董思圳，秦 風(fēng)，賈文敬，李 歡，董宛阡，李 林，黃建忠，舒正玉

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 工業(yè)微生物發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 福州 350108)

介孔材料是指孔徑介于2～50 nm之間的多孔材料，按其化學(xué)成分可分為介孔硅(如介孔SBA-15)、介孔金屬氧化物(如介孔氧化鐵，介孔氧化鉛)[1]、介孔金屬硫化物(如硫化鍺)[2]、介孔碳(如碳分子篩)[3]和介孔聚合物(如三嵌段共聚物FDU-15、FDU-16)[4]等。介孔材料表面可攜帶各種官能團(tuán)，用于固定不同功能的活性分子。其中，介孔二氧化硅載體由于具有低毒、低成本、生物相容性好、化學(xué)惰性和熱穩(wěn)定性優(yōu)良等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于藥物載體、酶載體等領(lǐng)域。近年來，不同形狀、孔徑、粒徑、比表面積、疏水性及攜帶多種功能基團(tuán)的各種介孔二氧化硅載體相繼被制備出來，并表現(xiàn)出優(yōu)良的性能。

綠色催化工藝被廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)能源、手性藥物、可降解高分子材料合成等領(lǐng)域，催生了對各種固定化酶制劑的需求。為開發(fā)操作穩(wěn)定性好、催化效率高的固定化酶制劑，科研工作者進(jìn)行了大量的嘗試，選擇各種材料作為酶蛋白載體，包括早期的大孔樹脂、硅藻土到現(xiàn)在的各種納米材料等，其中，介孔二氧化硅是應(yīng)用較為成功的載體之一。截至目前，介孔二氧化硅已成功應(yīng)用于水解酶、氧化還原酶等酶蛋白的固定化，并展現(xiàn)出優(yōu)良的催化性能。

1 介孔二氧化硅載體對酶蛋白的固定化效果

1.1 介孔二氧化硅固定化水解酶

包括脂肪酶(lipase,EC 3.1.1.3)、蛋白酶(protease,EC 3.4.21.112)、各種糖苷酶(EC 3.2.1.24)等在內(nèi)的水解酶(hydrolase,EC 3)家族的酶蛋白，是最早成功應(yīng)用于工業(yè)化催化生產(chǎn)、最早實(shí)現(xiàn)商業(yè)化制備的酶蛋白。水解酶能在生物柴油、燃料乙醇等生物質(zhì)能源、手性藥物的綠色合成及精細(xì)化工等領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模的應(yīng)用，并表現(xiàn)出優(yōu)良的催化性能，其重要因素是各類固定化酶制劑的成功開發(fā)。Díaz 等[5]通過物理吸附首次將木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和細(xì)胞色素C固定在孔徑為4.0 nm的介孔二氧化硅MCM-41上。分子量較大的化合物，如聚-L-賴氨酸能顯著抑制游離胰蛋白酶水解N-α-苯甲?；?DL-精氨酸-4-硝基苯胺的催化活性，殘留酶活僅為15%；但在相同條件下，固定化胰蛋白酶的殘留酶活高達(dá)68%。Jiang等[6]以單寧酸為造孔劑調(diào)整孔徑大小，制備了平均孔徑為(195±16) nm的介孔二氧化硅，并通過物理吸附固定伯克霍爾德菌脂肪酶Lip A，該固定化脂肪酶表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性(70 ℃仍能保持90%以上的殘留酶活)和廣譜有機(jī)溶劑耐受性(對甲醇、乙醇、異辛烷、正己烷和四氫呋喃均表現(xiàn)出良好的耐受性)，能催化生物柴油的合成，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到92%。Palanivelu等[7]利用介孔二氧化硅SBA-15吸附乙酰膽堿酯酶(AChE)后，進(jìn)一步用戊二醛進(jìn)行交聯(lián)，固定化乙酰膽堿酯酶作為生物傳感器用于檢測農(nóng)藥殘留。結(jié)果表明，SBA-15固定化乙酰膽堿酯酶穩(wěn)定性顯著提高，達(dá)到60 d以上。Sannino等[8]利用三乙氧基硅丙基異氰酸酯將β-葡萄糖苷酶共價錨定到介孔二氧化硅納米材料上，固定化β-葡萄糖苷酶較游離酶的熱穩(wěn)定性提高了20 ℃。

為了方便固定化酶制劑的回收，越來越多的磁性介孔二氧化硅應(yīng)用于水解酶的固定化。Poorakbar等[9]將纖維素酶共價固定到自制的磁性金介孔二氧化硅納米核殼(mAu@PSNs)上，通過紅外光譜證實(shí)了纖維素酶與mAu@PSNs成功結(jié)合，Bradford法測定蛋白質(zhì)結(jié)合率為76%；以Whatman濾紙為底物，該固定化酶在9 h后仍能保持58%的初始活性。Ali等[10]制備了中孔(20～50 nm)介孔二氧化硅磁性材料，并用于固定皺褶假絲酵母脂肪酶，中孔介孔二氧化硅的載酶量可達(dá)797 mg·g-1，比活力高達(dá)1 503 U·g-1。

此外，一些高分子材料也被應(yīng)用于介孔二氧化硅載體的修飾。?zbek等[11]通過原位聚合技術(shù)將丙烯酸和殼聚糖混合物包被介孔二氧化硅，制備出高分子聚合物包被的介孔二氧化硅納米材料，并成功應(yīng)用于枯草桿菌蛋白酶的固定化。相對于游離酶，固定化蛋白酶的熱穩(wěn)定性提高了10 ℃。Xiang等[12]制備了殼聚糖包被的介孔二氧化硅SBA-15復(fù)合材料，并用于固定豬胰脂肪酶，結(jié)果表明，相對于未用殼聚糖修飾的介孔二氧化硅SBA-15，復(fù)合材料的載酶量提高了20%，比活力提高了70%。

1.2 介孔二氧化硅固定化氧化還原酶

在高分子材料的綠色合成、環(huán)境污染物的生物降解、生物燃料電池的制造、醫(yī)學(xué)組織工程和生物傳感器的開發(fā)等領(lǐng)域，常常涉及到氧化還原酶介導(dǎo)的各種氧化還原反應(yīng)。在利用介孔二氧化硅固定氧化還原酶的實(shí)例中，葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)和辣根過氧化物酶(EC 11.1.7)常作為模式氧化還原酶，以評價固定化效果。Pitzalis等[13]制備了有序介孔二氧化硅，并用于葡萄糖氧化酶/辣根過氧化物酶的共固定化。在該雙酶共固定化體系催化的偶聯(lián)反應(yīng)中，氧化咖啡酸和阿魏酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%。Lei等[14]使用一種樹突狀介孔二氧化硅材料固定辣根過氧化物酶。與商用ELISA試劑盒相比，固定化辣根過氧化物酶的血清檢測靈敏度提高了2 000倍。Escuin等[15]使用一系列的介孔二氧化硅納米材料(SBA-15、SBA-3和MCM-48)固定多酚氧化酶。結(jié)果表明，所有固定化材料的載酶量均在pH值為4時達(dá)到最高(100 mg·g-1以上)，其中SBA-15更高達(dá)320 mg·g-1。

1.3 介孔二氧化硅固定化其它酶

除了水解酶和氧化還原酶，介孔二氧化硅也可作為其它酶蛋白的固定化載體。G?βl等[16]制備了一種大顆粒(直徑100 nm)中孔(7 nm)介孔二氧化硅，并應(yīng)用于碳酸酐酶和辣根過氧化物酶的固定化。兩種固定化酶制劑分別催化2-甲氧基酚顯色反應(yīng)和4-硝基苯乙酸酯水解反應(yīng)，均表現(xiàn)出優(yōu)良活性。Nara等[17]通過物理吸附將嗜熱地衣芽孢桿菌丙氨酸消旋酶固定到中孔(4.0～8.5 nm)介孔二氧化硅上，固定化酶表現(xiàn)出更高的熱穩(wěn)定性(游離酶80 ℃下活性半衰期為20 min，固定化酶為60 min)和高效的重復(fù)利用性(重復(fù)使用5次后仍可保持50%的殘留酶活)。

2 影響介孔二氧化硅載體固定化酶蛋白效果的因素

2.1 孔徑與粒徑

介孔二氧化硅材料的基本性質(zhì)是影響其固定化效果的關(guān)鍵因素，其中孔徑、粒徑、比表面積等因素對載酶量起決定性作用。通常認(rèn)為，介孔二氧化硅載體的孔徑應(yīng)稍大于酶蛋白的直徑。在相同孔徑的情況下，粒徑越大則越容易造成孔隙塌陷，粒徑越小則孔隙越少即孔隙率越低。一個理想的固定化酶介孔材料需要在載酶量、孔徑和孔隙率之間找到一個平衡點(diǎn)。Kalantari等[18]制備了可調(diào)節(jié)孔徑(1.6～13.0 nm)的介孔二氧化硅材料，并應(yīng)用于固定假絲酵母脂肪酶，載酶量達(dá)711 mg·g-1；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，提高載體的疏水性，有助于提高固定化脂肪酶的催化活性。

2.2 有序介孔和無序介孔

有序介孔二氧化硅的制備主要利用特定類型的有機(jī)硅前驅(qū)體和結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑(如兩親性表面活性劑和生物大分子)的自組裝。無序介孔材料的制備方法通常分為兩種：在有序介孔材料的孔隙中接枝功能基團(tuán)或者在制備介孔材料時直接加入有機(jī)溶劑(如1,3,5-三甲苯)，以達(dá)到擴(kuò)寬部分區(qū)域孔徑的目的。有序介孔材料簡單易制備，孔徑分布規(guī)則均勻適合單酶固定；無序介孔材料雖然復(fù)雜但可調(diào)節(jié)的因素更多，應(yīng)用更加廣泛。Califano等[19]制備了一種中心徑向孔分層結(jié)構(gòu)的介孔二氧化硅材料，并應(yīng)用于固定β-葡萄糖苷酶，固定化β-葡萄糖苷酶顯著提高了酶對底物的親和性(游離酶km=5.4 mmol·L-1，固定化β-葡萄糖苷酶km=4.3 mmol·L-1)。Tahmasbi 等[20]先用四乙氧基硅烷(TEOS)和溴代十六烷基三甲胺(CTAB)制備了介孔二氧化硅，再用3-氨基丙基三乙氧基硅烷進(jìn)行功能化修飾并接枝，最終獲得的介孔二氧化硅平均粒徑小于100 nm，并利用該材料固定脫氧核糖核酸酶、凝固酶和α-淀粉酶。結(jié)果表明，固定化酶具有抗革蘭氏陽性菌(枯草桿菌和金黃色葡萄球菌)和革蘭氏陰性菌(大腸桿菌和銅綠假單胞菌)的功能。

2.3 表面化學(xué)修飾

對介孔二氧化硅材料表面進(jìn)行化學(xué)修飾，豐富載體表面基團(tuán)的類型，有助于提高其作為固定化載體的載酶量，優(yōu)化固定化酶制劑的性能。Harmoko等[21]制備了乙?；揎椀慕榭锥趸杓{米材料，并應(yīng)用于纖維素酶的固定化，固定化纖維素酶的酶活提高了56倍。Gao等[22]制備了經(jīng)多巴胺修飾的介孔二氧化硅納米材料，并應(yīng)用于念珠菌脂肪酶的固定化，固定化念珠菌脂肪酶貯存30 d后，殘留酶活仍保持在64%。Ahmadi等[23]使用N-(2-氨乙基)-3-氨丙基三甲氧基硅烷對磁性介孔二氧化硅進(jìn)行功能化修飾得到復(fù)合材料，用于固定α-淀粉酶，利用該固定化酶催化溴苯與苯硼酸的偶聯(lián)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化率提高至98%，且反應(yīng)時間縮短至0.17 h。Mosafa 等[24]利用(3-氯丙基)三甲氧基硅烷修飾二氧化硅包裹的磁性納米粒子得到復(fù)合材料，用于固定木瓜蛋白酶。與游離酶相比，固定化木瓜蛋白酶在處理石榴汁濁度時重復(fù)使用8次后，殘留酶活仍保持在50%以上。

2.4 其它因素

影響介孔二氧化硅載體固定化酶蛋白效果的因素還包括pH值、造孔模板、制備工藝等。Díaz等[5]使用介孔二氧化硅MCM-41對球形酶、細(xì)胞色素C、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行固定化，發(fā)現(xiàn)pH值對載酶量具有顯著影響，pH<7時能顯著提高木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的載酶量；而pH>7時細(xì)胞色素C的載酶量顯著提高。Venezia等[25]以單寧酸為造孔劑制備了改性介孔二氧化硅，并用于固定β-葡萄糖苷酶。游離酶在60 ℃下僅保持55%活性，而固定化β-葡萄糖苷酶在60 ℃下仍保持100%活性。Dai等[26]以菠蘿皮羧甲基纖維素、聚乙二醇和介孔二氧化硅SBA-15為原料，采用反復(fù)凍融法制備了水凝膠復(fù)合材料，并用于固定木瓜蛋白酶。在80 ℃下孵育2 h后，固定化木瓜蛋白酶保留了56%的初始活性，而游離酶僅保留了16%的初始活性；貯存10 d后，固定化木瓜蛋白酶保留了79%的初始活性，而游離酶僅保留了27%的初始活性。

3 結(jié)語

隨著制備工藝的日趨成熟和完善，越來越多新型的介孔二氧化硅材料被開發(fā)出來。如Li等[27]開發(fā)了一種簡便、改進(jìn)的雙相制備方法，通過調(diào)節(jié)表面活性劑和兩親性試劑的濃度及協(xié)同作用，可快速制備出孔徑(6.1～11.4 nm)大小可調(diào)控的、開放的核殼磁性介孔二氧化硅微球。同時，介孔二氧化硅材料表面修飾的化學(xué)基團(tuán)種類也越來越多，其拓展的應(yīng)用領(lǐng)域也必將越來越廣。

作為一種制備簡單、生物相容性和安全性良好、孔徑可控、比表面積大的多孔材料，介孔二氧化硅越來越廣泛地用作各種酶蛋白的固定化載體，并取得較好的應(yīng)用效果。目前，介孔二氧化硅更多地應(yīng)用于單酶固定化，隨著多酶偶聯(lián)催化反應(yīng)的興起及廣泛應(yīng)用，如何實(shí)現(xiàn)多種酶蛋白在介孔二氧化硅表面的有序組裝(或自組裝)依然存在挑戰(zhàn)。