秦淑蘭，寧紅紅，朱艷，盛霞，何琪，鄧波，李志紅，黃文濤

1南昌大學第三附屬醫(yī)院，南昌330008；2井岡山大學附屬醫(yī)院；3南方醫(yī)科大學第五附屬醫(yī)院

2型糖尿病患者合并缺血性疾?。ㄈ绻谛牟?、缺血性心肌病等）的發(fā)病率增高，常規(guī)藥物及手術(shù)治療效果欠佳。研究表明，骨髓干細胞可通過歸巢，聚集并融入缺血組織附近，分化發(fā)展成血管內(nèi)皮細胞；其還可以分泌血管生長因子，參與組織損傷修復和血管再生［1-2］。近年來，自體骨髓干細胞移植治療缺血性疾病得到廣泛應(yīng)用，但在糖尿病人群中自體骨髓干細胞移植治療缺血性疾病的療效欠佳。氧化應(yīng)激與糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，糖尿病患者氧化應(yīng)激與抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)之間的平衡受損，導致過氧化應(yīng)激；過氧化應(yīng)激可誘導細胞DNA和膜脂損傷，增加凋亡相關(guān)基因表達，促使細胞凋亡［3］。而骨髓干細胞的增殖和凋亡能力與糖尿病治療效果明顯相關(guān)，因此推測，糖尿病狀態(tài)下的過氧化應(yīng)激可促使骨髓干細胞凋亡，從而導致骨髓干細胞移植治療效果欠佳。N-乙?；腚装彼幔∟AC）是一種含巰基的抗氧化物，是還原性谷胱甘肽的前體，能提高谷胱甘肽（GSH）水平，減少活性氧（ROS）及8-異前列腺素（8-Isoprostane）的生成［4］。NAC廣泛應(yīng)用于心腦血管及呼吸系統(tǒng)疾病的治療，但目前有關(guān)NAC用于糖尿病合并缺血性疾病患者抗氧化應(yīng)激治療方面的研究較少。2017年1月—2020年1月，我們觀察了NAC抗氧化應(yīng)激治療對糖尿病小鼠骨髓干細胞增殖和凋亡的影響，旨在為NAC治療糖尿病合并缺血性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Balb/c雄性小鼠18只，8～10周齡，體質(zhì)量20～22 g，購自南京醫(yī)科大學動物中心。飼養(yǎng)于室溫、濕潤、通風良好環(huán)境，予以普通飼料喂養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與儀器 STZ（美國Sigma），2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（DCFDA）（美國Invitrogen），ELISA檢測試劑盒（美國Cayman Chemical），EdU細胞增殖檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），DAPI染色液（美國Sigma），細胞凋亡檢測試劑盒（美國BD Biosciences）。流式細胞儀（美國Beck?man Coulter），血糖儀（美國強生），MiniMACS Separa?tor磁珠分離器（德國Miltenyi），倒置熒光顯微鏡（日本NIKON）；低溫高速離心機（美國Sigma）。

1.2 模型制備 小鼠腹腔注射STZ 60 mg/kg（以pH4.4的無菌檸檬酸緩沖液稀釋），每天1次，連續(xù)5 d。注射結(jié)束后第3天采集尾部靜脈血，測隨機血糖，>15 mmol/L為糖尿病模型制備成功。

1.3 動物分組與干預 取造模成功的10只小鼠，隨機分成治療組和對照組各5只。治療組給予NAC 200 mg/（kg·d）腹腔注射，對照組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)4周。

1.4 尿液8-Isoprostane水平檢測 收集小鼠尿液，使用ELISA試劑盒檢測8-Isoprostane水平。

1.5 骨髓干細胞的分離 采用頸椎脫臼法處死小鼠。無菌條件下取股骨及脛骨，使用生理鹽水沖洗骨髓腔，收集細胞懸液。使用比重離心液去除紅細胞，通過免疫磁珠分離法獲得CD117+骨髓干細胞。

1.6 骨髓干細胞ROS水平檢測 取新鮮分離的CD117+骨髓干細胞，在37℃下與DCFDA孵育30 min，流式細胞儀檢測ROS水平。

1.7 骨髓干細胞增殖能力觀察 取新鮮分離的骨髓干細胞，按1×104/孔接種于24孔板。待細胞貼壁后，加入EdU檢測試劑盒中的EdU工作液（終濃度為10μmol/L）孵育3 h。PBS清洗，4%多聚甲醛固定，甘氨酸中和，檢測DNA復制期間的EdU。DAPI染核，熒光顯微鏡下計算陽性染色（紅色）細胞數(shù)量，并計算陽性染色細胞占細胞總數(shù)的百分數(shù)，以此代表細胞增殖能力。

1.8 骨髓干細胞凋亡情況觀察 取新鮮分離的骨髓干細胞1×104個，按照凋亡試劑盒說明書加入Annexin V-FITC和PI染色，避光孵育30 min，用熒光顯微鏡觀察染色情況，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用GraphPad Prism5.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用Student'st檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組氧化應(yīng)激指標比較 治療組和對照組尿液8-Isoprostane水 平 分 別 為（2.404±0.823）、（13.160±5.169）ng/mL，治療組低于對照組（P<0.05）；兩組骨髓干細胞ROS水平分別為（173.9±22.3）、（282.0±21.4），治療組低于對照組（P<0.01）。

2.2 兩組骨髓干細胞增殖能力比較 治療組和對照組EdU陽性率分別為8.6%±0.8%、7.2%±0.3%，治療組EdU陽性率高于對照組（P<0.05）。

2.3 兩組骨髓干細胞凋亡率比較 治療組和對照組細胞凋亡率分別為8.4%±0.6%、12.6%±0.7%，治療組細胞凋亡率低于對照組（P<0.05）。

3 討論

骨髓干細胞是一種具有高度自我更新、強分化潛能及多重分化活性的細胞，其細胞標志物包括CD117和CD34［5］。近年來，自體骨髓干細胞移植治療缺血性疾病，比如在缺血性心臟病治療中獲得廣泛應(yīng)用。多項研究顯示，干細胞移植對缺血性心臟病的心臟修復有良好效果［6-8］。但在糖尿病合并缺血性疾病的患者中，自體骨髓干細胞移植治療效果欠佳。GOVAERT等［9］和JIMéNEZ-QUEVEDO等［10］報道，糖尿病合并缺血性心臟病患者給予骨髓干細胞移植后，心臟收縮末期容積無明顯下降，其原因與骨髓干細胞移植后的增殖能力下降和凋亡率升高有關(guān)。PFISTER等［11］研究證實，骨髓干細胞的生存能力降低直接影響糖尿病患者缺血組織的血管新生效果。FISHER等［12］系統(tǒng)回顧分析了有關(guān)骨髓間充質(zhì)干細胞獨立治療不符合血運重建條件的缺血性心臟病患者的相關(guān)文獻，其結(jié)論為骨髓干細胞的凋亡影響糖尿病合并缺血性心臟病患者的心臟射血分數(shù)及心功能的恢復。

在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中，自由基產(chǎn)生增多和抗氧化應(yīng)激能力減弱二者并存，從而易發(fā)生氧化應(yīng)激，其產(chǎn)物ROS在細胞DNA損傷、細胞凋亡等病理過程中發(fā)揮重要作用［13］。NAC是L-半胱氨酸的乙?；问剑鳛榘腚装彼岬膩碓?，NAC能夠增加血液中的GSH水平，是一種清除ROS的有效抗氧化劑。既往研究發(fā)現(xiàn)，NAC具有激活Nrf2/HO-1抗氧化信號通路、抑制NF-κB炎癥激活信號通路以及抑制HA誘導的炎癥基因表達等作用［14-15］。因此推測，NAC可能改善糖尿病患者的氧化應(yīng)激狀態(tài)。

氧化應(yīng)激被定義為ROS產(chǎn)生和消除之間的不平衡，這種不平衡與各種炎癥相關(guān)的疾病有關(guān)。ROS可以氧化脂質(zhì)，脂質(zhì)碎裂產(chǎn)生F2-異前列烷（F2-Isoprostane）。8-Isoprostane是目前研究最廣泛的F2-Isoprostane之一，它是脂質(zhì)過氧化物的標志物，也人類研究中評估氧化應(yīng)激最常用的生物標志物。在人類和動物模型中，NAC已被證實可以改善機體過氧化應(yīng)激、抑制炎癥以及ROS的增加［16］。EBERLEIN等［15］研究顯示，抗氧化劑NAC能抑制炎癥基因的表達，有助于重新平衡過度ROS誘導的炎癥。PALLI等［17］研究結(jié)果顯示，ICU患者經(jīng)NAC治療后，血清8-Isoprostane水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，NAC治療組尿液8-Isoprostane水平較對照組顯著下降，骨髓干細胞中ROS水平也顯著下降。這表明NAC治療對糖尿病小鼠及其骨髓干細胞具有顯著抗氧化應(yīng)激作用。

本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，治療組細胞增殖能力提高，細胞凋亡率降低，表明NAC可減少細胞凋亡，促進細胞增殖。我們認為NAC是通過抑制細胞內(nèi)ROS水平和GSH氧化，進而防止細胞的早期凋亡發(fā)生。其機制可能包括以下幾個方面：①GSH缺失會誘導細胞凋亡，導致ROS積累、線粒體功能障礙和DNA損傷［18-19］；NAC可通過降低ROS水平，同時增加GSH水平，進而減少細胞的凋亡。②抗凋亡蛋白（Bcl-2）家族的Bcl-XL和mcl1的表達受PI3K/AKT通路調(diào)控，ROS可抑制PI3K/AKT通路，促使細胞早期凋亡［20-21］，NAC可通過抑制ROS生成來改善PI3K/Akt信號通路表達，從而抑制細胞凋亡的發(fā)生［22］。③NAC可抑制細胞中參與凋亡過程的Caspase-3和Caspase-9的表達［23］。

綜上所述，NAC可有效改善糖尿病小鼠的氧化應(yīng)激水平，促進骨髓干細胞增殖并減少細胞的早期凋亡。未來我們將進一步探討NAC抗氧化應(yīng)激與細胞凋亡之間的具體分子機制，為糖尿病抗氧化應(yīng)激治療提供更多理論基礎(chǔ)。