因組區(qū)域可以有效減少病毒含量，從而降低形成的枯斑數(shù)量。病毒生物學(xué)測(cè)定試驗(yàn)表明CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)具有編輯、降解和抑制植物寄主植物中TMV的作用。

在基因水平和蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證了該系統(tǒng)對(duì)于TMV的編輯效能及抑制作用。兩試驗(yàn)組中，處理組相較于陰性對(duì)照組，TMV各蛋白基因相對(duì)表達(dá)量均減少86%以上。Western Blot TMV蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，處理組葉片TMV蛋白含量明顯少于陰性對(duì)照組葉片?；蛳鄬?duì)定量及病毒蛋白含量測(cè)定數(shù)據(jù)表明，CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)可以高效編輯TMV基因組不同蛋白表達(dá)基因，有效抑制TMV在寄主中的復(fù)制與傳播，這為工程化創(chuàng)制天然抗TMV轉(zhuǎn)基因植株和抗性發(fā)揮提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

在驗(yàn)證試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，靶向TMV RdRp基因的編輯效能最好，MP基因的編輯效能次之，對(duì)于CP基因的編輯效能相對(duì)最差。這表明，排除其他未被研究發(fā)現(xiàn)的因素外，靶標(biāo)RNA內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)或者RNA結(jié)合蛋白的存在或許會(huì)影響編輯系統(tǒng)的可及性，從而影響Lsh-Cas13a在靶標(biāo)RNA上的活性，降低編輯效能。這一觀察結(jié)果與Abudayyeh等[11]的研究結(jié)果相一致，他們?cè)谔烊画h(huán)境中表征了Lsh-Cas13a的活性，并發(fā)現(xiàn)最有效的crRNA位于強(qiáng)干擾區(qū)域，成簇狀存在，且最靠近靶標(biāo)RNA，這表明crRNA接近靶標(biāo)RNA的難易程度確實(shí)會(huì)對(duì)Lsh-Cas13a的活性產(chǎn)生影響。此外，來(lái)自Cas13a家族的其他Cas13a同系物，例如Lwa-Cas13a，也表現(xiàn)出相同的現(xiàn)象[12]。這些研究表明，RNA靶位點(diǎn)的篩選和crRNA效率的研究探索可能對(duì)于Cas13a活性最大化以及CRISPR-Cas13a系統(tǒng)的編輯效能至關(guān)重要。此外，或存在其他機(jī)制制約CRISPR-Cas13a系統(tǒng)接近靶標(biāo)及其效率發(fā)揮，仍需更多研究揭示這些潛在機(jī)制。目前可以通過(guò)不同方法來(lái)提升CRISPR-Cas13a系統(tǒng)對(duì)于植物病毒基因組的編輯效能，從而實(shí)現(xiàn)更高效的病毒防控力。例如本研究創(chuàng)新的病毒基因組多重靶標(biāo)聯(lián)合編輯方法，在更多區(qū)域內(nèi)對(duì)植物病毒基因組實(shí)施干擾編輯，更大程度上抑制病毒在寄主體內(nèi)的復(fù)制與傳播;再者可以使用某些蛋白質(zhì)穩(wěn)定性融合物（例如msfGFP），其可與Cas13蛋白融合以增強(qiáng)穩(wěn)定性和催化活性;也可以使用具有更強(qiáng)大的RNA引導(dǎo)核糖核酸酶活性的Cas13變體，降低靶標(biāo)可及性帶來(lái)的負(fù)面影響。

4 結(jié) 論

本研究利用CRISPR-Lsh-Cas13a基因編輯系統(tǒng)的作用機(jī)制，構(gòu)建了可在煙草中穩(wěn)定表達(dá)的CRISPR-Lsh-Cas13a功能載體，并于本氏煙和枯斑三生煙中實(shí)現(xiàn)了針對(duì)TMV的高水平抗性。其次利用多靶標(biāo)編輯的概念，強(qiáng)化植物病毒的基因組編輯效能和抑制作用。此結(jié)果為更好地防控植物RNA病毒提供了理論支撐和科學(xué)依據(jù)。

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