王娜娜，駱嵩，李理，錢偉東

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，安徽蚌埠233004

腦卒中是一種常見的疾病，在世界范圍內(nèi)致殘率高，并已成為中國發(fā)病率和病死率的第一大原因［1］。腦梗死（IS）后常規(guī)進(jìn)行抗血小板治療。與阿司匹林相比，氯吡格雷抑制血小板聚集和降低缺血性中風(fēng)風(fēng)險(xiǎn)方面更有效［2］。然而，接受氯吡格雷治療的患者中有一部分患者會(huì)出現(xiàn)缺血性卒中、心肌梗死或其他血管事件，說明出現(xiàn)了血小板凝集抑制的失敗，被稱為氯吡格雷抵抗性（CR）或血小板高反應(yīng) 性（HTPR）［3-5］。國 內(nèi) 外 已 有 多 項(xiàng) 研 究 證 實(shí)，CYP2C19基因突變與氯吡格雷耐藥相關(guān)［6-7］。目前研究多集中于CYP2C19基因多態(tài)性在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者的發(fā)病及抗血小板治療的二級(jí)預(yù)防上，與急性缺血性卒中相關(guān)性研究較少。我們探討了急性腦梗死患者CYP2C19基因多態(tài)性分布及與急性腦梗死病情的關(guān)系，對(duì)于患者個(gè)體化選擇抗血小板藥物達(dá)到更好的臨床治療效果及改善預(yù)后具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2019年10月—2021年3月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性腦梗死患者224例，均符合缺血性卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)，男125例（55.80%）、女99例（44.20%），年齡（65.54±11.50）歲；其中吸煙（連續(xù)3個(gè)月至少＞5支/d）23例（10.27%），飲酒（＞15 g/d）20例（8.93%），高血壓144例（64.29%）、糖尿病79例（35.27%），尿酸（290.10±94.23）μmmol/L。入院 時(shí)NIHSS評(píng)分（4.06±3.97）分。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國急性缺血性卒中診治指南2018》［8］的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②入組的急性腦梗死患者均在發(fā)病2 d內(nèi)入院治療；③相關(guān)檢查得到患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝腎功能嚴(yán)重?fù)p傷、嚴(yán)重感染性疾病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤；②白細(xì)胞計(jì)數(shù)或血小板計(jì)數(shù)異常；③有出現(xiàn)活動(dòng)性出血，如消化性潰瘍、顱內(nèi)出血；④出現(xiàn)心房顫動(dòng)、心臟瓣膜病變、短期內(nèi)心肌梗死、室壁瘤形成等可能引起心源性栓塞疾病的情況；⑤沒有得到患者及家屬知情同意。本研究得到蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的同意和批準(zhǔn)。根據(jù)患者NI?HSS評(píng)分分為輕度卒中（NIHSS≤5分）組135例、中重度卒中（NIHSS＞5分）［9-10］組89例。中重度卒中組、輕 度 卒中 組 尿酸 分別為（271.7±92.91）、（302.2±93.47）μmol/L，NIHSS評(píng) 分 分 別 為（8.07±3.18）、（1.41±1.40）分，兩組比較，P均＜0.05。根據(jù)患者入院7 d內(nèi)病情是否進(jìn)展分為進(jìn)展組（患者發(fā)病第7天的NIHSS評(píng)分與治療前相比增加了≥3分）95例、非進(jìn)展組（治療后神經(jīng)功能缺損不再發(fā)展、降低或NIHSS評(píng)分增加＜3分）129例［11］。進(jìn)展組、非進(jìn)展組尿酸分別為（273.39±93.56）、（302.40±93.18）μmol/L，NIHSS評(píng) 分 分 別 為（7.77±3.29）、（1.33±1.36）分，兩組比較，P均＜0.05。輕度與中重度腦卒中組之間及非進(jìn)展組與進(jìn)展組之間性別、年齡、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病等比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 CYP2C19基因型分析采取熒光PCR法確定DNA樣本的基因型。治療前收集患者空腹靜脈血2 mL，放入EDTA抗凝管中，并在4℃的冰箱中存儲(chǔ)，然后用DNA提取試劑盒（推薦使用武漢海吉力生物科技有限公司核酸提取試劑：鄂漢械備20160040號(hào)）提取DNA樣本，用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和DNA質(zhì)量，DNA濃度要求≥10 ng/μL，DNA的質(zhì)量OD260/280在1.6～2.1。將符合要求的DNA用TE（pH 8.0）稀釋到0.1～20 ng/μL；再對(duì)從人外周血細(xì)胞中提取的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)，即對(duì)不同基因位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)野生型和突變型ARMS引物和Taqman-MGB探針，結(jié)合PCR定量反應(yīng)，一次性在一條6聯(lián)PCR反應(yīng)條上實(shí)現(xiàn)對(duì)CYP2C19*1、CYP2C19*2、CYP2C19*3、CYP2C19*17基因常見的4種基因多態(tài)性檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 急性腦梗死患者CYP2C19基因型分布情況224例急性腦梗死患者中，有6個(gè)CYP2C19基因型被發(fā)現(xiàn)（*1/*1）、（*1/*2）、（*1/*3）、（*2/*2）（*2/*3）、（*3/*3），未檢測(cè)出（*1/*17）。CYP2C19*1基因突變204例，CYP2C19*2基因突變19例，CYP2C19*3基因突變1例。根據(jù)基因型確定表型，EM型100例、IM型104例、PM型20例；等位基因頻率分別為44.64%、46.43%、8.94%。

2.2 不同病情急性腦梗死患者CYP2C19基因型分布比較中重度卒中組EM、IM、PM型分別為30（33.71%）、47（52.81%）、12例（13.84%）；輕度卒中組分別為70（51.85%）、57（42.22%）、8例（5.93%）。中重度卒中組EM型所占比例低于輕度卒中組，而IM型及PM型所占比例高于輕度卒中組（χ2=15.53，P＜0.01）。進(jìn) 展 組EM、IM、PM型 分 別 為32（33.68%）、49（51.58%）、14例（14.74%）；非進(jìn)展組EM、IM、PM型分別為68（52.17%）、55（42.64%）、6例（4.65%）。進(jìn)展組EM型所占比例低于非進(jìn)展組，而IM型及PM型所占比例高于非進(jìn)展組（χ2=15.88，P＜0.01）。

3 討論

氯吡格雷是噻吩吡啶的前藥，需要通過細(xì)胞色素P450（CYP）依賴途徑在肝細(xì)胞內(nèi)兩步酶促活化，活性代謝產(chǎn)物與P2Y12受體的不可逆結(jié)合阻止ADP通過這種途徑激活血小板，從而抑制血小板激活，實(shí)現(xiàn)抗血小板作用［12］。在這過程中CYP2C19酶起著關(guān)鍵決定因素。CYP2C19中的遺傳多態(tài)性被分為幾類，并被稱為等位基因。初步鑒定的等位基因包括CYP2C19*1、*2、*3、*4、*5、*6、*7或*8等36個(gè)等位基因，其中對(duì)氯吡格雷影響最大的是*2/*3突變位點(diǎn)（弱代謝產(chǎn)物）和*17突變位點(diǎn)（強(qiáng)代謝產(chǎn)物）［13］。在本研究中224例急性腦梗死患者中，有6個(gè)CYP2C19基因型被發(fā)現(xiàn)（*1/*1）、（*1/*2）、（*1/*3）、（*2/*2）（*2/*3）、（*3/*3），未檢測(cè)出（*1/*17），頻率較高的是CYP2C19*1（91.07%），而CYP2C19*2和CYP2C19*3較少發(fā)生（分別為8.48%和0.45%）。根據(jù)基因型確定表型，EM型（100例）、IM型（104例）、PM型（20例）等位基因頻率分別為44.64%、46.43%、8.94%。所以急性腦梗死患者攜帶基因型以EM型（快代謝者）和IM型（中代謝者）為主。研究表明，攜帶IM型患者的血小板抑制率小于EM型而大于PM型［14］，CYP2C19多態(tài)性被認(rèn)為與氯吡格雷抵抗相關(guān)，不同基因型的個(gè)體氯吡格雷代謝不同，進(jìn)而產(chǎn)生不同的臨床結(jié)果。

研究報(bào)道，CYP2C19多態(tài)性在種族間存在廣泛的變異性。與白色人群和黑人人群相比，亞洲人群攜帶CYP2C19 LOF變異等位基因（CYP2C19*2和*3）的患病率更高。另一方面，與白人人群（18.0%）相比，亞洲人群（4.0%）中CYP2C19 GOF變異等位基因（CYP2C19*17）攜帶者的患病率低［15］。研究發(fā)現(xiàn)CYP2C19基因中LOF等位基因的存在與氯吡格雷代謝減少及其活性代謝物生成減少有關(guān)，這反過來導(dǎo)致抗血小板作用降低，并因此增加動(dòng)脈粥樣硬化血栓事件的風(fēng)險(xiǎn)［16］。研究表明，CYP2C19*2和CYP2C19*3（LOF）是冠狀動(dòng)脈性心臟病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，攜帶LOF基因的患者發(fā)生血栓栓塞事件概率較高［17］。CYP2C19 LOF突變也增加了經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療后主要心血管不良事件的發(fā)生率［18］。CHANCE亞組分析和隨后的薈萃分析表明，CYP2C19 LOF的存在與氯吡格雷在治療急性缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作中的療效下降有關(guān)［17，19］。因此有必要采用個(gè)體化抗血小板治療來克服氯吡格雷在CYP2C19 LOF等位基因患者中藥效明顯降低的作用，對(duì)于減少心腦血管不良事件及抗血小板治療的管理具有指導(dǎo)意義。在本研究中，CYP2C19*2和CYP2C19*3的 攜 帶 率 為8.48%和0.45%；中重度卒中組EM型（33.71%）所占比例低于 輕 度 卒 中 組，而IM型（52.81%）及PM型（13.48%）所占比例高于輕度卒中組；進(jìn)展組EM型（33.68%）所占比例低于非進(jìn)展組，而IM型（52.81%）及PM型（14.74%）所占比例高于非進(jìn)展組，即攜帶基因EM型患者病情較輕及不傾向于進(jìn)展，攜帶IM型和PM型患者病情較重、傾向于進(jìn)展。所以CYP2C19基因多態(tài)性可能與急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度和病情進(jìn)展相關(guān)，可通過檢測(cè)腦梗死患者的CYP2C19的基因分型，個(gè)體化選擇抗血小板藥物進(jìn)而達(dá)到最佳療效。

大量研究表明，攜帶CYP2C19 LOF基因患者的臨床預(yù)后比沒有CYP2C19 LOF的患者差，他們更容易發(fā)生血管不良事件［20］。FRIEDMAN等［21］研究結(jié)果顯示，基因型引導(dǎo)的雙抗血小板治療可使美國人口血管不良事件風(fēng)險(xiǎn)降低約30%，且出血傾向風(fēng)險(xiǎn)更低。ZHANG等［22］研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C19*2多態(tài)性影響冠心病患者的預(yù)后。此外，使用基因型引導(dǎo)的抗血小板治療可改善經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療患者的預(yù)后［23］。在接受氯吡格雷治療的急性缺血性卒中或短暫性腦缺血發(fā)作患者中，那些攜帶CYP2C19 LOF并接受治療的患者與未患中風(fēng)和復(fù)合血管事件的患者相比，患中風(fēng)和復(fù)合血管事件的風(fēng)險(xiǎn)更高，CYP2C19 LOF的存在使氯吡格雷的療效降低了20%［17］。以上說明CYP2C19基因型指導(dǎo)治療可降低缺血性卒中的復(fù)發(fā)率。因此，在開始氯吡格雷治療之前，需要評(píng)估急性腦梗死患者的臨床風(fēng)險(xiǎn)，以確定患者是否代謝不良?；驒z測(cè)對(duì)于那些被認(rèn)為有中度或高度不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)的急性腦梗死患者至關(guān)重要。所以對(duì)于病情較重和腦梗死進(jìn)展患者應(yīng)進(jìn)行CYP2C19基因型檢測(cè)，進(jìn)而合理調(diào)整抗血小板藥物，如增加藥物劑量、聯(lián)合用藥或使用新型的抗血小板藥物，對(duì)防止患者病情進(jìn)一步加重進(jìn)而達(dá)到更好的臨床效果及改善預(yù)后具有重要意義。

綜上所述，急性腦梗死患者攜帶基因型以EM型和IM型為主。急性腦梗死患者CYP2C19基因多態(tài)性可能與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)。所以在臨床上有必要根據(jù)CYP2C19代謝產(chǎn)物狀態(tài)調(diào)整抗血小板治療方案，對(duì)于腦梗死患者達(dá)到最佳療效及防止疾病復(fù)發(fā)具有重要意義。該研究的樣本量相對(duì)較小，有必要增加樣本量進(jìn)一步研究其臨床意義。