王春瓊，張燕，李苓，陳丹，彭麗娟，曾彥波

（1.云南省煙草質量監(jiān)督檢測站，昆明 650106； 2.云南大學生態(tài)與環(huán)境學院，昆明 650504）

蔬菜、水果等農產品在生產過程中不可避免地會遭受多種病蟲害危害，致使產量降低、質量下降，因此在果蔬生長過程中常需要噴灑農藥，以防治病蟲害，但長期不妥當、過量噴灑農藥，甚至違規(guī)使用國家早已禁用的高毒農藥，造成農產品中農藥殘留問題較為突出，嚴重影響農產品的質量安全，危害人體健康［1］。隨著人們環(huán)保意識的提高，國內外逐漸加強對農藥殘留管控，而及時有效地檢測農產品中農藥殘留量，是農藥殘留管控的有效手段［1］。

現(xiàn)行的農藥殘留監(jiān)控方法主要依靠實驗室大型分析儀器，存在檢測成本高、專業(yè)性強、分析周期長、結果反饋滯后等問題［2–6］。農藥殘留快速檢測方法［7–10］以酶抑制等理化方法為主，具有檢測速度快、成本低，適合對批量樣本篩查等優(yōu)點，缺點是該方法依賴于顏色變化，受樣品組織液干擾較大，其檢出限和方法靈敏度的進一步提高受到了局限。隨著檢測監(jiān)管要求的不斷完善，酶抑制等理化方法已不能滿足現(xiàn)場檢測及監(jiān)管的要求。

1977 年Halmann 等［11］提出化學發(fā)光免疫分析技術，經過40 年的發(fā)展，該技術已比較成熟，其原理是在抗原或抗體上標記發(fā)光物質進行免疫反應，通過反應劑激發(fā)發(fā)光物質形成不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)中間體，當激發(fā)態(tài)中間體重回穩(wěn)定基態(tài)時釋放出光子，光信號用自動發(fā)光分析儀識別，進而測定光強度，以推算待測樣品中抗原或抗體含量。該技術［12］將免疫與化學發(fā)光相結合，具有靈敏度高、選擇性好、測定范圍廣、操作簡便、成本低廉、快速、易于實現(xiàn)自動化且無放射性污染等優(yōu)點，近年來在農藥殘留檢測領域發(fā)展較快，被稱為第三代免疫技術。筆者以化學發(fā)光免疫分析為基礎，綜述了其原理、常見的化學發(fā)光劑及化學發(fā)光免疫分析方法，并對化學發(fā)光免疫分析技術在農藥殘留檢測中的應用進行了介紹，最后對該領域的研究前景進行了展望，旨在為今后農藥殘留檢測相關研究提供參考。

1 化學發(fā)光劑

標記用的化學發(fā)光物質應滿足下述條件：①能進行化學發(fā)光反應；②偶聯(lián)抗體或抗原后可轉化為穩(wěn)定試劑；③偶聯(lián)后仍然保留高的反應動力和量子產率；④應不影響或極少影響被標記物的理化性質，尤其是免疫靈敏度。常見的化學發(fā)光劑有以下幾類：

（1）吖啶酯類發(fā)光物質。該類發(fā)光物質是一種具有三環(huán)結構的有機化合物，易氧化，氧化過程無需催化劑。當在堿性環(huán)境中氧化時，分子中共價鍵發(fā)生斷裂，首先形成一個二氧酮中間體，進而產生電激發(fā)的N-甲基吖啶酮，當N-甲基吖啶酮返回到基態(tài)時，于430 nm 處發(fā)射光子。

（2）魯米諾類發(fā)光物質。魯米諾及異魯米諾可在6-氨基進行烷基取代，制得各種衍生物，其中氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾和5-氨丁基乙基-2，3-二氫-1，4-酞嗪二酮用于化學發(fā)光免疫測定已取得較理想的結果。

（3）咪唑類發(fā)光物質。主要以咯吩堿為代表，咯吩堿首先在堿性二甲基亞砜水溶液中反應，生成過氧化物中間體，進而重排，降解，釋放光子信號。

（4）苯酚類發(fā)光物質。主要以鄰苯三酚為代表，屬于強還原劑，在催化劑血紅素的催化下，與H2O2反應釋放光子信號。

（5）芳基草酸酯類發(fā)光物質。該類物質發(fā)光反應過程是在體系中加入特殊熒光染料，形成熒光載體，在經過氧化草酸酯中間體獲取化學能，進而轉變?yōu)榭梢姽猓瑹晒馊玖系募尤霕O大地提高了發(fā)光效率。

2 化學發(fā)光免疫分析方法

2.1 化學發(fā)光免疫分析法

化學發(fā)光免疫分析（CLIA）法是在抗體或抗原上標記化學發(fā)光劑進行特異性免疫反應，通過獲取標記物進行化學發(fā)光反應時的化學發(fā)光強度，推斷被標記抗體或抗原的含量。常用的化學發(fā)光標記物有魯米諾、異魯米諾及其衍生物，如氨丁基乙基異魯米諾、氨己基乙基異魯米諾、鄰苯三酚和吖啶酯類。該類分析方法具有以下優(yōu)點：①準確性和精密度高，均可與放射免疫分析（RIA）法相媲美；②靈敏度高，甚至超越RIA；③檢測時間短；④反應試劑無毒，性質穩(wěn)定；⑤易實現(xiàn)自動化測定；⑥適用性廣。缺點是抗原或抗體被標記過發(fā)光物質后，會改變免疫反應性能，且發(fā)光劑標記率重現(xiàn)性較差。

2.2 熒光化學發(fā)光免疫分析法

熒光化學發(fā)光免疫分析（FIA）法因受待檢樣品基質干擾限制，靈敏度大為降低。引入內源光源作為熒光免疫測定的終點檢測信號，可有效改善外源光源散射產生的背景噪聲，從而大幅度提高信噪比，改善熒光檢測的靈敏度。Malant 等［13］利用雙-(2，4，6-三氯苯基）草酸酯（TCPO)–H2O2作為發(fā)光底物，檢測標記熒光素的標記抗體，檢出限可達10–11mol／L。但因TCPO 水溶性較差，需要選擇適宜的有機溶劑，影響了方法的精密度。該方法目前還未見實際應用的報道，仍停留在研究階段。

2.3 化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法

在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析中，酶的活性一般通過熒光法或催化光度法檢測，近年來人們采用化學發(fā)光反應法檢測酶的活性。從標記免疫測定來看，化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析（CLEIA）法應屬于酶免疫測定范疇，其檢出限低至10–17mol／L，靈敏度優(yōu)于放射免疫分析法。與傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析相比，CLEIA 法通過化學發(fā)光檢測酶活性，而不是通過熒光法或催化光度法測定。此外某些特殊的金屬配合物可催化魯米諾進行化學發(fā)光反應。Muhammad等［4］曾用Co(II)和Fe(II)的配合物代替酶作為抗原（或抗體）的標記物，進行化學發(fā)光免疫分析，獲得了成功。

2.4 電化學發(fā)光免疫分析法

電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種新型檢測方法，既有別于傳統(tǒng)免疫分析法，又不同于普通化學發(fā)光分析法。ECLIA 法將化學發(fā)光法與電化學法巧妙地結合，具有高效、特異、靈敏、準確和適用性廣等特點。與CLIA 法不同，ECLIA 法為電催化化學發(fā)光，是在電極表面發(fā)生的由穩(wěn)定的前體物質轉變形成的具有高反應活性的發(fā)光反應，它是將電化學發(fā)光反應的底物作為電化學發(fā)光免疫測定中的標記物。ECLIA 法的測定模式與酶聯(lián)免疫分析（ELISA）法相似，分兩個步驟進行。以雙抗體夾心法測定抗原為例，首先用三氯聯(lián)吡啶釘［Ru(bpy)2／3+］配合物標記抗體作為反應物，然后在磁性微球上吸附固相抗體及待檢樣品。［Ru(bpy)2／3+］配合物和三丙胺（TPA)兩種電化學活性底物作為其發(fā)光反應的物質基礎。

3 化學發(fā)光免疫分析法在農藥殘留分析中的應用研究進展

化學發(fā)光免疫分析法作為一種兼具高靈敏度和高特異性的免疫分析方法，在農藥殘留檢測領域已得到了良好的應用。

（1）國外研究進展。Hui 等［14］建立了化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，用于檢測農產品中氰基菊酯類農藥殘留，在最優(yōu)條件下，測定結果表明，λ-氰氟菊酯、甲氰菊酯、溴氰菊酯的半抑制率（IC50）值分別為4.3、1.9、3.4 ng／mL，與傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫方法相比較，該方法靈敏度高，檢測時間短。Tudorache等［15］建立了磁性粒子化學發(fā)光酶免疫法，用于檢測樣品中的阿特拉津，方法檢出限為3 pg／L，線性范圍為10～1 000 pg／L，IC50為37 pg／L。Waseem等［16］建立了流動注射化學發(fā)光免疫法，用于檢測天然水中的西草凈，其檢出限為7.5 ng／mL，線性范圍為0.01～2 μg／L，加標回收率為97%～104%。Jin 等［17］建立了化學發(fā)光免疫分析方法，用于檢測蔬菜和水果中的三唑磷農藥，其檢出限為0.063 ng／mL，線性范圍為0.04～5.00 ng／mL，加標回收率為67%～122%。Chen 等［18］建立了化學發(fā)光免疫分析法，用于檢測蔬菜中的敵敵畏，其線性范圍為5～8 000 ng／L，檢出限為0.42 ng／L，檢測速度比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫分析快。

（2）國內研究進展。陳文梅等［19］以甲基對硫磷分子為識別載體，利用甲基對硫磷–過氧化氫–魯米諾發(fā)光體系，建立了流動注射化學發(fā)光分析法。該方法對甲基對硫磷測定具有專一性，甲基對硫磷的濃度在0.08～60 μmol／L 范圍內具有良好的線性關系，相關系數(shù)為0.996 9，檢出限為0.034 μmol／L。鄒如冰［20］發(fā)現(xiàn)了一種能同時識別殺螟硫磷、甲基對硫磷和對硫磷的特異性寬譜單克隆抗體，在此基礎上建立了化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法。該方法能同時測定上述3 種有機磷農藥，比較了間接、直接2 種競爭反應模式，確立了最優(yōu)檢測條件。結果表明，直接競爭法檢測對硫磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷的IC50分別為5.43、1.34、1.24 μg／kg，線性范圍分別為0.39～100、0.10～25、0.10～25 μg／kg；間接競爭法檢測對硫磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷的IC50分別為5.57、2.30、2.62 μg／kg，線性范圍分別為0.39～100、0.39～25、0.39～25 μg／kg，所建方法滿足農產品中上述3 種農藥殘留的測定要求。

鄧浩等［21］建立了化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法用于檢測蔬菜中的對硫磷，IC50為1.14 μg／L，線性范圍為0.24～15.83 μg／L，檢出限為0.09 μg／L，加標回收率為74.6%～121.0%。楊麗華等［22］建立了化學發(fā)光免疫分析法，用于檢測農產品中的三唑磷，線性范圍為0.16～20 ng／mL，檢出限為0.489 ng／mL，該方法與氣相色譜–質譜聯(lián)用法測定結果基本一致。歐陽輝［23］建立了一種動力學分辨免疫分析新方法，可分別在0.6、1 000 s 時收集兩種待檢物的CL信號，用該方法測定吡蟲啉和甲基對硫磷，線性范圍均為1.0～500 ng／mL，檢出限均為0.33 ng／mL。李明潔［24］基于辣根過氧化物酶–魯米諾–過氧化氫化學發(fā)光體系，建立了測定甲萘威的化學發(fā)光免疫分析法，檢出限為0.25 μg／L，線性范圍為0.25～310.3 μg／L，IC50為3.48 μg／L，用該方法對西紅柿、蘋果、柑橘樣品進行測定，加標回收率為80.0%～107.0%。程燕［25］建立了一種測定農產品中毒死婢的化學發(fā)光免疫分析法，結果表明，該方法比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫法線性范圍更寬，靈敏度更高。單云等［26］在抗原上標記石墨烯，建立了電化學發(fā)光免疫分析法測定蔬菜樣品中的噻蟲啉，方法檢出限為0.05 mg／kg，線性范圍為0.1～10 pg／mL。

4 結語與展望

近年來，化學發(fā)光免疫分析技術發(fā)展迅速，以其獨特的優(yōu)勢在食品安全等領域得到了廣泛的應用，但在應用中同樣存在不足，諸如儀器體積龐大、樣品基質干擾大、測定小分子物質精密度低等。為了進一步發(fā)展該技術，今后的研究方向應集中在以下幾個方面：①儀器向微型便捷化發(fā)展；②樣品前處理技術應更加高效，降低基質干擾，提高方法的穩(wěn)定性；③提高檢測效率，促進CLIA 技術向多組分檢測發(fā)展；④發(fā)展CLIA 與其它如磁性熒光材料、量子點和多色熒光微球等新型技術的聯(lián)用技術，進一步擴大應用范圍。